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Study on preparation of walnut peptides from enzymatic hydrolysis of pepsin and papain

胃蛋白酶和木瓜蛋白酶水解核桃蛋白工艺研究



全 文 :广 西 植 物 Guihaia Mar.2014,34(2):183-188           http://journal.gxzw.gxib.cn 
DOI:10.3969/j.issn.1000G3142.2014.02.011
颜小捷,刘幼娴,郑立浪,等.胃蛋白酶和木瓜蛋白酶水解核桃蛋白工艺研究[J].广西植物,2014,34(2):183-188
YanXJ,LiuYX,ZhengLL,etal.Studyonpreparationofwalnutpeptidesfromenzymatichydrolysisofpepsinandpapain[J].Guihaia,2014,34(2):183-188
胃蛋白酶和木瓜蛋白酶水解核桃蛋白工艺研究
颜小捷1,刘幼娴1,2,郑立浪1,3,卢凤来1,李典鹏1∗
(1.广西植物功能物质研究与利用重点实验室,广西植物研究所,广西 桂林541006;
2.广西中医药大学,南宁530001;3.广西师范大学,广西 桂林541004)
摘 要:以核桃粕为原料,以水解度为考察指标,研究胃蛋白酶和木瓜蛋白酶对核桃蛋白的水解作用.结果
表明:木瓜蛋白酶为酶解核桃蛋白最佳酶,其最佳酶解条件为底物浓度4%、酶质量分数5%、酶解pH值为
7.0、酶解温度50℃、酶解时间4h;在该条件下,木瓜蛋白酶酶解核桃蛋白水解度可高于25.76%.
关键词:核桃蛋白;胃蛋白酶;木瓜蛋白酶;水解度
中图分类号:Q946.5  文献标识码:A  文章编号:1000G3142(2014)02G0183G06
Studyonpreparationofwalnutpeptidesfrom
enzymatichydrolysisofpepsinandpapain
YANXiaoGJie1,LIUYouGXian1,2,ZHENGLiGLang1,3,
LUFengGLai1,LIDianGPeng1∗
(1.GuangxiKeyLaboratoryofFunctionalPhytochemicalsResearchandUtilization,GuangxiInstituteofBotany,
Guilin541006,China;2.GuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530001,China;
3.CollegeofLifeSciences,GuangxiNormalUniversity,Guilin541004,China)
Abstract:Walnutpeptideswereobtainedthroughpepsinorpapainenzymolysiswithwalnutresidueasrawmaterials
anddegreeofhydrolysisasindex.Theresultsshowedthatpapainwastheoptimumproteinase.TheoptimumhydroG
lyticconditionswereasfolowed:substrateconcentrationwas4%,enzymeconcentrationwas5%,pHwas7,temperaG
turewas50℃andhydrolysistimewas4h.Undertheseoptimumconditions,thedegreeofhydrolysiscanbehigher
than25.76%.
Keywords:walnutprotein;epsin;papain;degreeofhydrolysis
  核桃(Juglansregial)为胡桃科胡桃属植物,因
其营养丰富,有补肾强体、温肺定喘、润肠通便、强身
健脑、驻颜延年等功效,又称长寿果、万岁子、益智
果、美容果(黄黎慧等,2009;李萍等,2011).现实
中,人们仅关注核桃油的营养价值,忽略了对核桃饼
粕的开发利用.核桃粕中蛋白质含量达52%,其中
谷蛋白含量高达70.11%,而谷蛋白中疏水性氨基酸
比例较高,导致核桃蛋白溶解性较差,大大限制了其
在食品工业中的利用(毛晓英,2012;丁晓雯等,
2005).核桃蛋白中谷氨酸和精氨酸分别占氨基酸
总量的19.5%~20.4%和15.4%~15.7%,其中谷氨
酸在人体内能促进γG氨基丁酸的生成,降低血液氨
基酸的含量,促进脑细胞的呼吸;赖氨酸与精氨酸的
比值低至0.16~0.19,按该比值适当摄入可降低冠
心病和动脉粥样硬化发生的概率(Kritchevsky,et
al.,1982;Carrol,etal.,1975).因此,核桃粕的加
收稿日期:2013G11G20  修回日期:2014G03G07
基金项目:广西科技攻关项目(桂科攻11107010G3G10);广西植物研究所基本业务费项目(2013001).
