全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Nov．２０１３,３３(６):８５９－８６４　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．３９６９/j．issn．１０００Ｇ３１４２．２０１３．０６．０２５
邓一飞,张露娜,吴宜成,等．培养基成分和培养时间对匍匐翦股颖植株再生的影响[J]．广西植物,２０１３,３３(６):８５９－８６４
DengYF,ZhangLN,WuYC,etal．Effectsofmediumcomponentsandsubcultureperiodonplantletregenerationofcreepingbentgrass[J]．Guihaia,
２０１３,３３(６):８５９－８６４
培养基成分和培养时间对匍匐翦股颖植株再生的影响
邓一飞,张露娜,吴宜成,陈　沁,邓志瑞
(上海大学 生命科学学院,上海２００４４４)
摘　要:以匍匐翦股颖成熟种子为外植体,研究了培养基２,４ＧD浓度、２,４ＧD和６ＧBA组合配比、蔗糖浓度对匍
匐翦股颖愈伤组织诱导的影响以及愈伤组织再生过程中继代时间、６ＧBA浓度、蔗糖浓度对愈伤组织分化的影
响.结果表明:在 MS培养基上,２mg􀅰LＧ１２,４ＧD和０．１mg􀅰LＧ１６ＧBA的组合最利于愈伤组织的诱导,诱导率
高达９４％.蔗糖浓度为３０g􀅰LＧ１时愈伤组织诱导率最高,为８２％;在再生过程中,当６ＧBA浓度为１mg􀅰LＧ１
时分化率最高(６２％),蔗糖浓度为４０g􀅰LＧ１时,愈伤组织分化率最高(５２％).经过２次继代培养的愈伤组织
(外植体放到培养基后４０天)的分化率为最高(７１％),随着继代次数增多,分化率逐渐降低,在经过５次继代
后(培养１００d)分化率仅有１８％.
关键词:匍匐翦股颖;愈伤组织;２,４ＧD;６ＧBA;继代培养
中图分类号:S６８８．４　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１３)０６Ｇ０８５９Ｇ０６
Effectsofmediumcomponentsandsubcultureperiod
onplantletregenerationofcreepingbentgrass
DENGYiＧFei,ZHANGLuＧNa,WUYiＧCheng,CHENQin,DENGZhiＧRui
(SchoolofLifeSciences,ShanghaiUniversity,Shanghai２００４４４,China)
Abstract:Matureseedsofcreepingbentgrasswereusedasexplantstostudytheefectsof２,４ＧDconcentration,comＧ
binationof２,４ＧDand６ＧBA,andsucroseconcentrationoncalusinductionandtheefectsofsubculturetime,６ＧBA
concentration,sucroseconcentrationonplantletregeneration．Theresultsshowedthatcombinationof２mg􀅰LＧ１２,４Ｇ
Dand０．１mg􀅰LＧ１６ＧBAproducedthebestresultwith９４％calusinductionrate,and３０g􀅰LＧ１sucrosegavethebest
result,calusinductionratebeing８２％．Duringregenerationprocess,１mg􀅰LＧ１６ＧBAcouldbringthebestdiferentiaＧ
tionfrequency(６２％)and４０g􀅰LＧ１sucroseresultedinthehighestplantletregenerationfrequency(５２％)．Thecalus
afterthesecondtimesubculture(４０dafterexplantswerelaidonmedium)gavethehighestdiferentiationfrequency
(７１％)whichbegantodeclineassubcultureprolonged．Afterthefifthtimesubculture(１００d),only１８％diferentiaＧ
tionfrequencywasobtained．
Keywords:creepingbentgrass;calus;２,４ＧD;６ＧBA;subculture
　　匍匐翦股颖(creepingbentgrass)又名匍茎剪股
颖,为多年生禾本科翦股颖属植物,是最抗寒的冷季
型草坪草之一.由于它喜冷凉湿润气候、耐潮湿寒
冷能力强、并有出苗均匀、叶片细密等优点,已被世
界各国广泛用于建植高档观赏型草坪和运动型草
坪,如城市中心广场、高尔夫球场的果岭草坪和保龄
收稿日期:２０１３Ｇ０８Ｇ０８　　修回日期:２０１３Ｇ０９Ｇ２２
基金项目:上海市教育委员会科研创新项目暨上海大学创新基金(A．１０Ｇ０１１２Ｇ１０Ｇ００４)
作者简介:邓一飞(１９８８Ｇ),男,山东枣庄人,硕士研究生,生物化学与分子生物学专业,(EＧmail)woshidengyifei＠１２６．com.
