全 文 ：基因组学与应用生物学，2011年，第 30卷，第 5期，第 626-631页
Genomics and Applied Biology, 2011, Vol.30, No.5, 626-631
技术改进
Upgraded Technology
一个新的体外快速鉴定十字花科黑腐病菌Ⅲ型效应物的报告质粒的构建
唐菲菲 1 韩恩兴 1 梁业瀛 1 刘三 1 姜伯乐 1,2*
1广西大学生命科学与技术学院,南宁, 530005; 2亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,南宁, 530005
*通讯作者, jiangbole1971@sina.com
摘 要 植物病原菌侵染寄主的过程就是病原菌和寄主植物相互作用的过程。在这个相互作用过程中，Ⅲ型
分泌系统和Ⅲ效应物与病原菌致病密切相关。大部分革兰氏阴性植物病原菌通过Ⅲ型分泌系统定向的把效
应物蛋白传递到宿主细胞，效应物蛋白进入植物体引起致病或过敏反应。本研究将百日咳杆菌的腺苷酸环化
酶基因连接至含启动子的 pLAFRJ载体上，从而构建出一个新的体外快速鉴定Ⅲ型效应物的报告质粒 pJ-
JA，并用已鉴定为Ⅲ型效应物基因的十字花科黑腐病菌 XC1553的启动子和信号区验证该报告质粒，证明这
个系统是可以工作的。该报告质粒为进一步精确筛选鉴定十字花科黑腐病菌Ⅲ型效应物提供了材料。
关键词 十字花科黑腐病菌,腺苷酸环化酶,Ⅲ型效应物
Construction of A New Reporter Plasmid to Identify the Type Ⅲ Effectors
in Xanthomonas campestris in vitro
Tang Feifei 1 Han Enxing 1 Liang Yeying 1 Liu San 1 Jiang Bole 1,2*
1 College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning, 530005; 2 Guangxi Key Laboratory of Subtropical Bioresource Conservation
and Utilization, Nanning, 530005
* Corresponding author, jiangbole1971@sina.com
DOI: 10.3969/gab.030.000626
Abstract The infection process of plant pathogen is a interaction between phytopathogens and host plants. Type
Ⅲ secretion system and type Ⅲ effectors are closely related and pathogen virulence. Most gram-negative phy-
topathogens deliver the effector protein directly into the host cell through typeⅢ secretion system, causing disease
or hypersensitive reaction. In this research the adenylate cyclase gene of Bordetella pertussis was cloned into
pLAFRJ which contains a promoter, yielding a new reporter plasmid pJJA which can be used to identify the type
Ⅲ effectors efficiently in vitro. The promoter and signal region of XC1553 which has been identified as typeⅢ ef-
fectors in Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) was used to verify the report plasmid. The results of cAMP
concentration detection assay in Brassica oleracea leaves demonstrated that the new report plasmid pJJA works
well. The report plasmid provides material for further precise screening typeⅢ effectors in Xcc.
Keywords Xanthomonas campestris pv. campestris, Adenylate cyclase, TypeⅢ effectors
基金项目：本研究由国家自然科学基金项目(30970085)资助
黄单胞菌(Xanthomonas)能侵染 268种双子叶植
