全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Mar．２０１４,３４(２):１８９－１９３　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．３９６９/j．issn．１０００Ｇ３１４２．２０１４．０２．０１２
曹威,李娟,程伟,等．铁筷子提取物对肿瘤细胞增殖及COXＧ２mRNA表达的抑制作用[J]．广西植物,２０１４,３４(２):１８９－１９３
CaoW,LiJ,ChengW,etal．InhibitoryefectofHelleborusthibetanusextractsontheproliferationoftumorcelsandexpressionofCOXＧ２mRNA[J]．
Guihaia,２０１４,３４(２):１８９－１９３
铁筷子提取物对肿瘤细胞增殖及COXＧ２
mRNA表达的抑制作用
曹　威１,李　娟２,３,程　伟３,江仁望１,２∗
(１．暨南大学 药学院 中药及天然药物研究所,广州５１０６３２;２．广西植物功能物质研究与利用重点实验室,
广西植物研究所,广西 桂林５４１００６;３．湖北中医药大学 药学院,武汉４３００６５)
摘　要:研究不同铁筷子提取物对肿瘤细胞增殖及COXＧ２mRNA表达的抑制作用.以铁筷子醇总提取物
(TKZ１)、正丁醇萃取部位(TKZ２)、乙酸乙酯萃取部位(TKZ３)分别作用于 DU１４５、PC３、HeLa、HTＧ２９、
HepG２等肿瘤细胞,应用噻唑蓝实验(MTT法)计算其对细胞增殖的抑制作用,应用荧光定量PCR技术检测
TKZ１、TKZ２、TKZ３处理后的各肿瘤细胞中COXＧ２mRNA的表达情况.结果表明:TKZ１、TKZ２、TKZ３均
能显著抑制多种肿瘤细胞的增殖,与阴性对照组比较,其可以在mRNA水平上抑制COXＧ２的表达,且呈明显
的量效关系.说明铁筷子提取物对体外肿瘤细胞的增殖具有显著的抑制作用,其抗瘤机制可能与抑制肿瘤细
胞中COXＧ２mRNA的表达有关.
关键词:铁筷子;抗肿瘤;细胞增殖;COXＧ２
中图分类号:R２８５　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１４)０２Ｇ０１８９Ｇ０５
InhibitoryeffectofHeleborusthibetanusextracts
ontheproliferationoftumorcelsand
expressionofCOXＧ２mRNA
CAOWei１,LIJuan２,３,CHENGWei３,JIANGRenＧWang１,２∗
(１．InstituteofTraditionalChineseMedicine&NaturalProducts,CollegeofPharmacy,JinanUniversity,
Guangzhou５１０６３２,China;２．GuangxiKeyLaboratoryofFunctionalPhytochemicalsResearchand
Utilization,GuangxiInstituteofBotany,Guilin５４１００６,China;３．CollegeofPharmacy,
HubeiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Wuhan４３００６５,China)
Abstract:ToinvestigatetheinhibitoryeffectofextractsfromHelleborusthibetanusoncelproliferationandexpresＧ
sionofCOXＧ２mRNA,theinhibitoryefectsofthetotalethanolextract(TKZ１),nＧbutanolfraction(TKZ２),and
ethylacetatefraction(TKZ３)onDU１４５,PC３,HeLa,HTＧ２９andHepG２tumorcellineswereexaminedbyMTT
assay,andtheCOXＧ２mRNAexpressionlevelswereanalyzedbyquantitativePCR．TheresultsshowedthatTKZ１,
TKZ２andTKZ３couldsignificantlyinhibittheproliferationoftumorcellinesandsuppresstheexpressionofCOXＧ
２onthemRNAlevelinadoseＧdependentmannercomparedwiththecontrol．AlthreesamplesfromHelleborusthiＧ
betanus(TKZ)couldsignificantlyinhibittheproliferationoftumorcelsinvitro,andthemechanismmightberelated
收稿日期:２０１３Ｇ１１Ｇ２６　　修回日期:２０１４Ｇ０２Ｇ２６
基金项目:广西植物功能物质研究与利用重点实验室主任基金(ZRJJ２０１３Ｇ４);广西植物功能物质研究与利用重点实验室开放基金(FPRU２０１３Ｇ
４);广东省高层次人才项目(JN２０１０).
作者简介:曹威(１９８８Ｇ),女,湖北武汉人,在读硕士,从事中药与天然药物抗肿瘤活性研究,(EＧmail)ttkx６jycw＠１２６．com.
