全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Mar．２０１４,３４(２):１７４－１７８　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．３９６９/j．issn．１０００Ｇ３１４２．２０１４．０２．００９
刘幼娴,谷陟欣,卢凤来,等．不同采收期裸花紫珠的HPLC指纹图谱研究[J]．广西植物,２０１４,３４(２):１７４－１７８
LiuYX,GuZX,LuFL,etal．EstablishmentofhighperformanceliquidchromatographicfingerprintofCallicarpanudifloraondiferentharvestingtime
[J]．Guihaia,２０１４,３４(２):１７４－１７８
不同采收期裸花紫珠的HPLC指纹图谱研究
刘幼娴１,２,谷陟欣３,卢凤来１,黄　胜３,颜小捷１,李典鹏１∗
(１．广西植物功能物质研究与利用重点实验室,广西植物研究所,广西 桂林５４１００６;
２．广西中医药大学,南宁５３０００１;３．九芝堂股份有限公司,长沙４１００２１)
摘　要:为建立裸花紫珠药材高效液相指纹图谱研究方法,该研究采用０．４％ 磷酸水溶液(A)Ｇ乙腈(B);梯度
洗脱为０~１５min,１６％~２５％B,１５~２５min,２５％~３９．７％B;AgilentZORBAXSBＧC１８色谱柱(４．６mm×
２５０mm,５μm);柱温为３０℃;流速为１mL􀅰minＧ１;进样量为１０μL;检测波长３２７nm;检测时间２５min等色
谱条件,研究了不同采集时间共２５批裸花紫珠药材的指纹图谱,获取１４个共有特征色谱峰,确定了其中的３
个成分,利用相似度分析、主成分分析及对应分析对它们进行了分析.结果表明:HPLC指纹图谱结合计量分
析法可有效评价裸花紫珠的质量,该方法可有效应用到裸花紫珠原料及其制品的质量控制中.
关键词:裸花紫珠;高效液相色谱法;指纹图谱;主成分分析;对应分析
中图分类号:R９１７　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１４)０２Ｇ０１７４Ｇ０５
Establishmentofhighperformanceliquid
chromatographicfingerprintofCalicarpa
nudifloraondifferentharvestingtime
LIUYouＧXian１,２,GUZhiＧXin３,LUFengＧLai１,HUANGSheng３,
YANXiaoＧJie１,LIDianＧPeng１∗
(１．GuangxiKeyLaboratoryofFunctionalPhytochemicalsResearchandUtilization,GuangxiInstituteof
Botany,Guilin５４１００６,China;２．GuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning５３０００１,
China;３．JiuzhitangCO．,Ltd,Changsha４１００２１,China)
Abstract:ThechromatographicfingerprintwasestablishedforevaluatingandcontrolingthequalityofCallicarpa
nudiflora．ThechromatographicanalysiswascarriedoutonaZORBAXSBＧC１８column(２５０mm ×４．５mm,５
μm)．Themobilephasewas０．４％phosphoricacid(A)andacetonitrile(B)withgradientelution(０－１５min,１６％BＧ
２５％B;１５－２５min,２５％BＧ３９．７％B)．Theflowratewasmaintainedat１．０mL􀅰minＧ１．Thedetectionwavelength
wassetat３２７nmandthecolumntemperaturewascontroledat３０℃．Thesampleinjectionvolumewas１０μL．２５
diferentoriginalsampleswereanalyzed,andthechromatographicfingerprintsofC．nudiflorawereconstructedwith
１４fingerprintpeaks,and３maincompoundswereidentified．TheSimilarityEvaluationSystemofChromatographic
FingerprintofTraditionalChineseMedicine(Version２００４A),hierarchicalclusteringanalysis(HCA)andcorresponＧ
denceanalysiswereappliedtoclassifythesamplesaccordingtotheirsources,andsatisfactoryresultswereobtained．
收稿日期:２０１３Ｇ１１Ｇ１８　　修回日期:２０１４Ｇ０２Ｇ０７
基金项目:国家科技支撑计划项目(SQ２０１０BAJY１４１１Ｇ０７Ｇ０５);海南省中药现代化专项(２０１２ZY０２０);广西科技攻关项目(桂科攻１１１０７０１０Ｇ３Ｇ
１０);广西植物功能物质研究与利用重点实验室主任基金(ZRJJ２０１２Ｇ５).
