全 文 ：广 西 植 物 Guihaia Jul． 2013，33(4) :449－455 http:/ / journal． gxzw． gxib． cn
DOI:10． 3969 / j． issn． 1000-3142． 2013． 04． 004
欧阳蒲月，刘永亮，梁永枢，等． 广藿香八氢番茄红素合成酶 PcPSY1基因克隆和序列分析［J］． 广西植物，2013，33(4) :449－455
Ouyang PY，Liu YL，Liang YS，et al． Cloning and sequential analysis of phytoene synthase (PcPSY1)gene in Pogostmen cablin［J］． Guihaia，2013，
33(4) :449－455
广藿香八氢番茄红素合成酶 PcPSY1基因克隆和序列分析
欧阳蒲月1，刘永亮2，梁永枢1，曾少华3，莫小路4*
(1． 广东食品药品职业学院，广州 510520;2． 中国科学院 武汉植物园，武汉 430074;
3． 中国科学院 华南植物园，广州 510650;4． 广东省中药研究所，广州 510520 )
摘 要:根据已获得的广藿香转录组数据中的 PSY 转录本序列，利用 Primer 3 在线设计基因全长扩增引物，
采用 ＲT-PCＲ方法获得广藿香的八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase，PSY)基因。并利用在线分析平台和
生物软件对该其因进行生物信息学分析。获得的广藿香 PSY1 基因长 1 550 bp，编码 439 个氨基酸，命名为
PcPSY1，GenBank登录号为 KC862310;预测了 PcPSY1 编码蛋白的结构与功能，且基于 PSY基因利用 NJ法构
建了与 21 个不同物种间的进化树，进化树表明广藿香 PcPSY1基因与桂花的 PSY序列亲缘关系最近。成功克
隆并分析广藿香 PcPSY1基因的全长序列，为进一步阐明广藿香萜类代谢途径奠定基础。
关键词:广藿香;八氢番茄红素合成酶;PcPSY1 基因;基因克隆;生物信息学分析
中图分类号:Ｒ931 文献标识码:A 文章编号:1000-3142(2013)04-0449-07
Cloning and sequential analysis of phytoene synthase
(PcPSY1)gene in Pogostmen cablin
OUYANG Pu-Yue1，LIU Yong-Liang2，LIANG Yong-Shu1，
ZENG Shao-Hua3，MO Xiao-Lu4*
(1． Guangdong Food and Drug Vocational College，Guangzhou 510520，China;2． Wuhan Botanical Garden，Chinese Academy
of Sciences，Wuhan 430074，China;3． South China Botanical Garden，Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510650，
China;4． Guangdong Ｒesearch Institute of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510520，China )
Abstract:Phytoene synthase (PSY)is a key enzyme in plant terpenoid biosynthetic pathway． According the transcrip-
tome dataset of Pogostmen cablin，one unique sequence encoding PSY was discovered． The primers were designed ac-
cording to the transcript sequence of PcPSY1 from the P． cablin transcriptome dataset with Primer 3 online． The open
reading frame of PcPSY1 was cloned using ＲT-PCＲ strategy． The cDNA named as PcPSY1 contains a 1 550 bp open
reading frame and encodes a predicted protein of 439 amino acids． The GenBank accession number for this gene is
