全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Mar．２０１４,３４(２):１７９－１８２　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．３９６９/j．issn．１０００Ｇ３１４２．２０１４．０２．０１０
伍善广,冯学珍,陈颖,等．高效液相色谱法测定金钱菇多糖的单糖组成[J]．广西植物,２０１４,３４(２):１７９－１８２
WuSG,FengXZ,ChenY,etal．AnalysisofmonosaccharidecompositionsofLentinusedodespolysaccharidebyHPLC[J]．Guihaia,２０１４,３４(２):１７９－１８２
高效液相色谱法测定金钱菇多糖的单糖组成
伍善广１,冯学珍１,陈　颖２∗,蒙华琳１,陆　苑１
(１．广西科技大学,广西 柳州５４５００６;２．广东食品药品职业学院,广东 广州５１０５２０)
摘　要:采用高效液相色谱法,测定金钱菇多糖的单糖组成.用超声辅助提取金钱菇多糖,通过１Ｇ苯基Ｇ３Ｇ甲
基Ｇ５Ｇ吡唑酮(PMP)衍生水解后的单糖,高效液相色谱法检测衍生物.结果表明:金钱菇多糖由甘露糖(Man)、
核糖(Rib)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)组成,其摩尔为１．００∶０．９０∶０．９１∶２８．０３∶
１．５８∶０．１１.该方法快速、简便、重现性好,可用于测定金钱菇多糖的单糖组成.
关键词:金钱菇;单糖;柱前衍生化;高效液相色谱法
中图分类号:Q９４６　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１４)０２Ｇ０１７９Ｇ０４
Analysisofmonosaccharidecompositionsof
LentinusedodespolysaccharidebyHPLC
WUShanＧGuang１,FENGXueＧZhen１,CHENYing２∗,
MENGHuaＧLin１,LUYuan１
(１．GuangxiUniversityofScienceandTechnology,Liuzhou５４５００６,China;２．Guangdong
FoodandDrugVocationalCollege,Guangzhou５１０５２０,China)
Abstract:MonosaccharidecompositioninLentinusedodepolysaccharideswasdeterminedbyhighperformanceliquid
chromatography(HPLC)．TheL．edodespolysaccharidewasextractedusingultrasonicＧassistedextraction．MonosacＧ
charidewerederivedby１ＧphenylＧ３ＧmethylＧ５Ｇpyrazolone(PMP)andthePMPderivativesofmonosaccharidewereanＧ
alyzedbyHPLC．TheresultsshowedthatL．edodespolysaccharidewascomposedofmannose,ribose,rhamnose,gluＧ
cose,galactoseandxyloseandtheirmolarratiowasabout１．００∶０．９０∶０．９１∶２８．０３∶１．５８∶０．１１．Themethodwas
rapid,simpleandreproducibleandcouldbeusedtodeterminemonosaccharidecompositionsofL．edodes．
Keywords:Lentinusedodes;monosaccharide;preＧcolumnderivatization;HPLC
　　香菇多糖具有广泛的生理活性,如免疫调节作
用、抗肿瘤、降血脂、抗衰老等作用(李健等,２００５).
金钱菇(Lentinusedodes)是一种幼小型、未开伞的
香菇,具有清香味鲜的独特风味,含有大量的对人体
有益的营养物质,其多糖也具有多种生理活性,如抗
氧化活性等(许春平等,２０１３;党蕾等,２０１０).
活性多糖组成往往比较复杂,对其进行单糖组
成分析,对于进一步确定其结构、深入研究药理作用
具有重要的意义.多糖的单糖组成测定有多种方
法,如薄层色谱法(刘柳等,２００８)、气相色谱法(韩威
等,２０１２)及高效毛细管电泳法(耿越等,２００５;汲晨
锋等,２００６)、高效液相色谱法(马耀宏等,２０１２).薄
层色谱法无需衍生化处理,但灵敏度较低、分离效果
较差、重现性不好,仅适合于多糖的定性分析(饶金
华等,２００７;韩威等,２０１２).因为多糖本身没有足够
的挥发性、热稳定性较低,所以采用气相色谱法需对
收稿日期:２０１３Ｇ１１Ｇ２８　　修回日期:２０１４Ｇ０２Ｇ１２
基金项目:广西教育厅(高等学校特色专业及课程一体化建设)项目(药学GXTSZY２８６)
作者简介:伍善广(１９７４Ｇ),男,博士,副教授,主要研究方向为药物新剂型与新技术,(EＧmail)５１０２４２２２７＠qq．com.