作者简介:刘幼娴(１９８７Ｇ),女,广西贵港人,硕士研究生,主要从事植物资源开发与利用研究,(EＧmail)liuyouxian２０１３＠１２６．com.
∗通讯作者:李典鹏,博士,研究员,主要从事植物活性成分研究与开发,(EＧmail)ldp＠gxib．cn.
Thechromatographicfingerprintcanbeusedtodiferentiatetherawmaterialsfromdiferentsourcesandbeservedas
apowerfultoolforthefurtherqualitycontrolofC．nudiflora．
Keywords:Callicarpanudiflora;highperformanceliquidchromatographic;fingerprint;hierarchicalclusteringanalＧ
ysis;correspondenceanalysis
　　裸花紫珠为马鞭草科植物裸花紫珠(CallicarＧ
panudiflora)的干燥叶和带叶的嫩枝,主产于我国
海南,为海南道地药材,我国广东、广西也有分布.
国外主要分布于印度、越南和马来西亚.其根、叶可
入药,有抗菌止血,消炎解毒,散癖消肿,驱风祛湿之
功效(周桑玉等,２０１０;朱立新等,２００９;万文萃等,
２０１０).裸花紫珠临床主要应用于治疗化脓性炎症、
急性传染性肝炎、呼吸道及消化道出血、创伤出血等
症,外用治烧、烫伤及外伤出血等(刘宏奇等,２０１０;
刘丰等,２００８;彭兵,２００４;廖丽锦等,２００９;孔凤利,
２０１０;陈春等,２０１０;梁纪军等,２００９;陈颖等,２００６).
近年来由裸花紫珠制成的裸花紫珠片、裸花紫珠栓、
裸花紫珠分散片、裸花紫珠胶囊、裸花紫珠软胶囊和
裸花紫珠颗粒等产品在市场日益受到患者的青睐,
其药材也呈现出供不应求的趋势.而紫珠属植物品
种繁多,市场上常出现以假乱真,以次充好的情况,
所以对裸花紫珠进行进一步质量研究是非常必
要的.
目前裸花紫珠质量控制的方法主要为以分光光
度法测定总黄酮含量(谌乐刚等,２００５),以高效液相
法测定指标性成分如木犀草素、熊果酸、齐墩果酸、
毛蕊花糖苷等(胡蓉等,２００９;张艳秋等,２００９).有
关该药材的指纹图谱研究还鲜有报道.本论文建立
了裸花紫珠HPLC指纹图谱方法,并考察了不同采
收期裸花紫珠的药材的质量差异,运用主成分分析
与对应分析法对实验数据进行了分析,实验结果表
明,HPLC指纹图谱结合数学方法可有效的评价裸
花紫珠药材,该方法可应用到裸花紫珠质量控制实
践中.
１　材料与方法
１．１材料、仪器与试剂
Agilent１２００高效液相色谱仪;KQ３２００DE型
数控超声波清洗器(昆山市仪器有限公司);MiliＧQ
纯水系统(美国 Milipore公司);１６K台式离心机
(珠海黑马医学仪器有限公司).ZORBAXSBCＧ１８
分析柱(４．６mm×２５０mm,５μm,美国 Agilent公
司);BS１１０S电子天平(北京赛多利斯天平有限公
司).乙腈为色谱纯(美国TEDIA公司),水为娃哈
哈制超纯水,其余试剂均为分析纯.对照品连翘酯
苷B(中国药品生物制品检定所１１１８１１Ｇ２０１００１)、毛
蕊花糖苷 (中国药品生物制品检定所 １１１５３０Ｇ
２０１２０８)、异毛蕊花糖苷(成都瑞芬思生物科技有限
公司YＧ０７３Ｇ１２１０２３).
