全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Jul．２０１４,３４(４):５５２－５５６　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．３９６９/j．issn．１０００Ｇ３１４２．２０１４．０４．０２４
宋炳轲,杨雪莹,倪萍娅,等．DNA条形码技术在毒品原植物大麻鉴定中的应用[J]．广西植物,２０１４,３４(４):５５２－５５６
SongBK,YangXY,NiPY,etal．ApplicationofDNAbarcodingincannabicidentification[J]．Guihaia,２０１４,３４(４):５５２－５５６
DNA条形码技术在毒品原植物大麻鉴定中的应用
宋炳轲１,杨雪莹２,倪萍娅３,裴　黎２∗,张　颖２,徐小玉２
(１．中国人民公安大学,北京１０００３８;２．公安部物证鉴定中心,北京１０００３８;３．杭州市公安局上城区分局,杭州３１１２００)
摘　要:准确鉴定毒品原植物大麻的种属及品种具有重要的理论和实践意义.为了探讨DNA条形码技术用
于毒品原植物大麻种属鉴定及品种鉴定的可行性,该研究以６０份大麻原植物(分别采自内蒙、黑龙江、陕西延
安、陕西榆林４个地区的栽培大麻雌雄各６株及新疆玛纳斯地区的野生大麻雌雄各６株)为材料,通过从其叶
片中提取的DNA为模版,利用核糖体DNA基因间隔区的通用引物ITS２和叶绿体DNA的通用引物psbAＧ
trnH进行PCR扩增,对扩增片段进行双向测序,将测序结果进行人工矫正和比对.结果显示:所有大麻样本
的ITS２扩增片段序列没有变异完全一致,但psbAＧtrnH扩增片段变异较大共检测出８种cpDNA单倍型,用
MEGE５．１软件计算种间遗传距离,并构建NJ系统聚类树可以有效把这五个地区的大麻样本区别开来,因此
证明DNA条形码技术在毒品原植物大麻的种属鉴定方面具有可行性,但其用于大麻的种属鉴定的准确性、可
靠性及在其来源地鉴定及品种鉴定中的可能性还有待进一步深入地研究.
关键词:DNA条形码;大麻;种属鉴定
中图分类号:７９５　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１４)０４Ｇ０５５２Ｇ０５
ApplicationofDNAbarcodingincannabicidentification
SONGBingＧKe１,YANGXueＧYing２,NIPingＧYa３,
PEILi２∗,ZHANGYing２,XUXiaoＧYu２
(１．ChinesePeople’sPublicSecurityUniversity,Beijing１０００３８,China;２．InstituteofForensicScience,MinistryofPublic
Security,Beijing１０００３８,China;３．ShangChengDistrictBranchofHangzhouPublicSecurityBureau,Hangzhou３１１２００,China)
Abstract:TostudythefeasibilityofDNAbarcodingoncannabicspeciesidentification,DNAwereextractedfromsixty
cannabisplants’leaves(cultivatedcannabisfromInnerMongolia,Heilongjiang,ShanxiYan’anandYulin,wildcannaＧ
bisfromXinjiangManas,sixmaleandfemalecannabisfromeachregion),usedribosomalDNAintergenicregion
ITS２universalprimersandcpDNApsbAＧtrnHprimerforPCRamplification,thensequencedinbothdirections,the
resultscomparedtomanualcorrectionandfinalyforBlastcomparison．ITS２’amplifiedsequencesofalsampleswere
completelyconsistent,butpsbAＧtrnH’amplifiedsequencesvariedgreatly,whichweredetectedeightkindsofcpDNA
haplotypes．MEGE５．１softwarewasusedtocalculatethegeneticdistancebetweenspecies,andbuildNJphylogenetic
treeswhichcouldefectivelyseparatethefiveregionsofcannabicsamples．SoDNAbarcodingoncannabicspecies
identificationwasprovedtohaveviability,buttheaccuracy,reliabilityandpossibilitiesofidentificationofitsoriginand
speciesneedfurtherresearch．
Keywords:DNAbarcoding;cannabis;speciesidentification
收稿日期:２０１４Ｇ０１Ｇ１９　　修回日期:２０１４Ｇ０３Ｇ０８
基金项目:公安部物证鉴定中心基本科研业务费专项(２０１０JB００２)
作者简介:宋炳轲(１９８７Ｇ),女,河南禹州市人,硕士研究生,主要从事法医遗传学的研究,(EＧmail)sbk１９８７＠１２６．com.
∗通讯作者:裴黎,主任法医师,硕士生导师,主要从事分子生物学与法医遗传学研究,(EＧmail)peili１２８＠sina．com.