作者简介:颜小捷(1985G),女,广西玉林人,硕士,助理研究员,主要从事植物资源开发与利用研究,(EGmail)xiaojie128@126.com.
∗通讯作者:李典鹏,药学博士,研究员,主要从事天然药物和天然植物的化学研究,(EGmail)ldp@gxib.cn.
工利用和有效开发是延长核桃产业链的根本途径,
而核桃粕蛋白的深加工将是核桃粕精深加工中最具
潜力和最有前途的领域.
生产生物活性肽是蛋白质领域中新兴的朝阳产
业,其系列产品是当前国内外食品界中较为热门的
研究对象.至今,相关学者和企业多以乳制品、大
豆、玉米等为原料研究和生产低分子肽,如市场上较
为常见的有阿片肽、抗菌肽、抗癌肽、减肥肽、降糖
肽、玉米肽等(豆康宁等,2007;王丽华等,2008;林燕
等,2009);反之,以核桃粕为原料制备的低分子肽制
品却较为罕见.现实中,要想得到核桃中特殊的活
性水解肽类物质,须有足够的核桃水解产物作相关
的药效学实验.本文主要以胃蛋白酶和木瓜蛋白酶
为例,研究其水解核桃蛋白的最适条件.
1 材料与方法
1.1材料与仪器
核桃饼粕(青岛十相自在食品有限公司);胃蛋
白酶(郑州义多利化工产品有限公司);木瓜蛋白酶
(南宁庞博生物工程有限公司);盐酸(西陇化工股份
有限公司);氢氧化钠(西陇化工股份有限公司);磷
酸氢二钾(广东汕头市西陇化工厂);磷酸二氢钾(广
东汕头市西陇化工厂);甘氨酸(国药集团化学试剂
有限公司);茚三酮(西陇化工股份有限公司).
十两装高速中药粉碎机LGG500A(浙江瑞安市
百信药机器械厂);电子天平 XS225AGSCS(PreciG
sa);HHGS型水浴锅(郑州长城科工贸有限公司);
KQ3200DE型数控超声波清洗器(昆山市仪器有限
公司);pH 计(深圳市柯迪达电子有限公司 CTG
6023);T6型新世纪紫外—可见分光光度计(北京普
析通用仪器有限责任公司).
1.2方法
1.2.1核桃蛋白提取 核桃饼粕经粉碎过40目筛,
核桃粉浸泡于去离子水中(1∶9,w/v),用3mol􀅰
LG1氢氧化钠溶液调pH 值至9.0,超声波浸提1h,
4000r􀅰minG1,离心10min,取上清液加6mol􀅰
LG1盐酸调pH 值至4.5,蛋白质酸沉淀,4000r􀅰
minG1,离心10min,沉淀水洗至中性,真空冷冻干
燥,得核桃蛋白备用(丁晓雯等,2005).
1.2.2完全水解蛋白液的制备 精密称取核桃蛋白
50mg,然后加入6mol􀅰LG1盐酸50mL,置沸水浴
中冷凝回流水解4h,冷却,过滤,滤液真空浓缩至
1mL左右,加蒸馏水9mL,滴加1滴酚酞指示剂,
用3mol􀅰LG1氢氧化钠溶液调至微红,定量转移至
25mL容量瓶中,用去离子水稀释至刻度,摇匀,离
心,所得上清液备用(郭兴凤,2000;颜小捷等,
2012).
1.2.3未酶解蛋白液的制备 称取核桃蛋白5g,浸
泡于50mL去离子水中,超声波浸提10min后充
分搅拌30min,4000r􀅰minG1,离心10min,取上清
液备用.