KC862310． PcPSY1 has no signal peptide． PcPSY1 is highly homologous to other PSY protein in 21 different species and
is more related to that from Osmanthus fragrans． This study cloned and analyzed mechanism of terpenoid biosynthesis in
Pogostemon cablin plants．
Key words:Pogostemon cablin;phytoene synthase;PcPSY1;gene cloning;bioinformatical analysis
收稿日期:2013-04-01 修回日期:2013-06-15
基金项目:广东省科技厅粤港关键领域重点突破项目(2009A03090101) ;广州市科技计划基础研究项目( ［2013］4100076) ;广东食品药品职业
学院课题(2012y2002)
作者简介:欧阳蒲月(1978-) ，女，湖南邵阳人，硕士，讲师，从事生物技术与药用植物资源研究，(E-mail)ouyangpy@ gdyzy． edu． cn。
* 通讯作者:莫小路，博士，教授，从事药用植物资源研究，(E-mail)moxl@ gdyzy． edu． cn。
类胡萝卜素是一系列呈现黄色、橙色和红色的
萜类色素物质，存在于所有的光合器中并具有抗氧
化的特性，但动物体内不能直接合成类胡萝卜素，必
须从食物中摄取。八氢番茄红素合成酶(phytoene
synthase，PSY)主要在质体中，是类胡萝卜素生物合
成途径的第一个酶(Zhu et al．，2007)。目前已证
实，在番茄果实(Fraser et al．，2002)、油菜种子(Pal-
aisa et al．，2003)、薯块茎(Ducreux et al．，2005)、拟
南芥种子(Lindgren et al．，2003)、龙胆花瓣(Zhu et
al．，2002)和玉米胚乳(Li et al．，2008)中，PSY 是类
胡萝卜素生物合成中的限速酶。
广藿香(Pogostemon cablin)为唇形科剌蕊草属
植物，是中国药典收录的重要药用植物之一，以全草
入药。味辛，性微温，归脾、胃、肺经。广藿香原产于
菲律宾、马来西亚、印度等国家，自宋代传入我国已
有 1000 余年历史(吴友根等，2007) ，是“藿香正气
丸(水)”、“抗病毒口服液”等中成药以及大量医药、
香料和化妆品的主要原料。广藿香的功效成分主要
为萜类化合物和黄酮类化合物(Hu et al．，2006;
Sundaresan et al．，2009)。广藿香提取物中的萜类
化合物杀锥虫(Kiuchi et al．，2004)、具有杀螨(Wu
et al．，2012)、抗流感病毒(Kiyohara et al．，2012)等
活性。
由于 PSY是植物类胡萝卜素生物合成途径中一
个限速酶(图 1) ，所以由 GGPP 生成八氢番茄红素这
图 1 PSY在类胡萝卜素合成中的位置
Fig． 1 Positions of the PSY gene in carotenoid synthesis
一步骤已成为类胡萝卜素代谢途径的“瓶颈”(朱长
甫等，2004)。但广藿香 PSY 的克隆与蛋白结构和
功能方面的研究尚未见报道。本研究组在前期研究
中获得大量的广藿香转录组信息，从中发现了可能
参与萜类化合物中 PSY 基因信息。对广藿香的
PcPSY基因进行克隆及生物信息学分析，为阐明广
藿香的萜类化合物生物合成途径奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
本实验材料采自于广东食品药品职业学院药用
植物标本园广藿香栽培地。选取海南广藿香展开幼
叶及成熟黄褐色叶，迅速放入装有液氮的保温瓶中，
后置于-75 ℃冰箱保存备用。
1． 2 总 ＲNA 的提取
取-75 ℃保存的幼叶及成熟叶，在 180 ～ 200 ℃
烘烤过的研钵中用液氮将其充分研磨，迅速倒入
DEPC处理过的离心管中，待液氮挥发后，按 1 mL
试剂 /100 mg 材料的比例加入适量的 Trizol，下面的
步骤按说明书(ＲNA提取试剂盒 TIANGEN DP421)
进行。电泳检测总 ＲNA 的质量，并用紫外分光光度
计(NANODＲOP 2000c)测定总 ＲNA 的浓度和纯度。
1． 3 PcPSY基因全长的获得
1． 3． 1 第一链 cDNA 的合成 初始反应体系的建