∗通讯作者:陈颖,硕士,实验师,研究方向为天然活性组分分离、药物新剂型研究,(EＧmail)chenying９６＠gmail．com.
其衍生化后才能测定,且容易出现色谱峰异构化裂
分,对糖醛酸和氨基糖的分析也不大适合(饶金华
等,２００７;宋叶涵等,２０１２).高效毛细管电泳法多用
于分析单糖及寡糖,而对于中性多糖的分离则比较
困难(张丽芝等,２０１３).采用配备示差折光检测器
(RI)或蒸发光散射检测器(ELSD)的高效液相色谱
可以分析未经衍生化的单糖,但RI分辨率较低(郭
守军等,２０１０),而ELSD价格昂贵、难以普及(颜军
等,２００６).对单糖进行衍生化后,采用高效液相色
谱Ｇ紫外检测器的检测方法可以获得较高的灵敏度
(Youetal．,２００９).最常用单糖衍生化试剂是１Ｇ苯
基Ｇ３Ｇ甲基Ｇ５Ｇ吡唑酮(PMP),具有反应条件温和、无
需酸催化、无去唾液酸作用、不产生异构化等特点
(Hondaetal．,２００３;Zhangetal．,２００３),广泛应用
于单糖组成分析(付海宁等,２００８;孙莲等,２０１０;
Youetal．,２００９;Hsuetal．,２０１３).
本研究采用超声波辅助提取金钱菇多糖,以１Ｇ
苯基Ｇ３Ｇ甲基Ｇ５Ｇ吡唑酮(PMP)为衍生剂,采用柱前衍
生高效液相色谱法测定金钱菇多糖的单糖组成,为
深入研究金钱菇多糖提供参考.
１　材料与方法
１．１材料、试剂与仪器
金钱菇,广西平南县红心食品有限公司,粉碎、
过筛后置于干燥器中备用.
单糖标准品:葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)、半乳
糖(Gal)、鼠李糖(Rha)、木糖(Xyl)、核糖(Rib),均
购自国药集团化学试剂有限公司;三氟乙酸(TFA)
(AR)、１Ｇ苯基Ｇ３Ｇ甲基Ｇ５Ｇ吡唑酮(PMP)(AR),国药
集团化学试剂有限公司;磷酸二氢钠(AR)、磷酸氢
二钠(AR),汕头西陇化工有限公司;甲醇(色谱纯)、
乙腈(色谱纯),Fisher公司.其他试剂为分析纯.
Agilent１２６０型高效液相色谱仪(美国Agilent
公司);AgilentEclipseXDBＧC１８色谱柱(１５０mm×
４．６mm,５μm)(美国Agilent公司);TUＧ１９０１双光
束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责
任公司);DLＧ１８０J智能超声清洗器,上海之信仪器
有限公司.
１．２色谱条件
色谱柱:AgilentEclipseXDBＧC１８色谱柱 (１５０
mm×４．６mm,５μm);流动相A为０．０２mol/L磷
酸盐缓冲溶液(pH６．０),流动相B为乙腈;洗脱梯
度(０min,０％B;１０min,１８％B;２０min,２５％B);
柱温:３０℃;流速１．０mL/min;检测波长:２５０nm.
１．３金钱菇多糖的提取
称取金钱菇５．０g,加入一定体积的９５％乙醇,
浸泡１２h后过滤,取滤渣风干.加入５０倍体积的
水,于７０℃超声波提取４０min.将提取液静止一
定时间后,于１００００r/min离心,取上清液浓缩后
加９５％乙醇.置于４℃冰箱,过夜后离心、干燥即
得金钱菇粗多糖.