∗通讯作者:江仁望,教授,从事中药与天然药物活性成分研究,(EＧmail)trwjiang＠jnu．edu．cn.
totheinhibitionoftheCOXＧ２mRNAexpressionintumorcels．
Keywords:Helleborusthibetanus;antitumor;celproliferation;COXＧ２
　　铁筷子(Helleborusthibetanus)又名黑毛七、小
桃儿七、九龙丹等,为毛茛科铁筷子属多年生草本植
物,主要分布于湖北西北部、陕西南部、甘肃南部和
四川西北部等,药用其根及根茎,其性凉味苦、具有
清热解毒、消肿止痛、活血散瘀等功效,主治膀胱炎、
尿道炎、跌打损伤及疮疖肿毒等症(彭强,１９９１).铁
筷子中的嚏根草甙元在体外对人体上皮癌KB细胞
有抑制效应(郭晓庄,１９９２);铁筷子水提取物对人胃
癌细胞及人白血病K５６２细胞的集落形成均有明显
抑制作用(杨永健等,２００１);铁筷子多糖可以抑制体
内、体外肿瘤细胞生长,促进细胞凋亡(刘维英等,
２００５),将细胞周期阻滞在 G０ＧG１ 期 (张勇等,
２００４),改善动物免疫机能(刘昕等,２０００;王振军等,
２００８),影响腹水瘤细胞膜的磷脂、胆固醇成分含量
变化而降低细胞膜的流动性(刘维英等,２００４).
为系统研究铁筷子的抗肿瘤活性成分,本研究
制备铁筷子醇总提物,经过萃取,获得正丁醇及乙酸
乙酯萃取部位.综合分析了三种提取物对五种肿瘤
细胞(DU１４５、PC３、HeLa、HTＧ２９、HepG２)增殖的
抑制活性,并研究其可能的作用机制,为下一步活性
成分的提取和分离提供理论依据.
１　材料与方法
１．１材料和试剂
人前列腺癌细胞株DU１４５、PC３,人宫颈癌细胞
株HeLa、人结肠癌细胞株 HTＧ２９、人肝癌细胞株
HepG２,购自中国典型培养物保藏中心.
噻唑蓝[３Ｇ(４,５ＧdimethylthiazolＧ２yl)Ｇ２,５ＧdiＧ
phenyltetrazoliumbromide,MTT]、二 甲 基 亚 砜
(DMSO)购自Sigma公司;细胞总RNA提取试剂
盒、逆转录和实时定量PCR试剂盒、青霉素、链霉素
购自Invitrogen公司,cDNA合成试剂盒购自ProＧ
mega公司;DMEM 培养基购自GIBCO公司,胎牛
血清购自Hyclone公司,培养瓶和培养板购自CorＧ
ning公司.
１．２方法
１．２．１细胞培养　细胞株用含１０％胎牛血清、１００U􀅰
mLＧ１青霉素和链霉素的DMEM 培养基,于３７℃、
５％CO２培养箱中培养,２~３d换一次液,用０．２５％
胰蛋白酶消化传代.并在 Olympus显微镜下观察
加药前后细胞形态学变化.
１．２．２铁筷子提取物的制备　药材铁筷子购自陕西
省宝鸡市太白县,经暨南大学药学院周光雄教授鉴
定为毛茛科铁筷子属铁筷子的根.干燥的根分别用
９５％和６０％的乙醇提取２次,回收溶剂得到总浸膏
(TKZ１),然后将醇提物总浸膏混悬于水中,依次用
石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取分别得到石油醚提取
物(极少)、乙酸乙酯萃取物(TKZ３)和正丁醇萃取
物(TKZ２).取 TKZ１、TKZ２、和 TKZ３适量,用
DMSO溶解,４℃保存备用.使用前,用细胞培养液
稀释到需要浓度.
１．２．３MTT实验　取对数生长期的肿瘤细胞,制成
２×１０４~３×１０４个􀅰 mLＧ１单细胞悬液,接种于９６
孔板,每孔１００μL,每组设３个平行孔,３７℃、５％
CO２培养箱培养,培养２４h后分别加入铁筷子提取
物TKZ１、TKZ２、TKZ３,使终浓度为 ０．５、０．２５、
０．１２５、０．０６２５、０．０３１２５μg􀅰mLＧ１.另设阴性对照
组,继续培养７２h.实验终止前４h,每孔加入浓度
为１mg􀅰mLＧ１的MTT５０μL,４~６h后,弃去培养
液,加DMSO１００μL/孔,震荡５min,待结晶溶解
后用酶标仪于５７０nm波长测定OD值.按以下公
式计算肿瘤细胞抑制率:抑制率(Inhibitoryrate,
IR％)＝(１－实验组平均 OD值/对照组平均 OD
值)×１００％,用SPSS１８．０,计算抑制５０％细胞生长
的铁筷子提取物浓度,以IC５０表示.