样品为裸花紫珠的叶及嫩枝,采集于海南,具体
样品信息见表１.
表１　样品来源信息
Table１　Theoriginsofsamples
编号
No．
采收时间
Harvesttime
地点
Place
编号
No．
采收时间
Harvesttime
地点
Place
S１ ２０１０．０１．１３ 海口 S１４ ２０１０．１１．０４ 陵水
S２ ２０１０．０２．２５ 海口 S１５ ２０１０．１２．０３ 白沙
S３ ２０１０．０３．２２ 海口 S１６ ２０１０．１２．０３ 陵水
S４ ２０１０．０４．２０ 海口 S１７ ２０１０．０１．０７ 白沙
S５ ２０１０．０６．２３ 海口 S１８ ２０１０．０１．０７ 陵水
S６ ２０１０．０７．２１ 海口 S１９ ２０１０．０３．０９ 白沙
S７ ２０１０．０９．２１ 海口 S２０ ２０１０．０３．０９ 陵水
S８ ２０１０．０８．１４ 白沙 S２１ ２０１０．０５．０４ 白沙
S９ ２０１０．０９．１１ 白沙 S２２ ２０１０．０５．０４ 陵水
S１０ ２０１０．０９．１１ 陵水 S２３ ２０１０．０６．１１ 白沙
S１１ ２０１０．１０．０１ 白沙 S２４ ２０１０．０６．１１ 陵水
S１２ ２０１０．１０．０１ 陵水 S２５ ２０１０．０８．１４ 陵水
S１３ ２０１０．１１．０４ 白沙
１．２方法
１．２．１色谱条件　流动相:０．４％磷酸水溶液(A)Ｇ乙
腈(B);梯度洗脱:０~１５min,１６％~２５％B,１５~２５
min,２５％~３９．７％B;AgilentZORBAXSBＧC１８色
谱柱:４．６mm×２５０mm,５μm;柱温:３０℃;流速:
１mL􀅰minＧ１;进样量:１０μL;检测波长:３２７nm;检
测时间:２５min.
１．２．２样品溶液的制备　新鲜样品采集后,于室内阴
干,粉碎机将其粉碎过４０目筛.准确称取药材粉末
０．５g,加入５０％乙醇５０mL,称重,超声提取,提取
时间１h,放凉后用５０％乙醇补重.取上清液离心５
min,０．２２μm滤膜过滤,备用.
１．２．３对照品溶液的制备　分别精确称量连翘酯苷
B２．３mg、毛蕊花糖苷５．０mg、异毛蕊花糖苷５．５
mg对照品,用５０％乙醇溶解到３个５mL的容量瓶
中,超声使其充分溶解,并用５０％乙醇定容制成储
备液.
５７１２期　　　　　　　　 刘幼娴等:不同采收期裸花紫珠的HPLC指纹图谱研究
２　结果与分析
２．１指纹图谱条件优化
以检测出的峰的数量,主要色谱峰峰面积为主
要指标,比较了不同提取方法,不同提取溶剂,溶剂
体积,提取时间等参数对提取效果的影响.从表２
结果看出,这些因素对提取效果有明显影响,除了考
虑峰数量、峰面积外,我们还综合考虑峰型,主要成
分提取效果等,最后确定出最佳的提取条件如１．２
所示.同时考察不同检测器,不同色谱柱、柱温、流
速等条件,确定最优的分析条件如１．２．１所示.