∗通讯作者:邓志瑞,博士,副教授,研究方向为植物生理与分子生物学,(EＧmail)dengzhirui＠staff．shu．edu．cn.
球场等(安惠惠等,２０１２).但由于地理生态条件的
差异和环境污染,匍匐翦股颖的生长在我国广大地
区表现出许多不尽人意的地方,如抗病虫害能力差、
耐旱性差、磨性低、受到重金属离子的毒害,严重时
甚至导致草坪建植失败(曾泉等,２００６),因此,有必
要对匍匐翦股颖品种进行抗性改良.
现代遗传工程技术是当前最有效的育种方法之
一,在良好的植物受体系统建立(陈智勇等,２００６;柴
明良,２００２;张振霞等,２００７)后,通过外源基因的引
入,能够拓展遗传改良的范围,解决一些常规育种难
以解决的特殊问题.目前已有许多禾本科草坪草采
用不同外植体进行离体再生的研究成果(马彩云等,
２０１０;王培佳等,２００９;李红民,２００９;邵宏波,１９９２),
但是尚未有对潘娜四号匍匐翦股颖的诱导及再生条
件进行全面系统研究的报道.本文拟通过探究２,
４ＧD浓度、２,４ＧD和６ＧBA浓度配比、蔗糖浓度对匍
匐翦股颖愈伤组织诱导及继代时间、６ＧBA浓度、蔗
糖浓度对愈伤组织分化的影响,建立高效的匍匐翦
股颖再生体系,为进一步利用转基因技术培育出优
良匍匐翦股颖新品种提供研究基础.
１　材料与方法
１．１材料
组培外植体为匍匐翦股颖PennAＧ４品种的成
熟种子,由上海交通大学王兆龙老师惠赠.
愈伤组织诱导培养基１:配制含有不同浓度的
２,４ＧD的 MS基本培养基(Murashigeetal．,１９６２),
２,４ＧD浓度分别为１,２,３,４,５,６,７mg􀅰LＧ１,其他成
分皆为３０g􀅰LＧ１蔗糖,１０g􀅰LＧ１琼脂粉,１０mmol􀅰
LＧ１脯氨酸,５００mg􀅰LＧ１水解酪蛋白,pH为５．８.
愈伤组织诱导培养基２:配制含有不同浓度的
２,４ＧD和不同浓度的６ＧBA组合的 MS基本培养基,
２,４ＧD浓度分别为１．０,２．０,３．０,４．０mg􀅰LＧ１,６ＧBA
的浓度分别为０．０,０．１,０．２,０．５mg􀅰LＧ１,其他成分
与诱导培养基１相同,pH为５．８.
愈伤组织诱导培养基３:在确定最佳２,４ＧD和
６ＧBA浓度组合后,保持其浓度不变,配制蔗糖浓度
分别为１０,２０,３０,４０,５０,６０,７０,８０g􀅰LＧ１的愈伤组
织诱导培养基.
愈伤组织继代培养基:在确定最佳蔗糖浓度后,
保持蔗糖浓度不变,其他成分与愈伤组织诱导培养
基３相同.
分化培养基１:配制含有不同浓度６ＧBA的 MS
基本培养基,６ＧBA浓度依次为０,１,２,３mg􀅰LＧ１,
其他成分皆为２００mg􀅰LＧ１肌醇,３０g􀅰LＧ１蔗糖,１０
g􀅰LＧ１琼脂粉,pH为５．８.
分化培养基２:在确定最佳６ＧBA浓度后,保持
其浓度不变,配制蔗糖浓度分别为１０,２０,３０,４０,
５０,６０g􀅰LＧ１的愈伤组织分化培养基.
以上培养基均需１２１℃,２０min高温高压灭菌.
１．２方法
１．２．１种子灭菌　参照曾泉等(２００６)的方法,种子先
用７０％乙醇浸泡５min,无菌水清洗３次,再用１０％
(V/V)次氯酸钠灭菌２０min,无菌水清洗５次.
１．２．２２,４ＧD对愈伤组织诱导的影响　灭菌后的种
子接种到含有不同浓度２,４ＧD的愈伤组织诱导培养
基１上,每浓度５个重复,每重复接种４０~５０粒种
子.２５℃暗培养,３０d后统计愈伤组织诱导率和愈
伤组织平均重量．
愈伤组织诱导率(％)＝产生愈伤数/接种种子
数×１００％
愈伤组织平均重量(mg)＝愈伤组织总重量
(mg)/产生愈伤数
１．２．３２,４ＧD和６ＧBA浓度配比对愈伤组织诱导的影
响　灭菌后的种子接种到愈伤组织诱导培养基２
上,共有１６个浓度组合,每组合５个重复,每重复接
种４０~５０粒种子.２５℃暗培养,３０d后统计愈伤
组织诱导率.