立:Oligo dT(20 pmol /μL，广州凯基生物有限公司)2
μL;ＲNA 10 μL(嫩叶及老叶 ＲNA 各 5 μL) ;
dNTPmix (25 umol /L)2 μL;ＲNase-free ddH2O 12
μL，将反应体系于 65 ℃变性 5 min，取出后置于冰
上 1 min以上，向初始反应体系中加入下列试剂:5×
first-strand buffer 8 μL;0． 1 mol /L DTT 4 μL;Super-
script III反转录酶(200 u /μL) (Life 公司)2 μLH2O
2 μL，再将总反应体系于 42 ℃ 50 min，70 ℃ 15
min，于 PCＲ仪上，进行第一链 cDNA 的合成。反转
录产物 cDNA可在-20 ℃保存。
1． 3． 2 基因克隆 反应体系:3 μL 的第一链 cDNA
(反转录产物稀释 10 倍)为模板;2． 5 μL LA PCＲ
buffer;2 μL 正向及反向特异引物 (10 mmol /
L) ;0． 25 μL LA Taq DNA聚合酶(大连宝生物工程
有限公司) ;用无菌去离子水将体系补至 25 μL。
PCＲ反应条件:94 ℃变性 5 min;94 ℃变性 30 s，57
℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min 30 s，30 个循环;72 ℃
延伸 10 min。结果检测:取 PCＲ 产物 5 μL，用 1%
琼脂糖电泳检测。
1． 3． 3 PCＲ回收产物的纯化、连接、转化、克隆、测序
将上述 PCＲ 产物割胶，使用 Axygen 公司凝胶回
收试剂盒过柱回收。回收程序依据试剂盒提供方法
进行。各取 4． 5 μL 回收产物，克隆到 PMD19-T 载
体过夜连接。将连接产物转入 DH-5α 大肠杆菌感
054 广 西 植 物 33 卷
受态细胞，经涂布培养，在氯苄抗性平板上进行阳性
克隆筛选，各取 4 ～ 8 个进行菌液 PCＲ验证，后各取
2 个阳性克隆进行双向测序(广州中美泰和生物技
术有限公司)。
1． 3． 4 序列的生物信息学分析 先将所测得的序列
在 NCBI 数据库中进行 BLAST 搜索，初步确定这些
基因的类别。使用 OＲF Finder (http:/ /www． ncbi．
nlm． nih． gov /projects /gorf /)进行开放阅读框预测，
再进行 PcPSY基因的一系列分析:其编码蛋白的理
化性质预测采用 ExPASy Proteomics Server提供的在
线工具 Protparam (http:/ /www． expasy． ch / tools /pro-
tparam． html) ;PcPSY蛋白质结构搜索分别采用在线
工具 ExPASy PＲOSITE (http:/ /www． expasy． ch /
prosite /)和美国国立生物技术信息中心(NCBI)在
线工具(http:/ /www． ncbi． nlm． nih． gov /Structure /
cdd /wrpsb． cgi)。使用 SignalP4． 0Server进行分泌蛋
白 预 测 (http:/ /www． cbs． dtu． dk /services /
SignalP /) ;利 用 ( http:/ /wolfpsort． org /)
WOLFPSOＲT 进行蛋白定位信号预测;用 http:/ /
web． expasy． org /protscale 分析氨基酸序列 /疏水性
分析;http:/ /www． cbs． dtu． dk /services /TMHMM/检
测跨膜结构，使用 InterProScan (http:/ /www． ebi．
ac． uk /Tools /pfa / iprscan /)进行蛋白保守结构域搜
索。 采 用 SWISS-MODEL (http:/ / swissmodel．
expasy． org /)进行蛋白质二级结构分析。采用
MEGA5． 1 软件中内置的 NJ法进行构建进化树。所
有软件如无特殊说明，均采用默认参数。
2 结果与分析
2． 1 广藿香 ＲNA的提取
通过普通琼脂糖电泳检测ＲNA，结果如图2:a所
示(H1为嫩叶，H2 为老叶)。28 S，18 S 的两条带清
晰，其中 28 S ＲNA亮度约为 18 S ＲNA的两倍，说明
图 2 凝胶电泳 a． ＲNA提取普通琼脂糖电泳检测图;b． PcPSY1 阳性克隆检测结果;c． PcPSY1 PCＲ产物。