表２　不同提取条件与不同分析条件对裸花紫珠指纹图谱的优化结果
Table２　Differentextractionconditionsanddetectionconditionstooptimizethefingerprint
不同提取方法
Differentextractionmethods
峰数目
Numberofpeaks
峰面积
Peakarea
不同分析条件
Differentanalyticalconditions
峰数目
Numberofpeaks
峰面积
Peakarea
提取方法
Extraction
methods
超声提取
Ultrasonicextraction ５２　　 １３０４８．７
加热回流
Heatingrefluxextraction ５１　　 １１３３２
检测器
Detector
UV ５２ １３０４８．７
ELSD ７ ２２４８．５１
不同溶剂
Different
solvents
不同体积
Different
volume
水 Water ４７ ８７３７．０５
２５％ 甲醇
２５％ Methanol ５１ １０３７０
５０％ 甲醇
５０％ Methanol ５２ １０５５４．８
７５％ 甲醇
７５％ Methanol ５５ １０３０６．３
１００％ 甲醇
１００％ Methanol ５０ ９９１５．８４
２５％ 乙醇
２５％Ethanol ５０ １０１２７
５０％ 乙醇
５０％Ethanol ５５ １１６６９
７５％ 乙醇
７５％Ethanol ５２ １３０４８．７
１００％ 乙醇
１００％Ethanol ４３ ７２９３．８８
２５mL ５２ １３６８０．５
５０mL ６０ ２４８６２．７
７５mL ４５ ７８７７．１７
１００mL ４４ ６８０４．６９
色谱柱
Column
柱温
Column
temperature
流速
Flowrate
缓冲溶液pH
BufferpH
ZORBAXSBＧC１８
(５μm,４．６×２５０mm)
５５ ３０６５８．７
ZORBAXSBＧC１８
(５μm,４．６×１５０mm)
４３ ２９１６６．１
EclispeXDBＧC１８
(５μm,４．６×１５０mm)
４５ ２９３２１．８
２５℃ ５１ １７５７６．７
３０℃ ５２ １７５８３
３５℃ ５２ １７５７３．５
４０℃ ５１ １７４０５．２
０．８mL􀅰minＧ１ ５１ １６３２６．６
１．０mL􀅰minＧ１ ５１ １７９８３．４
１．２mL􀅰minＧ１ ５１ １５１２３．２
２．０ ４５ １５１８７．４
３．０ ４８ １６１９４
４．０ ５２ １７５７３．５
不同提
取时间
Different
extraction
time
０．５h ５０ ８７２６．０１
１h ５２ １２５０８．２
１．５h ４７ ９５８４．６０
２h ４９ ９８５７．４７
２．５h ４９ ９９８０．４７
２．２方法学考察
２．２．１精密度实验　取S８药材样品制备供试品溶
液,在１．２．１条件下连续进样５次,各主要色谱峰的
保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为
０．０４％~０．１３％和０．１８％~３．００％,这表明仪器的精
密度良好.
２．２．２重现性实验　取S８药材样品５份,分别按
１．２．２中的方法制备供试品溶液,按照１．２．１节所述
色谱条件进行 HPLC分析.色谱图中各主要色谱
峰的保留时间和峰面积的 RSD分别为０．０９％~
１．２０％和１．４３％~２．８９％,这表明本方法的重现性
良好.
２．２．３稳定性实验　取S８药材样品制备供试品溶
液,分别在样品制备完成后第０、４、８、１６、２４、４８h进
行HPLC分析测定,色谱图中各主要色谱峰的保留
时间和峰面积的 RSD分别为０．０９％~０．４０％和
０．４７％~３．２８％,这表明供试品在４８h内稳定.
２．３裸花紫珠指纹图谱的建立
在优化的色谱条件下,对２５个裸花紫珠样品进
行了分析,其典型图谱见图１.通过比较对照品与
样品色谱峰的保留时间,以及往样品中添加对照品
等方法,确定了其中的３个成分,即６号峰为连翘酯
苷B、９号峰为毛蕊花糖苷、１１号为异毛蕊花糖苷.