１．２．４蔗糖浓度对愈伤组织诱导的影响　灭菌后的
种子接种到含有不同浓度蔗糖的愈伤组织诱导培养
基３上,每浓度５个重复,每重复接种４０~５０粒种
子.２５℃暗培养,３０d后统计愈伤组织诱导率.
１．２．５诱导时间对愈伤组织分化的影响　自接种日
起,每２０天继代１次,每次同一愈伤组织一分为二,
分别接入继代培养基和分化培养基,共继代５次,每
次３０d后统计愈伤组织分化率.
愈伤组织分化率(％)＝有芽形成的愈伤数/接
种愈伤数×１００％
１．２．６６ＧBA浓度对愈伤组织分化的影响　愈伤组织
转接到含有不同浓度６ＧBA的分化培养基１上,每
浓度５个重复,光照培养,诱导愈伤分化,３０d后统
计愈伤组织分化率.
１．２．７蔗糖浓度对愈伤组织分化的影响　愈伤组织
转接到含不同浓度蔗糖的分化培养基２上,每浓度
５个重复,光照培养,３０d后统计愈伤组织分化率.
０６８ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３３卷
１．３数据差异显著性分析
实验数据分析采用SPSS分析软件,Duncan多
重比较法,５％水平差异.
２　结果与分析
２．１不同浓度２,４ＧD对愈伤组织诱导的影响
种子接种于含有不同浓度２,４ＧD的诱导培养基
上,３０d后统计愈伤组织诱导率,愈伤组织平均重
量,如图１:A,B所示.
由图１:A可以看出,２,４ＧD浓度为２mg􀅰LＧ１
时,愈伤组织诱导率最高,为７３％.随着２,４ＧD浓
度的增加,诱导率有所下降.浓度为６mg􀅰LＧ１时,
也能得到较高的愈伤组织诱导率,为６６％,但是与
２,４ＧD浓度为２mg􀅰LＧ１时相比,下降了７％,并且
愈伤平均重量为６．１３mg,也低于２mg􀅰LＧ１时的
６．９９mg,因此选择２mg􀅰LＧ１的２,４ＧD浓度作为愈
伤组织诱导的适宜浓度.
图１　不同２,４ＧD浓度下匍匐翦股颖愈伤组织　A．诱导率;B．平均重量.不同小写字母表示０．０５水平差异显著.下同.
Fig．１　Creepingbentgrassatdifferent２,４ＧDconcentrations　A．Calusinductionrate;B．Calus’average
weight．ThenormallettersmeansignificantdifferencesatP＝０．０５．Thesamebelow．
２．２２,４ＧD和６ＧBA浓度配比对愈伤组织诱导的影响
由２,４ＧD和６ＧBA配成的１６种浓度组合(表１)
显示,２．０mg􀅰LＧ１２,４ＧD和０．１mg􀅰LＧ１６ＧBA组合
处理后愈伤组织诱导率最高,为９４％;其次是３．０
mg􀅰LＧ１２,４ＧD和０．１mg􀅰LＧ１６ＧBA组合,该处理下
的愈伤组织诱导率为８８％;再次是４．０mg􀅰LＧ１２,４Ｇ
D和０．１mg􀅰LＧ１６ＧBA 组合,愈伤组织诱导率为
８２％.这一现象和２．１结论一致,２．０mg􀅰LＧ１的２,
４ＧD浓度可以作为愈伤组织诱导的适宜浓度.从表
１中还可看出当２,４ＧD浓度不变时,诱导率随６ＧBA
浓度的变化而呈“抛物线”变化,并在浓度为０．１mg􀅰
LＧ１时达到最高;另外还可看出当２,４ＧD和６ＧBA浓
度较高时均不利于愈伤组织诱导.