Fig． 2 Gel electrophoresis a． Total ＲNA from Pogostemon cablin;b． PcPSY1 PCＲ product;c． PcPSY1 positive clone test results．
运用该方法所提取的广藿香叶片总 ＲNA完整性好，
几乎无降解。用紫外分光光度计 NANODＲOP
2 000 c 检测，H1 的 A260、A280 吸收值分别为 1．
80、0． 41，浓度为 230 ng /μL;H2 的 A260、A280 吸收值
分别为 1． 93、0． 99，浓度为 563． 3 ng /μL。
2． 2 PcPSY1 基因的克隆
根据广藿香转录组中长为 1 749 bp 的 Uni-
gene9035 phytoene synthase 序列，利用 OＲF 阅读框
根据 PＲIMEＲ3 在线设计引物:正向引物(PSY15’-
TTGGGTTGTTCCAAAAGTGA-3’)、反向引物(PSY2
5’-AAGTGAAGGATGCCCACTACA -3’) ，以广藿香
老叶 ＲNA与嫩叶 ＲNA进行混合，以混合 ＲNA为模
板进行逆转录获得 cDNA 序列，利用 ＲT-PCＲ 扩增
得到一条 1 500 bp 左右的条带，对于扩增所得条带
进行回收、连接、转化、阳性克隆检测后进行测序后
获得一条 1 550 bp的正确序列(图 2:c) ，利用 NCBI
的 OＲF Finder预测该序列含有一个完整的开放总
计框，长 1 550 bp，编码 439 个氨基酸，并与其它 3
个物种的 PSY 编码蛋白进行了比较(图 3，图 4)。
将该 基 因 命 名 为 PcPSY1，GeneBank 登 录 号
为 KC862310。
2． 3 PcPSY1 基因编码蛋白特性分析
2． 3． 1 理化性质 PcPSY1 预测编码 569 个氨基酸，
利用 ExPASy PＲOSITE 对 PcPSY1 基因编码蛋白的
理化性质进行预测分析。推测 PcPSY1 的分子式为
C2196H3477N605O646S17，总分子量为 49． 26 KD，等电
1544 期 欧阳蒲月等:广藿香八氢番茄红素合成酶 PcPSY1 基因克隆和序列分析
图 3 PcPSY与来源于其它三个物种 PSY基因的蛋白序列比对图
桂花(AFK66771． 1)、烟草(ADK25054． 1，ADZ24219． 1)、中粒咖啡(ABA43898． 1)。
Fig． 3 Multi-alignment of PcPSY and other PSY proteins (made by MEGA5． 10)
Osmanthus fragrans(AFK66771． 1) ，Nicotiana tabacum(ADK25054． 1，ADZ24219． 1) ，Coffea canephora(ABA43898． 1)．
图 4 PcPSY全长 cDNA序列及其推导氨基酸序列
Fig． 4 Full-length cDNA and deduced amino acids sequence of PcPSY
点为 8． 82;带负电残基(Asp+Glu)为 52，正电残基
(Arg+Lys)为 58。该蛋白的不稳定系数为 50． 61，脂
肪系数为 90． 02，亲水性系数为-0． 206。
2． 3． 2 PcPSY1 的二级结构预测 对 PcPSY1 基因编
254 广 西 植 物 33 卷
图 5 PSY基因编码蛋白的二级结构预测
Fig． 5 Secondary structure prediction of PSY gene encoding protein
码蛋白的二级结构进行预测(图 5) ，可见无规则卷
曲(L /C)所占比例较多，α-螺旋结构(H)与 p 片层
(E)结构所占比例相当。
2． 3． 3 PcPSY1 跨膜区预测与蛋白定位信号预测
用 TMHMM 预测 PcPSY1 酶蛋白，发现其部分肽链
位于细胞膜上，跨膜区较明显的位置在 216 ～ 313 aa
处。用WOLFSOＲT预测表明 PcPSY1 最可能定位在
叶绿体中(Chlo:10． 0 nucl:1． 0 cyto:1． 0 mito:1． 0)。
由此可推断该酶发挥功能的部位可能结合于生物
膜上。
2． 3． 4 疏水性分析 应用 protscale 预测对八氢番茄
红素脱氢酶蛋白的氨基酸序列 /疏水性分析的结果
表明，PcPSY1 多肽链第 5 位的亮氨酸具有最高的分
值 2． 467，疏水性最强;第 55 位的赖氨酸具有最低
的分值-3． 089，亲水性最强。整个来看，其亲水性氨
基酸多于疏水性氨基酸，为亲水蛋白(图 7)。
2． 3． 5 PcPSY1 结构域分析 通过 Prosite 数据库分