1.2.4标准曲线的制作 精密称取105℃下干燥至
恒重的甘氨酸25mg,置25mL容量瓶中加去离子
水溶解并稀释至刻度,摇匀,得1mg􀅰mLG1储备液,
移取2mL上述储备液于10mL容量瓶中定容至刻
度,得0.2mg􀅰mLG1对照品溶液.分别吸取0.45、
0.5、0.55、0.6、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9mL对照品溶
液于试管中,加去离子水至2mL,加1mLpH8.2
的磷酸缓冲液,加1mL2%的茚三酮显色剂,摇匀
密封后置于沸水浴加热15min,然后冷水冷却,加
入5mL去离子水混匀,放置15min后以去离子水
管作为空白对照,570nm波长下测定吸光度(赵新
淮等,1994),以甘氨酸含量为横坐标,以其吸光度为
纵坐标,得甘氨酸含量测定标准曲线y=14.5x-
1.1934(R2=0.9933).
1.2.5酶解核桃蛋白的单因素实验 称取一定质量
的核桃蛋白,用50mL蒸馏水配制成核桃蛋白水溶
液,称重,超声5min后置于沸水浴中加热10min
进行预处理,冷却后补重,调节反应温度(水浴保温)
和pH 分别为37℃和2,然后加入不同剂量胃蛋白
酶,水解后在沸水浴条件下灭酶10min,冷却后
4000r􀅰minG1,离心10min,量取并记录上清液体
积,上清液进行水解度的测定.固定其他条件,分别
改变底物浓度、酶解pH 值、酶解时间、酶解温度等
单一条件,考察核桃蛋白水解度的变化情况.同理,
调节反应温度(水浴保温)和pH分别为50℃和7,
先考察不同剂量木瓜蛋白酶对核桃蛋白水解影响,
后固定其他条件,分别改变底物浓度、酶解pH 值、
酶解时间、酶解温度等单一条件,考察核桃蛋白水解
度的变化情况.
1.2.6正交实验 酶质量分数、核桃蛋白底物浓度、
酶解pH值、酶解温度和酶解时间对整个酶解反应
体系均具有一定的影响.本实验根据单因素结果选
取了核桃蛋白浓度、酶质量分数和酶解pH值3个
因素,设计L9(33)正交实验优化胃蛋白酶酶解核桃
481 广 西 植 物                  34卷
蛋白条件,实验设计见表1.另选取核桃蛋白浓度、
酶质量分数和酶解时间3个因素,设计L9(33)正交
实验优化木瓜蛋白酶酶解核桃蛋白条件,实验设计
见表2.
表1 胃蛋白酶正交实验因素水平表
Table1 MultiGfactorandmultiGlevelorthogonaltestonpepsin
水平
Level
因素Factor
A底物浓度
Concentrationof
substrate(%)
B酶质量分数
Massfraction
ofenzyme(%)
C酶解pH值
pHofenzymatic
hydrolysis
1 1 3 2
2 2 4 3
3 3 5 4
表2 木瓜蛋白酶正交实验因素水平
Table2 MultiGfactorandmultiGlevelorthogonaltestonpapain
水平
Level
因素Factor
A底物浓度
Concentrationof
substrate(%)
B酶质量分数
Massfraction
ofenzyme(%)
C酶解时间
Enzymatic
hydrolysistime
1 3 4 2
2 4 5 3
3 5 6 4
1.2.7水解度的测定方法
DH=hs-hoht-ho
×100
式中,DH 表示水解度,hs代表每克核桃蛋白
酶解后游离氨基酸浓度,ho代表每克核桃蛋白未酶
解的游离氨基酸浓度;ht代表每克核桃蛋白用6
mol􀅰LG1盐酸完全水解后总的游离氨基酸浓度(PeG
naetal.,2001).
2 结果与分析
2.1酶质量分数对酶解反应影响
酶与底物浓度比分别在0.5%~4%和1%~
6%之间变化,以水解度作指标,胃蛋白酶及木瓜蛋
白酶的酶质量分数变化对核桃蛋白酶解效果影响
(图1).从图1可知,胃蛋白酶酶质量分数在0.5%~
2%范围内,胃蛋白酶对核桃蛋白水解度变化不大;
在2%~3%范围内,随酶质量分数的升高水解度快
速增大;在3%时,取得最佳水解度为3.85%,酶质
量分数进一步增大时水解度呈现波动趋势.木瓜蛋
白酶酶质量分数在1%~6%范围内,对核桃蛋白水
解度呈上升趋于平缓的趋势.综合考虑酶水解度及
酶成本等因素,故选择胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶质
量分数分别为3%和5%作为下一步实验参考.