粗多糖中可能含有少量蛋白质,可以采用蛋白
酶将其水解除去.方法如下:取金钱菇多糖溶液,加
入１．０％的胃蛋白酶,５０℃、pH６．５条件下水解.水
解２h后,沸水浴灭酶５min.将灭酶后溶液５０００
r/min离心,取上清液加９５％,４℃冰箱静止１２h,
离心后取沉淀,干燥即得金钱菇多糖样品.
１．４溶液的配制
单糖标准品溶液配制:分别称取一定量单糖标
准品配制成０．０５mmol/mL水溶液.单糖混合标准
品溶液:各取等体积的６种单糖标准溶液混合均匀.
金钱菇多糖样品溶液制备:称取一定量的１．３
项所得金钱菇多糖,置于具塞试管中,加入２mol/L
的三氟乙酸(TFA)２mL,封管后于１１０℃水解.２
h后取出,冷却、离心,上清液用NaOH调pH值至
７．０,定容至５mL,备用.
１．５衍生化产物的制备
标准单糖混合物的衍生:量取１００μL单糖混合
标准品溶液置于离心管中,加入１００μL０．５mol/L
PMPＧ甲醇溶液及０．３mol/LNaOH溶液,涡旋混合
１min,于７０℃水浴衍生化反应３０min,冷却至室温
后先用１００μL０．３mol/LHCl溶液中和,再用氯仿
２mL萃取３次,合并水层,０．４５μm 微孔膜过滤后,
备用.
金钱菇多糖水解产物的衍生:将金钱菇多糖水
解产物按上述方法进行衍生化处理.
１．６标准曲线的绘制及方法学考察
按１．２的色谱条件,将不同量的单糖标准溶液衍
生产物进样,记录色谱图,制作单糖标准曲线方程.
单糖标准溶液衍生产物,重复进样５次,以考察
方法的精密度.分别取金钱菇多糖样品溶液５份,
按衍生化方法衍生后进样,以考察方法的重复性.
将衍生化后单糖混合标准液及金钱菇多糖溶液放置
于４℃冰箱储存,于１２h内每隔２h取出后进样,
以考察样品的稳定性.
０８１ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
精密量取己知各单糖含量的金钱菇多糖水解液
４mL,加入单糖标准品溶液１mL(含６种单糖浓度
均为１０．０mg/mL).混合均匀后,取１００μL进行
衍生化.用标准曲线法计算回收率.
２　结果与分析
２．１单糖标准图谱及方法学考察
由图１可知,６种单糖混合标准液衍生物在色
谱条件下可以实现较好地分离.根据峰面积对应的
各单糖标准品的进样量进行线性回归,结果见表１.
由表１可知,所测定的６种单糖标准品的峰面积与
进样量呈良好的线性关系,相关系数R２在０．９９４５~
０．９９８３之间;衍生化的单糖标准品溶液在重复进样
５次的情况下,RSD在１．０４％~２．８３％之间(n＝
５),表明测定方法的精密度良好.
图１　６种单糖标准品混合物的高效液相色谱图
１．甘露糖;２．核糖;３．鼠李糖;４．葡萄糖;５．半乳糖;６．木糖.
Fig．１　HPLCchromatogramsofmixtureof
sixstandardmonosaccharide
１．Man;２．Rib;３．Rha;４．Glc;５．Gal;６．Xyl．
　　连续取５份金钱菇多糖溶液衍生后进样,各峰
面积的RSD为２．８２％(n＝５),表明测定方法有较好
重复性.稳定性试验表明,衍生化后的单糖混合标
准液及金钱菇多糖溶液的RSD分别为１．７５％(n＝
５)、２．８１％(n＝５),表明衍生化样品在１２h内稳定.