２．３蔗糖浓度对愈伤组织诱导及分化的影响
由图２:A可见,随着蔗糖浓度的升高,愈伤组
织的诱导率也逐渐升高,当蔗糖浓度在３０~５０g􀅰
LＧ１范围内,诱导率较高,其中３０g􀅰LＧ１最为显著,高
达８２％;之后随着浓度的升高,从变化总趋势来看,
诱导率开始缓慢下降.在分化过程中,愈伤组织对
蔗糖浓度的要求较为苛刻,４０g􀅰LＧ１的蔗糖效果最
表１　２,４ＧD和６ＧBA浓度配比对匍匐翦股颖
愈伤组织诱导的影响
Table１　Effectsofcombinationsof２,４ＧDand６ＧBA
oncalusinductionofcreepingbentgrass
２,４ＧD＋６ＧBA
(mg􀅰LＧ１)
接种种子数
(个)
Seednumber
愈伤组织数
(个)
Calusnumber
诱导率 (％)
Calus
inductionrate
标准差
Standard
deviation
１．０＋０．０ ２４０ １７１ ７１ ８
１．０＋０．１ １９４ １４８ ７６ １２
１．０＋０．２ ２８１ １８１ ６４ ６
１．０＋０．５ ２９１ １３７ ４７ １２
２．０＋０．０ ３３０ ２４９ ７５ １
２．０＋０．１ ２１１ １９９ ９４ ２
２．０＋０．２ １６９ １２４ ７３ ５
２．０＋０．５ ２８３ １６０ ５７ １２
３．０＋０．０ ４０８ ３１９ ７８ ５
３．０＋０．１ ２８０ ２４５ ８８ ２
３．０＋０．２ ５２５ ３５２ ６７ ２
３．０＋０．５ ２９６ １８７ ６３ ９
４．０＋０．０ ６８４ ５１１ ７５ １２
４．０＋０．１ ４９４ ４０７ ８２ ５
４．０＋０．２ ４３９ ２９０ ６６ １０
４．０＋０．５ ３６３ ２１３ ５９ ７
好(５２％),比两侧浓度(１０~３０,５０~６０g􀅰LＧ１)分
别高出１４,１９个百分点.其原因可能是蔗糖除了提
１６８６期　　　　　　　　邓一飞等:培养基成分和培养时间对匍匐翦股颖植株再生的影响
图２　不同蔗糖浓度下匍匐翦股颖愈伤组织　A．诱导率;B．分化率.
Fig．２　Frequenciesofcreepingbentgrassatdifferentsucroseconcentrations　
A．Calusinductionrate;B．Calusregenerationfrequency．
供愈伤生长的碳源外,还影响到培养基的渗透压,从
而对愈伤组织的生长产生了综合影响.
２．４继代时间对愈伤组织分化的影响
本实验测定了不同诱导时间下愈伤组织的分化
率,结果如图３所示:随着继代培养时间的延长,匍
匐翦股颖愈伤组织分化率先升后降,诱导４０d的愈
伤,分化率最高,可达７１％;诱导生长１００d的愈伤,
分化率下降显著,为１８％,仅为４０d时的１/４.
图３　继代培养不同时间后的匍匐翦股颖愈伤组织分化率
Fig．３　Embryoniccalusregenerationfrequenciesofcreeping
bentgrassaftersubculturefordiferenttimes
２．５６ＧBA浓度对愈伤组织分化的影响
愈伤组织在含有不同浓度的６ＧBA的分化培养
基上生长３０d后,分化率统计结果如图４.从图４
看出,当６ＧBA浓度为１mg􀅰LＧ１时,愈伤组织分化
率最高,可达６２％;浓度为２mg􀅰LＧ１、３mg􀅰LＧ１时
的分化率与无６ＧBA时并无明显区别,甚至略有降
低.因此选择１mg􀅰LＧ１的６ＧBA浓度作为分化适
宜的浓度.
图４　不同６ＧBA浓度下匍匐翦股颖愈伤组织分化率
Fig．４　Embryoniccalusregenerationfrequenciesofcreeping
bentgrassatdiferent６ＧBAconcentrations
３　结论与讨论
不同植物种子对不同消毒剂有不同的耐受能
力.灭菌时间短,灭菌不完全,种子极易染菌;灭菌
时间过长,虽然灭菌效果好,但外植体生长发育潜力
会受到抑制,不利于愈伤组织的诱导.一般来说,能
发芽的种子,在牙尖基部都能产生愈伤组织,可能是
因为出芽使种子产生伤口,从而有利于愈伤组织的
诱导;再者,种子能发芽,说明本身具有较大的生长
发育潜力.因此在组培实验中,选择合适的灭菌时
间和强度十分重要.我们参照曾泉等(２００６)的方
法,种子用１０％(V/V)次氯酸钠进行表面消毒,时
间分别为１０、２０、３０、４０、５０min,把种子发芽率高低
作为外植体组织发育潜力保留多少的一个指标.结
果表明,种子发芽率随灭菌时间的延长先升后降,２０
２６８ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３３卷
min就可以达到较好地灭菌效果,同时保证种子较
高的发芽率(８１％,未发表资料).