析该蛋白质的结构位点，发现 263 ～ 278 以及 299 ～
324 为鲨烯合酶和八氢番茄红素合成酶特异识别区
图 6 PcPSY酶蛋白跨膜区分析
Fig． 6 Transmembrane region analysis of PSY gene protein
域。鲨烯合酶和八氢番茄红素合成酶的功能相似，
具有 3 个相同的保守域，而 263 ～ 278 以及 299 ～ 324
区域是位于鲨烯合酶和八氢番茄红素合酶酶活中心
的 2 个保守结构域(图 8)。
2． 3． 6 PcPSY1 基因系统进化 从 NCBI 数据库中
NCBI的非冗余蛋白数据库(Nr)中选取与 PcPSY1
3544 期 欧阳蒲月等:广藿香八氢番茄红素合成酶 PcPSY1 基因克隆和序列分析
图 7 PSY酶蛋白疏水性分析
Fig． 7 Hydrophobicity profile of PSY protein
基因编码蛋白相似性较高的 22 条蛋白序列，采用
MEGA5． 10 软件，内置的 NJ法进行构建进化树。结
果(图 9)表明:已克隆到的广藿香 PcPSY1 基因与桂
花(Osmanthus fragrans AFK66771． 1)的 PSY 序列同
源性最高，与烟草(ADK25054． 1、ADZ24219． 1)、观
赏烟 (Nicotiana langsdorffii × Nicotiana sanderae
ABB29857． 1 )、番 茄 (Solanum lycopersicum
ABＲ57229． 1、NP _ 001234812． 1)、中 粒 咖 啡
(ABA43898． 1 )、栀 子 (Gardenia jasminoides
AEF59491． 1)、烟 草 属 (Ipomoea sp． Kenyan
BAI47572． 1)、黄龙胆(Gentiana lutea ABN04109．
1、ABN04108． 1)、宁 夏 枸 杞 (Lycium barbarum
AAW88383． 1)等植物的亲缘关系次之，与芒果
(Mangifera indica AFE85918． 1)、美味猕猴桃(Ac-
tinidia deliciosa ACO53104． 1)、番 木 瓜 (Carica
papaya ABG72805． 1 )、柿 树 (Diospyros kaki
ACM44688． 1 )、 木 薯 (Manihot esculenta
ACY42670． 1、ACY42669． 1)、葡萄(Vitis vinifera
AFP28795． 1)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula XP_
图 8 Prosite 数据库分析 PSY基因的结构位点
Fig． 8 Analysis of PSY gene structure of the site using Prosite database
003616147． 1)等植物的 PSY序列亲缘关系较远。
3 讨论
广藿香为经典的芳香化湿药，其芳香化浊、开胃
止呕功效特别显著。萜类化合物是其主要的活性成
分。本研究成功克隆了广藿香萜类合成途径中的关
键酶———八氢番茄红素合成酶(PcPSY1) ，其 cDNA
全长 1 550 bp，编码 439 个氨基酸，并对其进行测序
及相关的生物信息学分析。广藿香的 PSY 基因的
特征与草莓(李永平，2009)、龙胆(芦小单，2008)、
烤烟(蔡刘体等，2011)、白菜型油菜(薛蕾等，
2011)、甜瓜(王淑芬，2011)、君子兰(劳杉杉等，
2012)的 PSY基因相似。基于 PSY 基因利用 NJ 法
构建的 21 个不同物种间的进化树表明 PcPSY1 基因
与桂花的 PSY 序列同源性最高，与烟草、番茄等植
物次之。上述预测结果证明了本研究中所克隆的
PcPSY1 基因的正确性。
多数植物都表达单一的 PSY 基因。但在有
些植物中，PSY 是由多个基因编码，其表达具有
器官或质体特异性(Bramley，2002) ，如番茄中有
2 个 PSY 基因，其中 PSY1 在花和果实中表达，控
制番茄果实成熟过程中的八氢番茄红素合成酶，
PSY2 则主要在叶中表达，控制绿色组织(包括成
熟后仍表现为绿色的番茄果实)中八氢番茄红素
(Bird et al． ，l99 l;Ｒay et al． ，1987)。本研究发现
广藿香只有一个 PSY 基因。克隆广藿香 PSY 基
因能为广藿香提供丰富的基因源，为后期利用基
因工程改善广藿香奠定基础。
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