物和 124种单子叶植物(Chan and Goodwin, 1999)。病
害症状多为叶斑、叶枯、腐、萎蔫和溃疡等(Qian et al.,
2005)。十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris
pv. campestris, Xcc)是黄单胞菌属的模式菌株之一，
主要通过水孔和伤口侵入植物，进入植物后在质外
体空间增殖，并沿维管束蔓延，引起系统侵染。
研究表明，Ⅲ型效应物在植物病原细菌的致病
过程中发挥非常关键的作用。Ⅲ型效应物在致病过
程中可能通过以下方式在植物体起作用：(1)直接攻
击寄主的防御系统、改变寄主细胞骨架；(2)与寄主
DNA作用，干扰正常代谢；(3)Ⅲ型效应物可帮助病
原菌从寄主内获取营养，在寄主体内生长扩展和定
殖(Nomura and He, 2005)。
目前，常用于确定效应物基因的方法主要为采用
芯片技术及 hrp调控元，植物诱导启动子盒(PIP-box)，
转座子随机诱变。利用已鉴定的无毒蛋白或腺苷酸
环化酶为报告蛋白以及功能检测和生物信息学方法
鉴定效应物，在 Xanthomonas和 Pseudomonas中都建
立了应用无毒蛋白作为报告蛋白效应物体外转运
鉴定系统。十字花科黑腐病菌 Xcc 8004中已经鉴定
了 16 个Ⅲ型效应物基因，其中利用 N- 端缺失了
1~58个氨基酸的 AvrBs1作为报告蛋白的报告系统，
并鉴定了 16个效应物，例如，AvrACXcc8004、XopXccN、
XopXccE1 和 XopXccR1 等效应物基因(Guttman et
al., 2002; Cunnac et al., 2004; Roden et al., 2004; Chang
et al., 2005; Xu et al., 2007; Jiang et al., 2008; Jiang et
al., 2009)。
由于Ⅲ型效应物具有分泌效率低的特点，部分
Ⅲ型效应物基因通过Ⅲ型分泌系统分泌出的蛋白量
低，无法用 HR (hypersensitive response)反应来检测。
鉴于这种情况，Casper-Lindley等(2002)人在 Xcv 85-
10中构建了以腺苷酸环化酶为报告蛋白的体外快速
检测系统，通过检测植物体内的环腺苷酸(cAMP)含
量可以更快速、灵敏、定量地检测蛋白的转运。为了
更好地鉴定和研究 Xcc 8004中Ⅲ型效应物基因，构
建以腺苷酸环化酶基因为报告系统的体外快速检测
系统变得更为紧迫。
腺苷酸环化酶能够催化 ATP转变成 cAMP，在
植物和动物中广泛分布，存在多种异构体。这些异构
体以是否需要钙调蛋白激活活性而分为两类：钙调
蛋白依赖型和钙调蛋白非依赖型。百日咳杆菌的腺
苷酸环化酶属于钙调蛋白依赖型。整个腺苷酸环化
酶基因可编码一个含 1 706个氨基酸的蛋白，分子量
为 200 kD。前 400个氨基酸具有需钙调蛋白激活腺
苷酸环化酶活性，而 C端的 1 300个氨基酸是具溶
血酶活性(Glaser et al., 1988)。
1结果与分析
1.1报告质粒的构建
使用引物 cyaAF和 cyaAR，从含有 pMS107质
粒的大肠杆菌菌株上扩增 cyaA基因的第 4个 ~第
1 216个核苷酸，如图 1。将纯化后的片段经 Sph Ⅰ
和 XbaⅠ酶切后连接到测序载体 pUC19 后进行验
证。验证如图 2。验证正确后送测序，测序结果显示
pUCcyaA 上的 cyaA 基因片段完全正确(结果未显
示)。把测序正确的 cyaA 基因片段经 BamH Ⅰ和
HindⅢ酶切后，连接到经同样酶切的 pLAFRJ，获得
报告质粒 pJJA。酶切验证见图 3。
1.2报告质粒的分子验证
使用实验室已经构建好的重组质粒 pK1553，经
EcoRⅠ和 BamHⅠ酶切后获得 XC1553启动子，大小
894 bp。胶回收后连接到 EcoRⅠ和 BamHⅠ酶切的
报告质粒 pJJA，获得重组质粒 pJJA1553。使用引物
对 P1553F-cyaAR进行 PCR验证，产物大小 2.1 kb。
把重组质粒通过三亲本接合导入 8004* 和 8004*
△hrcV。验证图片见图 4~图 6。
1.3 cAMP含量的检测
按文献(Casper-Lindley et al., 2002)的方法收集
图 1 cyaA基因片段 PCR扩增产物
注: M. 100 bp DNA 分子质量标记; 1: cyaA 基因 DNA 片段
PCR产物
Figure 1 PCR products of functional domain of cyaA
Note: M: 100 bp DNA Ladder; 1: PCR products of cyaA
图 2重组质粒 pUCcyaA酶切验证
注: M: 100 bp DNA分子质量标记; 1:酶切重组质粒 pUCcyaA
Figure 2 Enzyme-digested confirmation of recombinant plasmid
pUCcyaA
Note: M: 100 bp DNA Ladder; 1: Enzyme-digested recombinant
plasmid pUCcyaA