诱导外植体产生愈伤组织时最常用的植物生长
物质为２,４ＧD,利用２,４ＧD对其体内生长素水平的
调整和平衡,启动细胞分裂和胚早期发育(孙在红
等,２００４),因此,大多情况下,只用２,４ＧD就可成功
诱导外植体产生愈伤组织,如高羊茅(梁蕊芳等,
２００５)、早熟禾(张文君等,２０１０)、黑麦草(刘文真等,
２００４)、结缕草(马彩云等,２０１０)、冰草(解继红等,
２００６)、羊草(邹吉祥,２０１２;刘公社等,２００４)、小麦
(王辉等,２０１１)等.但当２,４ＧD浓度达到一定水平
时,愈伤组织诱导率开始下降(梁蕊芳等,２００５;刘公
社等,２００４),且培养细胞和组织发生突变的几率也
增大(刘文真等,２００４).本实验结果也表明,当２,
４ＧD浓度为２mg􀅰LＧ１时,诱导效果较好.随着２,４Ｇ
D浓度的增加,愈伤诱导率开始降低,与已发表的结
果一致.本实验中６mg􀅰LＧ１的２,４ＧD也能得到较
好的诱导效果,这可能与生物组织差异或者个体差
异有关.这一点与吴翔等(２００９)报道的一致,但他
们研究发现,在６mg􀅰LＧ１的２,４ＧD浓度下,愈伤组
织会出现水渍化现象.２,４ＧD与其他植物生长物质
配合使用,更有利于愈伤组织的诱导(解继红等,
２００６;Baietal．,２００１;王培佳等,２００９).本实验发
现,２mg􀅰LＧ１的２,４ＧD和０．１mg􀅰LＧ１的６ＧBA组合
的培养基愈伤组织诱导率最高,可达９４％,比不含
６ＧBA时(７５％)高出近２０％,表明生长素与细胞分
裂素的绝对浓度及其比例影响着愈伤组织的诱导
(王培佳等,２００９).
作为外源植物生长物质,６ＧBA能改善细胞内源
生长素和细胞分裂素的比例,调节细胞生理生化状
态,使得细胞处于一个良好的状态,有利于胚性愈伤
组织的发生,从而增加分化频率(李红民,２００９;钟华
鑫等,１９９１).本实验中当６ＧBA浓度为１mg􀅰LＧ１
时,分化率最高,为６２％.
蔗糖是组织培养中最常用的糖类(王刚等,
２００７;赵永英等,２００７).Dalton& Thomas(１９９２)
的实验表明,在培养基中加入凝胶和碳水化合物,能
明显提高多花黑麦草胚性愈伤组织的形成.ZaghＧ
mout&Torelo(１９９２)发现紫羊茅植株再生能力随
着培养基中蔗糖浓度的增加逐渐增强,在不含植物
生长物质的１/２MS和B５继代培养基中加入高浓度
的蔗糖,有利于获得再生植株.糖类不仅为外植体
提供能量,而且是外植体渗透环境的主要调节者.
本实验发现,蔗糖浓度为３０g􀅰LＧ１时愈伤组织效果
诱导最好,而在分化培养基中４０g􀅰LＧ１的蔗糖愈伤
分化率最高,同一种材料在不同的培养时期对蔗糖
浓度要求也是不同的.
继代培养时间对愈伤组织的生长状态和分化能
力有极大影响.随着继代时间的延长,愈伤组织质
地明显变差,出现水渍化、褐化、老化现象,发生变异
的几率也增大;同时对愈伤的分化能力产生显著影
响.继代初期愈伤组织分化能力较低是诱导的愈伤
组织由于刚经历去分化状态,细胞的内源激素尚处
于调整阶段,细胞生长还不是很旺盛,易受到伤害,
因而不宜立即使用,需继代培养.经过２次的继代
培养,愈伤组织的质量得到提高,分化率也随之增
加.但长时期的继代培养,又会导致愈伤组织的分
化能力下降.合适的继代时间是非常必要的,因为
转化后的受体细胞需要较长时间的继代筛选(通常
为６~８周)才能转入分化培养基上进行分化培养,
若在这段时期内受体细胞的分化能力明显下降,则
会严重影响其转化效果(李红民,２００９).因此,作为
植物遗传转化的受体细胞,应能在离体培养条件下,
在较长时间内保持较高的分化能力,越长越好.
本文有关结果为匍匐翦股颖高效离体再生体系
的建立提供了依据,同时也为将来利用现代遗传工
程技术培育优良的匍匐翦股颖新种质奠定了基础.
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４６８ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３３卷