　　大麻(Cannabissativa)为被子植物门双子叶植
物纲荨麻目大麻科大麻属１~２年生雌雄异株的草
本植物.大麻属植物包括栽培大麻、印度大麻和野
生大麻三个主要品种及在长期生物进化过程中产生
的大麻变种和亚种(卢延旭等,２００７).大麻植物所
含的四氢大麻酚(THC)具有致幻作用,所以大麻被
列为与海洛因、可卡因并列的三大毒品之一(谢幸媚
等,２０００).不同品种大麻中THC的含量有很大的
差别且大麻是许多国家的重要经济作物,包括我国
在内的许多国家根据大麻体内THC含量的高低,
将大麻分为工业大麻、毒品大麻和中间型大麻,其中
后两种被列为严厉打击的对象.然而,在高额利润
的驱使下,全球范围的大麻种植和非法交易活动屡
禁不止.与此同时,在大麻犯罪案件中缴获成批未
加工的大麻植物(如整株植物、种子等)的情况也屡
见不鲜,在法庭科学中,虽然可用传统的形态学方法
对大麻进行鉴定,用理化方法如常规化学法、毛细管
电泳法、薄层色谱法等对大麻毒性成分进行测定,但
这些方法都有很大的局限性,对检材的要求较高且
很难或根本无法区分大麻的品种及来源.为了有效
打击大麻毒品犯罪,法庭科学急需寻找快速准确对
大麻进行种属鉴定和品种鉴定的新方法.
DNA条形码(DNAbarcoding)这一概念由加
拿大分类学家PaulHebert于２００３年首次提出,随
后在世界范围内受到了广泛关注,成为生物学研究
新热点.它是通过对一个或多个标准目的基因片段
进行序列分析达到物种鉴定目的,是分类学中辅助
物种鉴定的新技术.目前该技术已成为生物分类学
研究中的一个新方向,在医药、生态、环境、食品等领
域有广泛应用(Nacirietal．,２０１２;Kressetal．,
２０１２).植物DNA条形码筛选区域主要集中在叶
绿体和核糖体内转录间隔区,主要包括 rpoB,
rpoCl,matK,rbcL,UP,trnHＧpsbA,atpFＧatpH,psＧ
bKＧpsbI及核基因ITS等(Kressetal．,２０１２;Liet
al．２０１１;任保青等,２０１０).但目前尚未有获得广泛
认同的植物DNA条形码.２００９年在墨西哥召开的
第三届DNA条形码国际学术大会上,与会者达成
共识一致建议选择进化速率较快的ITS和trnHＧ
psbA,探讨它们在陆地植物中的通用性、分辨率和
适合程度.ITS即核糖体DNA基因间隔区,组成
该片段的不同部分(ITSl、ITS２和５．８S)序列变异差
别较大,ITS１片段生物识别率高于ITS２,但研究发
现ITS２片段扩增成功率高于ITS１,而且植物叶绿
体DNA属单系遗传(Chenetal．,２０１０;Yaoetal．,
２０１０;Schochetal．,２０１２).通过全面综合考虑,我
们最终选择ITS２和psbAＧtrnH作为初步研究我国
不同地区大麻变异情况的对象,对DNA条形码技
术在毒品原植物大麻鉴定中的应用可行性进行了初
步研究,以期为今后进一步的工作奠定基础.
１　材料与方法
１．１材料
采自内蒙古、黑龙江、新疆玛纳斯和陕西延安、
陕西榆林五个地区的大麻样本６０份,每个地区雌雄
各六份,均由公安部物证鉴定中心提供.
１．２大麻全基因组DNA的提取与定量
取干叶１０ mg,利用植物 DNA 提取试剂盒
(TiangenBiotechCo．,China)提取大麻全基因组
DNA,用 NanoDrop_NDＧ２０００Spectrophotometer
(ThermoFisherScientific,Wilmington,DE)核酸
定量仪进行定量,定量结果见表１.
表１　大麻全基因组DNA定量结果
Table１　 Quantitativeresults
样本采集地
Samplecolectingzone
OD２６０/２８０
平均浓度(ng/μL)
Meanconcentration
新疆玛纳斯 ManasiXinjiang ２．０１ ８５．４
内蒙古InnerMongolia １．９８ １１０．２
黑龙江 Heilongjiang １．７５ ９３．６
陕西延安 Yan’an １．８１ １００．１
陕西榆林ShanxiYulin １．８７ １１２．２
１．３PCR扩增与琼脂糖凝胶电泳
采用核糖体 DNA 基因间隔区的通用引物
ITS２(朱英杰等,２０１０)和叶绿体DNA的通用引物
psbAＧtrnH(刘莹等,２０１３)进行扩增(引物序列见表
２,由上海英潍捷基公司合成),扩增反应在eppenＧ
dorf扩增仪上进行,PCR反应总体系为５０μL,内含
２×PCRMastermix２５μL,正反向引物(１０mmol/
L)各１μL,去离子水２３μL,模版DNA１μL.PCR
反应程序为９４℃预变性５min;９４℃变性３０s,５８
℃退火３０s,７２℃延伸４５s,共３０个循环;７２℃终
延伸２０min.PCR产物用２％琼脂糖进行凝胶电泳
检测.