１．２．４铁筷子提取物对肿瘤细胞DU１４５中COXＧ２
的mRNA表达的影响　取对数生长期的前列腺癌
细胞DU１４５,制成浓度每皿为１０６个细胞的单细胞
悬液,接种于细胞培养皿中,常规培养２４h后,加入
铁筷子提取物使终浓度为０．５μg􀅰mLＧ１,培养０、
０．７５、１．５、３、６、１２、２４h.药物作用后,用Trizol裂解
提取RNA.用琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA的
完整性,用微量比色皿在紫外下检测RNA的浓度
和纯度,并将各组总 RNA浓度调整至同一水平.
各组取等量RNA加入２μLoligo(dT)１５、２μL超纯
dNTP(２．５mol􀅰LＧ１)和适量 RNaseＧfreeddH２O,
７０℃５min,迅速放冰上冷却２min后,再加入４
μL５×FirstＧStrandBuffer(含DTT)、０．５μLRNaＧ
sin、１μLMＧMLV,用枪轻轻混匀,于扩增仪上４２
０９１ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
图１　TKZ２对DU１４５细胞增殖的影响　A:对照;B:低浓度(０．０３１μg􀅰mLＧ１);C:中浓度(０．１２５μg􀅰mLＧ１);D:高浓度(０．５μg􀅰mLＧ１).
Fig．１　EffectofTKZ２ontheproliferationofDU１４５cel　A:Control;B:Lowconcentration(０．０３１μg􀅰mLＧ１);
C:Mediumconcentration(０．１２５μg􀅰mLＧ１);D:Highconcentration(０．５μg􀅰mLＧ１)．
℃５０min,９５℃５min,得cDNA.
完成逆转录后,进行聚合酶链反应.COXＧ２的
引物序列为上游５′ＧATGAGTGTGGGATTTGACＧ
CAGＧ３′,下游５′ＧTCAGCATTGTAAGTTGGTGＧ
GACＧ３′,产物理论大小２６１bp.GAPDH为内参基
因,引物序列为上游 ５′ＧAGAAGGCTGGGGCTＧ
CATTTGＧ３′,下游５′ＧAGGGGCCATCCACAGTC
TTCＧ３′,产物理论大小为２５８bp.荧光定量PCR
(QPCR)反应条件为９５℃预变性１５min,９５℃变
性１０s,６４℃退火２０s,７２℃延伸３０s,共４０个循
环.反应体系为２０μL体系(１μLcDNA、１μL
Primer、７μLddH２O、１０μLSuperRedPreMix
Plus).以上所有PCR反应均重复至少３次.用相
对定量方法分析数据,即２－△△Ct法,扩增效率为
９０％~１１０％之间.△△Ct＝(Ct目的基因ＧCt内参基因)待测
样品组Ｇ(Ct目的基因一Ct内参基因)对照组.
１．３统计学方法
采用统计分析软件SPSS１８．０,P＜０．０５为差异
有统计学意义,实验数据以x－±s表示.
２　结果与分析
２．１几种铁筷子提取物对不同肿瘤细胞增殖的影响
TKZ１、TKZ２、TKZ３ 对 DU１４５、PC３、HeLa、
HTＧ２９、HepG２细胞的增殖均有明显的抑制作用,
且各组与对照组相比,抑制率差异均有统计学意义
(P＜０．０５),其对肿瘤细胞抑制率均具有浓度依赖
性,如图２,３,４所示.铁筷子正丁醇提取物作用前
列腺癌DU１４５细胞４８h后,于Olympus显微镜下
观察加药后细胞形态的变化.可以观察到:最高浓
度下,细胞体积缩小、变圆、贴壁率降低,且部分呈碎
块状;中浓度下,细胞部分贴壁,大部分细胞皱缩变
圆;低浓度下的细胞与对照组细胞相比,基本无明显
变化,如图１所示.表１显示,铁筷子正丁醇提取物
TKZ２对DU１４５、PC３、HeLa、HTＧ２９、HepG２细胞
的增殖抑制作用均普遍强于铁筷子醇总提物TKZ１
和乙酸乙酯提取物TKZ３,其中,TKZ２对前列腺癌
DU１４５细胞的抑制增殖作用要明显强于其它几种
细胞株.