由表２可知,甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳
糖、木糖的平均回收率分别为９７．３８％(RSD２．０３％)、
９６．５０ ％ (RSD１．８５％)、９６．８４％ (RSD１．１６％)、
９７．６２％(RSD１．９９％)、９７．２２％(RSD１．０５％)、９８．００
％ (RSD２．７８％),表明方法的精密度好.
２．２金钱菇多糖的单糖组成分析
将１．４项制备得到的衍生化样品溶液按１．２项
表１　６种单糖的标准曲线方程
Table１　Calibrationcurvesofsixmonosaccharides
单糖
Monosaccharide
线性回归方程
Equationoflinear
regression
相关
系数
R２
线性范围
linearrange
(μg)
相对偏差
RSD(n＝５)
(％)
甘露糖 Man Y＝４８１３．５x＋
３２８．６９
０．９９８３ ０．２３１~２．３１ １．５７
核糖 Rib Y＝３７９８．２x＋
２２２．４７
０．９９７４ ０．１９２~１．９２ ２．２３
鼠李糖 Rha Y＝４８２３．６x＋
３３７．５
０．９９７２ ０．２３４~２．３４ １．７１
葡萄糖 Glc Y＝２７９７．４x＋
９４．４７３
０．９９４５ ０．２５４~２．５４ １．０４
半乳糖 Gal Y＝３５１７．４x＋
２３３．９
０．９９７８ ０．２３１~２．３１ ２．８３
木糖 Xyl Y＝４３０５．５x＋
２０８．２４
０．９９８０ ０．１９２~１．９２ １．８２
表２　回收率测定结果
Table２　Resultsofrecoverytest
单糖标准品 甘露糖
Man
核糖
Rib
鼠李糖
Rha
葡萄糖
Glc
半乳糖
Gal
木糖
Xyl
加入量 １０ １０ １０ １０ １０ １０
Addition(mg) ９．４７ ９．７７ ９．８１ ９．６２ ９．７９ ９．９７
９．６３ ９．５８ ９．７６ ９．９１ ９．６４ ９．４８
测得量 ９．９６ ９．５２ ９．７１ ９．５０ ９．８５ ９．５６
Measured ９．７４ ９．９０ ９．５４ ９．８３ ９．７３ ９．８７
amount(mg) ９．８９ ９．４８ ９．６０ ９．９５ ９．６０ １０．１２
平均回收率
Averagerecovery
rate(％)
９７．３８ ９６．５０ ９６．８４ ９７．６２ ９７．２２ ９８．００
相对偏差 RSD
(n＝５)(％) ２．０３ １．８５ １．１６ １．９９ １．０５ ２．７８
图２　金钱菇多糖高效液相色谱图
１．甘露糖;２．核糖;３．鼠李糖;４．葡萄糖;５．半乳糖;６．木糖.
Fig．２　HPLCchromatogramsofmixtureof
Lentinusedodespolysaccharide
１．Man;２．Rib;３．Rha;４．Glc;５．Gal;６．Xyl．
下色谱条件进样测定,结果见图２.由图２可知,金
钱菇多糖主要由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳
糖、木糖组成,其摩尔为１．００∶０．９０∶０．９１∶２８．０３∶
１．５８∶０．１１,其中葡萄糖含量最高,木糖含量最低.
１８１２期　　　　　　　　　伍善广等:高效液相色谱法测定金钱菇多糖的单糖组成
３　结论
本文采用超声波辅助法提取金钱菇多糖,建立
了柱前衍生化高效液相色谱法测定金钱菇多糖中单
糖组分的方法.金钱菇多糖酸水解后的单糖组分经
PMP衍生化,以常用的紫外检测器和C１８柱分析了
多糖的单糖组成.方法简便快速、准确可靠,可用于
测定金钱菇多糖的单糖组成,也为其他多糖的单糖
组成测定提供参考.
研究结果表明,金钱菇多糖含有甘露糖、核糖、
鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖,其中葡萄糖含量最
高,木糖含量最低.本研究也为进一步开发金钱菇
产品提供了科学依据.
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