１．４扩增产物测序
对扩增产物进行双向测序,测序反应由上海生
物工程公司完成.
３５５４期　　　　　　　　宋炳轲等:DNA条形码技术在毒品原植物大麻鉴定中的应用
表２　ITS２及psbAＧtrnH通用引物序列
Table２　Thesequencesofuniversal
primerITS２andpsbAＧtrnH
引物编号PrimerNo． 引物序列Primersequences
ITS２ S２F
(正向引物) ATGCGATACTTGGTGTGAAT
S３R
(反向引物) GACGCTTCTCCAGACTACAAT
psbAＧtrnH fwdPA
(正向引物) GTTATGCATGAACGTAATGCTA
RevTH
(反向引物)CGCGCAATGGTGGATTCACAATCC
１．５测序结果的拼接与分析
用DNAMANversion６软件及ChromasLITE
version２．０１软件完成序列拼接,用 MEGA５．１软
件进行６０份大麻样本的序列比对并进行变异位点
分析,然后登陆 http://blast．ncbi．nlm．nih．gov/
Blast．cgi网站,将所得序列进行blast比对,并利用
MEGA５．１进行多重比对,基于 KimuraＧ２ＧparameＧ
ter(K２P)双参数模型计算遗传距离,并用邻接法
(neighbourＧjoining)构建系统聚类树(NJ树),同时
以bootstrap(自展支持率１０００次)重复检验各分
支的支持率.
２　结果与分析
２．１扩增结果
实验结果表明ITS２和psbAＧtrnH 对６０份大
麻样本的扩增及测序成功率均为１００％.
２．２测序及序列比对
通过测序得引物ITS２和psbAＧtrnH的完整扩
增片段DNA序列,使用NCBI数据库中的Blast工
具进行搜索,比对后可以确定与该段序列相似度最
高的匹配均为大麻核糖体和叶绿体基因,匹配度分
别达到１００％和９９％,序列号分别为 KC２９２６２９．１
和KC５７８８２０．１.说明扩增序列即为所需要的大麻
核糖体和叶绿体基因的一部分.
２．３序列变异比较
应用 MEGE５．１进行序列对比,发现采自５个
不同地区的６０份大麻样本的ITS２引物扩增区域
测序所得的序列长度均为４４６bp,且所有大麻样本
的序列完全一致,不含Poly结构,未发现变异位点;
引物psbAＧtrnH 扩增片段的实际长度为４０４bp,共
发现１１个单一多态性变异位点(分别为１、１２、４０、
４７、２０２、２８４、３３０、３７７、３８１、３９１、４０４),占总分析位点
的２．７２％,由于cpDNA常被看作是一个独立的遗
传单位,在细胞分裂时不经受重组(Schaaletal．,
１９９８).故对来自五个地区来源的６０份大麻样本可
定义８种cpDNA单倍型(表３),其中新疆玛纳斯地
区的１２份雌雄标本序列完全一致为 HA型,黑龙
江地区的六份雌性标本序列完全一致均为 HA型、
雄性均为HB型,内蒙地区的雌性序列完全一致均
为HC型、雄性均为HD型,陕西延安地区的雌性序
列完全一致为HE型、雄性为HF型,陕西榆林地区
的六份雌性标本序列完全一致为 HG型、雄性为
HH型.分析结果(图１).