其中异毛蕊花糖苷是本课题组首次从裸花紫珠药材
６７１ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
中分离得到.所采集的２５个样品,采集时间从１－
１２月,为了考察这些样品化学成分的一致性,我们
采用“中药色谱指图谱相似度评价系统(２００４A
版)”对供试品色谱图的相似度进行了计算,结果显
示这些样品的相似度在０．９０１~０．９６５之间.样品
共有色谱峰数目一致,即其中所含化学成分比较相
似.仔细对比发现不同采收期的裸花紫珠样品,其
色谱峰的峰面积存在明显差异,如图１所示.
图１　不同采收期裸花紫珠典型 HPLC色谱图
a:S１９样品,２０１０．０３．０９采收;b:S１１样品,２０１０．１０．０１采收.
Fig．１　HPLCChromatogramofCallicarpanudiflora
ondiferentharvestingtime
a:sampleS１９;b:ampleS１１
２．４裸花紫珠主成分分析
为了考察样品的质量差异,以１４个共有峰的绝
对峰面积为变量,用SPSS１１．５软件进行了 HCA分
析,结果表明除个别样品外,２５个样品被分为两大
类,以上半年采集的样品为一类,下半年样品为另一
类.两者的区别主要表现在上半年样品的色谱峰面
积(图１:a)要小于下半年的样品(图１:b),尤其明显
的是９号峰.这说明在不同的生长阶段,药材本身
积累的次生代谢产物的量有差异,采集时间对裸花
紫珠药材质量有明显的影响.
２．５裸花紫珠对应分析
以１４个共有峰的绝对峰面积为变量,用SAS
９．１软件进行对应分析,结果表明除个别样品外,２５
个样品被分为两大类,以上半年采集的样品为一类,
图２　不同采收期裸花紫珠药材聚类分析结果
Fig．２　HCAresultofCallicarpanudiflora
ondiferentharvestingtime　
下半年样品为另一类.与主成分分析的结果一致,
这充分说明采收期对裸花紫珠药材的品质有显著影
响.
图３　不同采收期裸花紫珠药材对应分析结果
Fig．３　CorrespondenceanalysisresultofCalicarpa
nudifloraondiferentharvestingtime
３　结论与讨论
本实验以峰数量及峰面积为指标,通过大量实
验考察了裸花紫珠提取方法,提取溶剂、溶剂体积、
提取时间等条件,同时考察了不同检测器,不同色谱
柱、柱温、流速等条件,优化了裸花紫珠指纹图谱的
研究方法.所建立的方法在在精密度、重现性和稳
７７１２期　　　　　　　　 刘幼娴等:不同采收期裸花紫珠的HPLC指纹图谱研究
定性方面完全符合指纹图谱研究的技术要求,也为
裸花紫珠的质量控制提供部分的科学依据.
迄今已从裸花紫珠中分离得到多种化学成分,
主要为苯乙醇苷类、萜类、黄酮类、酚酸类、甾体类、
挥发油类等化合物.其中苯乙醇苷类成分具有抗
炎、抗菌、免疫调节、增强记忆力、抗肿瘤、抗氧化、保
肝等作用,为其含量较高的活性成分(靖会等,２００６;
宋光西等,２０１１;张洁等,２０１０).目前已经收录到中
国药典的紫珠属植物,包括广东紫珠、大叶紫珠、杜
红花均以一种或两种苯乙醇苷类化合物作为指标性
成分.本课题组通过研究发现裸花紫珠药材,尤其
是裸花紫珠提取物中,苯乙醇苷类化合物包括连翘
酯苷B、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷是其中的主要
成分,其中异毛蕊花糖苷是我们首次从裸花紫珠中
分离得到的.
通过对２５个不同采收期的样品进行测定,利用
相似度分析、主成分分析及对应分析三种分析方法
对数据行进了分析发现,裸花紫珠上、下半年采集的
样品存在差异,主要是化学成分含量高低差异,尤其
是毛蕊花糖苷等成分.结果表明我们所建立的方法
能有效地评价裸花紫珠的质量,同时说明裸花紫珠
的质量跟采收期有密切的联系.
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