图 3重组质粒 pJJA酶切验证
注: M: 100 bp DNA分子质量标记; 1: λ/HindⅢ DNA分子质
量标记; 2: BamHⅠ和 HindⅢ酶切重组质粒 pJJA
Figure 3 Enzyme-digested confirmation of recombinant plasmid
pJJA
Note: M: 100 bp DNA Ladder; 1: λ/HindⅢ DNA ladder; 2: En-
zyme-digested report plasmid pJJA
一个新的体外快速鉴定十字花科黑腐病菌Ⅲ型效应物的报告质粒的构建
Construction of A New Reporter Plasmid to Identify the TypeⅢ Effectors in Xanthomonas campestris in vitro 627
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
待检测样品，使用 Amersham 的 cAMP Biotrak En-
zymeimmunoassay (EIA) System进行检测。检测的酶
活值见表 1。
从表 1中数据结果可以发现，应用百日咳杆菌
的腺苷酸环化酶活性的区域作为报告蛋白而构建的
报告系统是可以工作的。8004*/pJJA1553中 cAMP
含量明显高于 8004*，可以判断这个融合蛋白的可以
分泌出细胞进入植物体。同时作为负对照的 8004*
△hrcV/pJJA1553 与 8004*△hrcV 的 cAMP 含量相
当，由此可以判断此融合蛋白通过Ⅲ型分泌系统分泌
的。此实验结果表明构建的报告系统可以正常工作。
图 4胶回收 XC1553启动子区
注: M: 100 bp DNA 分子质量标记; 1: 胶回收 XC1553 启动
子区
Figure 4 Gel extraction of DNA fragment of XC1553 promoter
Note: M: 100 bp DNA Ladder; 1: Gel extraction of DNA frag-
ment of XC1553 promoter
图 5重组质粒 pJJA1553,三亲子 8004*/pJJA1553, 8004*△hrcV/
pJJA1553的 PCR验证
注: M: 100 bp DNA分子质量标记; 1: PCR验证重组质粒 pJ-
JA1553; 2: PCR验证 8004*/pJJA1553三亲接合子; 3: PCR验
证 8004*△hrcV/pJJA1553三亲接合子
Figure 5 PCR verification of pJJAl553, transconjugants 8004*/
pJJA1553, and 8004*△hrcV/pJJA1553
Note: M: 100 bp DNA Ladder; 1: PCR verification of recombi-
nant plasmid pJJAl553; 2: PCR verification of transconjugant of
8004*/pJJA1553; 3: PCR verification of transconjugant of 8004*
△hrcV/pJJA1553
图 6 酶切验证重组质粒 pJJA1553, 三亲子 8004*/pJJA1553,
8004*△hrcV/pJJA1553
注: M: λ/HindⅢ DNA分子质量标记; 1: 酶切验证重组质粒
pJJA1553; 2: 酶切验证 8004*/pJJA1553 三亲接合子; 3: 酶切
验证 8004*△hrcV/pJJA1553三亲接合子
Figure 6 Enzyme-digested confirmation of recombinant plasmid
pJJAl553, transconjugants of 8004*/pJJA1553 and 8004*
△hrcV/pJJA1553
Note: M: λ/Hind Ⅲ DNA Ladder; 1: Enzyme-digested recombi-
nant plasmid pJJAl553; 2: Enzyme-digested recombinant plasmid
pJJAl553 of transconjugant of 8004*/pJJA1553; 3: Enzyme-di-
gested recombinant plasmid pJJAl553 of transconjugant of 8004*
△hrcV/pJJA1553
2讨论
2.1以腺苷酸环化酶构建的转运报告系统的可行性
百日咳杆菌腺苷酸环化酶需要钙调蛋白才能催
化 ATP转化成 cAMP。目前的研究证明，真核细胞中
才能产生钙调蛋白，细菌中不存在钙调蛋白，因此构
建的报告转运系统，只有把蛋白转运到植物体内，融
合蛋白才能具有腺苷酸环化酶的酶活功能，才能把
ATP转化成 cAMP (Glaser et al., 1988; Casper-Lindley
et al., 2002)。
本实验用已经证实为Ⅲ型效应物基因的XC1553