１９１２期　　　　　 曹威等:铁筷子提取物对肿瘤细胞增殖及COXＧ２mRNA表达的抑制作用
表１　铁筷子提取物对不同肿瘤细胞增殖的
抑制作用 (IC５０:μg􀅰mLＧ１)
Table１　InhibitoryeffectsofextractsfromHelleborus
thibetanuontheproliferationofvarioustumorcels
组别
Group DU１４５ PC３ HeLa HTＧ２９ HepG２
TKZ１ ０．０４９±
０．００３
０．１７２±
０．００４
０．２２９±
０．０１６
０．３６０±
０．００５
０．１１３±
０．００４
TKZ２ ０．０３６±
０．００３
０．１０２±
０．００８
０．０９８±
０．００２
０．２２０±
０．０１３
０．０７７±
０．００８
TKZ３ ０．０５３±
０．００４
０．１３６±
０．０２３
０．１８７±
０．００１
０．２３７±
０．０１６
０．１８７±
０．００１
图２　TKZ１对DU１４５、PC３、HeLa、HTＧ２９、
HepG２细胞增殖的抑制作用
Fig．２　InhibitoryefectofTKZ１ontheproliferationof
DU１４５,PC３,HeLa,HTＧ２９andHepG２cels
图３　TKZ２对DU１４５、PC３、HeLa、HTＧ２９、
HepG２细胞增殖的抑制作用
Fig．３　InhibitoryefectofTKZ２ontheproliferationof
DU１４５,PC３,HeLa,HTＧ２９andHepG２cels
２．２ 铁筷子提取物对肿瘤细胞 DU１４５中 COXＧ２
mRNA表达的影响
从铁筷子提取物对以上五种肿瘤细胞增殖的抑
制情况来看,铁筷子提取物对前列腺癌细胞DU１４５
的抑制效果最好,且TKZ２的活性最强.因此本文
图４　TKZ３对DU１４５、PC３、HeLa、HTＧ２９、
HepG２细胞增殖的抑制作用
Fig．４　InhibitoryefectofTKZ３ontheproliferationof
DU１４５,PC３,HeLa,HTＧ２９andHepG２cels
图５　TKZ２对DU１４５细胞mRNA表达的影响
Fig．５　EfectsofTKZ２ontheexpressionof
mRNAinDU１４５cels
重点讨论 TKZ２对DU１４５细胞中COXＧ２mRNA
的表达情况.将 TKZ２(０．５μg􀅰mLＧ１)作用于
DU１４５细胞,于０、０．５、１、２、３、６、１２、２４h分别检测
mRNA的表达情况.结果表明,作用３０min时
COXＧ２mRNA的表达量开始减少,到２h时表达量
减小到一半及以下,３、６、１２和２４h的COXＧ２mRＧ
NA表达量逐渐减小到对照组的２０％及以下,显示
持续抑制作用.可见,TKZ２抑制 DU１４５细胞中
COXＧ２mRNA表达呈明显的时间依赖关系(图５).
３　结论与讨论
本研究采用铁筷子的醇总提物、正丁醇提物和
乙酸乙酯提物,对５种不同肿瘤细胞株进行体外增
殖抑制试验,结果显示铁筷子提取物对各肿瘤细胞
２９１ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
株均具有明显的抑制作用,且呈浓度依赖性.其中,
正丁醇提物的抑制作用强于总提物和乙酸乙酯提
物,可能与正丁醇萃取物中含有大量的多糖及强心
苷类等化学成分有关系.铁筷子多糖可以明显抑制
小鼠体内S１８０细胞生长、多种白血病细胞株,如
K５６２、L１２１０和HLＧ６０等细胞生长和细胞克隆生成
(王振军等,２００４;刘昕等,２００１).
COXＧ２在肿瘤的发生、发展和转移中扮演着非
常重要的角色,其水平的增加可能是肿瘤发生的一
个早期事件,而且包括直肠、乳腺、前列腺等多种癌
组织都有不同程度的COXＧ２过表达,COXＧ２在低
分化的肿瘤转移灶中表达率较高(宋轶鹏等,２０１２).
免疫组化检测发现,COXＧ２在前列腺癌细胞中表达
显著,而在良性前列腺增生组织中表达很低.杨子
红等(２０１２)的研究表明在肿瘤形成生长过程中,
COXＧ２可能通过影响癌基因或抑癌基因的表达而
起到直接或间接的作用.邱建波(２００３)等检测
COXＧ２的水平有助于肿瘤的早期诊断,而抑制
COXＧ２的表达有助于肿瘤的治疗.因此,检测
COXＧ２的水平对肿瘤的治疗至关重要.本研究发
现,铁筷子正丁醇萃取物对 DU１４５、PC３、HeLa、
HTＧ２９、HepG２这五种肿瘤细胞的IC５０值分别为
０．０３６±０．００３、０．１０２±０．００８、０．０９８±０．００２、０．２２０±
０．０１３、０．０７７±０．００８μg􀅰mLＧ１,其对前列腺癌
DU１４５细胞的选择性最高.因此,我们选择采用
qPCR技术检测TKZ２对人前列腺癌DU１４５细胞
COXＧ２mRNA的表达情况,结果显示,TKZ２能够
抑制DU１４５细胞中COXＧ２mRNA的表达,并且随
着时间的延长,DU１４５细胞中COXＧ２mRNA的表
达降低,呈明显的时间依赖性,提示铁筷子提取物的
抗肿瘤作用可能与COXＧ２信号通路有关.下一步,
我们将继续分离并鉴定铁筷子提取物中的活性成
分,并深入阐明其与COXＧ２信号通路的关系,从而
为铁筷子的抗肿瘤作用提供理论依据.
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