表３　大麻的变异位点与单倍型
Table３　Variationpositionandhaplotypeofcannabissativa
引物序列长度
LengthofPrimer
sequences
H
A
H
B
H
C
H
D
H
E
H
F
H
G
H
H
１bp C C C A C A C C
１２bp C T C C C C C T
４０bp C T C C C C C C
４７bp T A T T T T T T
２０２bp G G G G A G G G
２８４bp T A T T A T T T
３３０bp A A C C C A A A
３７７bp C C C G C C C C
３８１bp T T T G T T T T
３９１bp T G G G T T T T
４０４bp G G G G G T T G
图１　psbAＧtrnH序列的变异位点
(“．”表示与黑龙江雌性碱基相同)
Fig．１　VariationpositionofpsbAＧtrnHsequence
２．４遗传距离分析
将五个地区的大麻序列进行分析,根据碱基变
异位点的情况,用KimuraＧ２ＧParameter距离模式计
算的遗传距离(表４).五个地区的大麻样本遗传距
４５５ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
表４　五个地区大麻遗传距离分析
Table４　GeneticdistanceanalysisofCannabicinfiveregions
黑龙江雌性
Heilongjiang
female
黑龙江雄性
Heilongjiang
male
内蒙雄性
InnerMongolia
male
内蒙雌性
InnerMongolia
female
新疆雌性
Xinjiang
female
新疆雄性
Xinjiang
male
延安雌性
Yan’an
female
延安雄性
Yan’an
male
榆林雌性
Yulin
female
黑龙江雌性
Heilongjiangfemale
０．０１２５
内蒙雌性
InnerMongoliafemale
０．００５ ０．０１２５
内蒙雄性
InnerMongoliamale
０．０１２５ ０．０２０１ ０．００７５
新疆雌性
Xinjiangfemale
０ ０．０１２５ ０．００５ ０．０１２５
新疆雄性
Xinjiangmale
０ ０．０１２５ ０．００５ ０．０１２５ ０
延安雌性
Yan’anfemale
０．００５ ０．０１２５ ０．０１ ０．０１７５ ０．００５ ０．００５
延安雄性
Yan’anmale
０．００５ ０．０１７５ ０．０１ ０．０１２５ ０．００５ ０．００５ ０．０１
榆林雌性
Yulinfemale
０．００２５ ０．０１５ ０．００７５ ０．０１５ ０．００２５ ０．００２５ ０．００７５ ０．００２５
榆林雄性
Yulinmale
０．００２５ ０．０１ ０．００７５ ０．０１５ ０．００２５ ０．００２５ ０．００７５ ０．００７５ ０．００５
离在０．０００~０．０２０１,平均遗传距离为０．００８.其中
黑龙江的雄性大麻与内蒙的雄性大麻最大,为
０．０２０１,新疆的雄性雌性和黑龙江的雌性最小.
２．５系统发育邻接树分析
从图２可以看出,新疆的野生雌雄大麻与黑龙
江的雌性大麻聚为一支,陕西延安和榆林及黑龙江
地区的雄性大麻聚为一支,内蒙的雌性与雄性大麻
聚为一支,陕西延安和榆林的雌性大麻聚为一支.
说明sbAＧtrnH条形码序列可用于不同地域大麻雌
雄间的鉴别分析.
图２　基于psbAＧtrnH条形码序列构建的五个
地区雌雄大麻间的 NJ系统进化树
Fig．２　NJphylogenetictreeoffiveregionsbetweenmaleand
femalecannabisbasedonpsbAＧtrnHbarcodesequences
３　讨论
大麻是一种集造纸、纺织、食用、药用等作用于
一身的经济价值很高的作物,具有抑制杂草生长、适
应环境能力强等特点,有利于戈壁滩涂和贫瘠土地
的绿化与开发利用.本实验结果表明,五个地区的
大麻样本的ITS２引物扩增区域测序所得的序列完
全一致,说明利用核糖体通用引物ITS２不能对不
同地域来源的大麻种属进行鉴定,虽然如此,但通过
blast比对却可以把大麻鉴定出来;而采用psbAＧ
trnH条形码序列对大麻研究的结果表明,其不但可
以把不同地域来源的大麻鉴定出来还可以把大麻的
雌性与雄性、野生大麻与栽培大麻分辨出来.实验
结果还表明,不同地区的雌雄大麻的cpDNA单配
体不同,而且由于大麻通常是雌雄异株,雄性植株的
纤维质量高于雌性植株,而雌性植株的有毒成分高
于雄性植株,雄株比雌株先成熟,对机械化的收割造
成不便;雌雄株在幼苗时期较难分辨,只有当其生殖
器官原基开始发育时才能正确识别(李仕金等,
２００８).基于此,本研究一方面可以为大麻犯罪案件
中查找毒品来源、铲除毒品种植基地提供线索,有利
于打击个人及集团式的大麻贸易活动;另一方面也
为大麻育种提供了可能,而且有助于培育出低毒、高
纤维利用价值的雌雄同株的大麻新品种,以造福人
类和社会.
５５５４期　　　　　　　　宋炳轲等:DNA条形码技术在毒品原植物大麻鉴定中的应用
４　结论
本实验是在有限的大麻标本中得出的结论,故
为了更好更精确地验证DNA条形码技术对毒品原
植物大麻的鉴定还需要一方面加大同一地区大麻雌
雄植株的采样,另一方面加大更多地区大麻品种的
研究;另外也需要进一步深入筛选更多更合适的条
形码序列.总的来说,DNA条形码技术有望成为将
来毒品案件刑事侦查和检验鉴定的新方法.
致谢　本论文由公安部物证鉴定中心基本科研
业务经费项目(２０１０JB００２)资助,并得到了公安部
物证鉴定中心法医物证检验处的各位老师的指导和
帮助,在此深表感谢!
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