的启动子和信号区片段验证该系统是可以正常工作
的。这个报告系统检测的灵敏度高，有利于检测分泌
量低的Ⅲ型效应物基因。
2.2 Xcc 8004 Ⅲ型效应物基因的鉴定
鉴定植物病原菌的Ⅲ型效应物基因一直都是研
究植物与病原菌互作机理的热点(Nomura and He,
2005)，但是由于Ⅲ型效应物基因分泌量低，在基因组
中多冗余，保守性不强等特点，Ⅲ型效应物基因的鉴
定一直面临着一定的困难(Collmer et al., 2002)。应用
已鉴定的无毒蛋白为报告蛋白以及功能检测和生物
表 1压渗 24 h后检测甘蓝 cAMP水平
Table 1 Levels of cAMP in Brassica oleracea leaves 24 h after in-
filtration
菌株
Strain
8004*
8004*/pJJA1553
8004*△hrcV
8004*△hrcV/pJJA1553
植物中 cAMP的浓度
(nmol/mg total proteins)
cAMP concentration in planta
(nmol/mg total proteins)
0.014±0.000 4
11.538±0.696 3
0.018±0.006 0
0.019±0.007 2
628
一个新的体外快速鉴定十字花科黑腐病菌Ⅲ型效应物的报告质粒的构建
Construction of A New Reporter Plasmid to Identify the TypeⅢ Effectors in Xanthomonas campestris in vitro
信息学方法鉴定效应物已经取得了很多成果，特别
是以腺苷酸环化酶为报告蛋白的报告系统的建立使
对低分泌量的Ⅲ型效应物基因的鉴定有了突破性的
进展。植物病原菌中已经利用这个系统鉴定了很多
Ⅲ型效应物基因(Schechter et al., 2004; Furutani et al.,
2009; Poueymiro et al., 2009)。相对于黄单胞菌属中
其他病原菌来说，Xcc 8004鉴定Ⅲ型效应物的工作
相对落后，因而构建灵敏度更高的Ⅲ型效应物鉴定
系统对于鉴定十字花科黑腐病菌的Ⅲ效应物基因具
有重要意义，对于研究病原菌致病机理，培育抗性品
种具有重要作用。
3材料和方法
3.1供试材料
本实验所用菌株和质粒见表 2。大肠杆菌使用 L
表 2本工作所用的菌株和质粒
Table 2 Bacterial strains and plasmids used in this work
菌株和质粒
Strain and plasmid
JM109
X. campestris pv. campestris
8004*
8004*ΔhrcV
8004*/pJJA1553
8004*ΔhrcV/pJJA1553
pLAFRJ
pRK2073
pUC19
pMS107
pUCcyaA
pK1553
pJJA
pJJA1553
特征
Relevant characteristics
recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17, supE44, relA1, Δ(lac-pro-
AB)/F [traD36, proAB+, lacIq, lacZΔM15]
8004 hrpG点突变体
As 8004 with a site special mutagenesis of hrpG, Rifr
8004* hrcV缺失突变体
hrcV deletion mutant of 8004*, Rifr, Kanr
8004*含有 pJJA1553
8004* containing pJJA1553, Rifr, Tcr
8004*ΔhrcV含有 pJJA1553
8004*ΔhrcV containing pJJA1553, Rifr, Kanr, Tcr
穿梭质粒
Shuttle plasmid, Tcr
帮助质粒
Helper plasmid, Tra+, Mob+, ColE1, Spcr
克隆载体
Cloning plasmid, Ampr
plC20H含有 cyaA第 4~1 216核苷酸序列
plC20H containing the PCR fragment of cyaA from nucleotide 4
to nucleotide 1216, Ampr
pUC19含有 cyaA第 4~1 216核苷酸序列
pUC19 containing the PCR fragment of cyaA from nucleotide 4 to
nucleotide 1 216, Ampr
pKl8mob含有 XC1553的启动子和信号区
pKl8mob derivative harboring promoter and signal region of
XC1553, Kanr
pLAFRJ含有 cyaA第 4~1 216核苷酸序列
pLAFRJ containing the PCR fragment of cyaA from nucleotide 4
to nucleotide 1 216, Tcr
pJJA含有 XC1553的启动子和信号区
pJJA containing promoter and signal of XC1553, Tcr
来源或参考文献
Source or reference
Sch覿fer et al., 1994
李贤祯, 2006
Li, 2006
本实验室
Our labs collection
本工作
This work
本工作
This work
本实验室
Our labs collection
Leong et al., 1982
Yanisch-Perron et al., 1985
Sory and Cornelis, 1994
本工作
This work
姜伯乐等, 2007
Jiang et al., 2007
本工作
This work
本工作
This work
B培养基，培养温度 37℃ (Miller, 1972)。十字花科黑
腐病菌使用 NYG培养基(Daniels et al., 1984)，培养温
度 28℃，抗生素用量参照文献(何勇强等, 2005)。
3.2试剂和仪器
限制性内切酶，T4 DNA连接酶，Ex Taq DNA聚
合酶均购自上海普洛麦格生物产品有限公司，cAMP
Biotrak Enzymeimmunoassay (EIA) System购自 Ame-
rsham公司。使用碧云天的 BSA蛋白定量试剂盒测
定总蛋白含量。
使用 BioTeK MQX200在 OD450和 OD562检测吸
光值。
3.3报告质粒的构建
使用引物 cyaAF和 cyaAR (表 3)，从含 pMS107
质粒的大肠杆菌菌株上扩增 cyaA (腺苷酸环化酶)基
629
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
因的第 4个 ~第 1 216个核苷酸。经 SphⅠ和 XbaⅠ
酶切克隆到测序载体 pUC19 上，获得重组质粒
pUCcyaA。测序正确后，用 BamHⅠ和 HindⅢ酶切后
胶回收，再连到 pLAFRJ上，获得报告质粒 pJJA。
使用实验室已经构建好的含 XC1553启动子和
信号区的 pK1553质粒，经 EcoRⅠ和 BamHⅠ酶切
后胶回收，连接到报告质粒 pJJA，获得重组质粒 pJ-
JA1553。
通过三亲本接合，把重组质粒 pJJA1553 导入
8004*和缺失突变体 8004*ΔhrcV。在丰富培养基上
分别使用 Rif+Tc 和 Rif+Kan+Tc 筛选三亲接合子。
获得的接合子在甘蓝京丰 1号上进行检测。
3.4腺苷酸环化酶酶活检测
选取培养时间为 1个月的甘蓝植株，参照参考
文献(Casper-Lindley et al., 2002)，使用添加相应抗生
素在 NYGB过夜培养 OD600=1.0以上的待检测菌株
的菌液。收集 1 mL菌液，用 1 mL无菌水清洗并重
悬。调 OD600=0.1，用无针头的针筒吸取 10 μL的菌液
压渗到甘蓝叶片背面。24 h后收集 1 cm2的叶片用于
提取待测样品。把收集的样品置于液氮中研磨，等液
氮挥发完后，加入 323 μL的 1.1 mol/L HClO4继续
磨。等叶片彻底磨碎后，15 000 g离心 10 min。取上清
280 μL，剩余的进行蛋白总量测定。在取出的上清中
加入 37.3 μL 6 mol/L K2CO3，15 000 g离心 10 min。
取上清 200 μL转移到另一干净的 EP管中，用真空
冷冻抽干机干燥，干燥后置于-80℃保存备用。
取 -80℃保存的样品使用 Amersham 的 cAMP
Biotrak Enzymeimmunoassay (EIA) System进行检测
样品中 cAMP含量。
作者贡献
唐菲菲负责质粒构建，cAMP含量测定及文稿修
订；韩恩兴和梁业瀛负责数据整理分析和初稿撰写；
刘三协助实验；姜伯乐负责研究方案指导和文稿修
订。全部作者都已阅读校正全文，并同意发表。
致谢
感谢法国农科院 INRA实验室提供的含pMS107
质粒的菌株。
参考文献
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表 3本工作所用引物
Table 3 Primers used in this work
名称
Name
cyaAF
cyaAR
P1553F
P1553R
序列
Sequence
GGGTCTAGACAGCAATCGCATCAGGCTGGT
GGGGCATGCTGTCATAGCCGGAATCCTGGC
GGGGAATTCCCTGGGCAAGGCCAATTATAGCG
GGGGGATCCCTCAACGCGCTCGCACCAGGCTG
产物长度(bp)
Product size (bp)
1 213
894
630
一个新的体外快速鉴定十字花科黑腐病菌Ⅲ型效应物的报告质粒的构建
Construction of A New Reporter Plasmid to Identify the TypeⅢ Effectors in Xanthomonas campestris in vitro
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