2.2底物浓度对酶解反应影响
以核桃蛋白为底物,其浓度分别在1%~8%和
2%~12%之间变化,以水解度作指标,底物浓度变
化对核桃蛋白酶解效果影响(图2).从图2可知,
在一定范围内,胃蛋白酶和木瓜蛋白酶对核桃蛋白
水解度均随底物浓度的升高呈先升后降的趋势,如
胃蛋白酶在底物浓度不超过2%时,随着底物浓度
增加,水解度逐渐增大;底物浓度超过2%后,水解
度呈下降趋势;当核桃蛋白浓度为2%时,水解度最
大为7.93%.木瓜蛋白酶在底物浓度不超过4%
时,随着底物浓度增加,水解度逐渐增大;底物浓度
超过4%后,水解度呈下降趋势;当核桃蛋白浓度为
4%时,水解度最大为31.69%.
2.3酶解pH值对酶解反应影响
pH值分别在0.5~4和4~9之间变化,以水解
度作指标,pH变化对酶解效果影响(图3).从图3
可知,pH 值为3是胃蛋白酶酶解反应较适宜pH
值,其水解度为7.44%;pH值为7是木瓜蛋白酶酶
解反应较适宜pH值,其水解度为25.27%.
2.4酶解温度对酶解反应影响
温度在30~60℃和35~60℃之间变化,以水
解度作指标,温度变化对酶解效果影响(图4).从
图4可知,35℃为胃蛋白酶酶解反应较适宜温度,
其水解度为2.67%;50℃为木瓜蛋白酶酶解反应较
适宜温度,其水解度为23.90%.
2.5酶解时间对酶解反应影响
以水解度作指标,酶解时间在1~6h之间变化
对酶解效果影响(图5).从图5可知,在一定条件
下,胃蛋白酶对核桃蛋白水解度随水解时间延长变
化较小,而木瓜蛋白酶对核桃蛋白水解度随水解时
间增加呈上升趋于平缓的趋势,当水解时间为3h,
其水解度达17.40%,若水解时间再增加,其水解度
增加很缓慢.故选择胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解时
间分别为1h和3h.
2.6胃蛋白酶正交试验
由表3可见,RA>RC>RB,核桃蛋白浓度
(A)、酶质量分数(B)和酶解pH值(C)三个因素对
试验考察指标影响的主→次顺序是ACB,即底物核
桃蛋白浓度影响最大,酶解pH值次之,酶质量分数
的影响最小.另kA1≠kA2≠kA3,说明 A因素的
水平变动对试验结果有影响,同一因素中水平的
kA值越大,该水平对试验指标的影响就越大,所以
可断定A2为A因素的优水平(kA2>kA3>kA1).
5812期         颜小捷等:胃蛋白酶和木瓜蛋白酶水解核桃蛋白工艺研究
图1 酶质量分数对核桃蛋白水解度的影响
Fig.1 Theinfluenceoftheenzymemassfractiononwalnutproteinhydrolysis
图2 底物浓度对核桃蛋白水解度的影响
Fig.2 Theinfluenceofsubstrateconcentrationonhydrolysisdegreeofwalnutprotein
图3 酶解pH值对核桃蛋白水解度的影响
Fig.3 TheefectionofenzymesolutionpHonhydrolysisdegreeofwalnutprotein
同理B3和C2分别为B、C两因素的优水平.故胃蛋
白酶酶解核桃蛋白的最佳工艺条件为:A2B3C2,即底
物浓度为2%,酶质量分数为5%,酶解pH值为3.
2.7木瓜蛋白酶正交实验
由表4可见,RA>RB>RC,核桃蛋白浓度
(A)、酶质量分数(B)和酶解时间(C)三个因素对试
验考察指标影响的主→次顺序是ABC,即底物核桃
蛋白浓度影响最大,酶质量分数次之,酶解时间的影
响最小.kA1≠kA2≠kA3,说明 A因素的水平变
动对试验结果有影响,同一因素中水平的kA值越
681 广 西 植 物                  34卷
图4 酶解温度对核桃蛋白水解度的影响
Fig.4 Theeffectionofenzymesolutiontemperatureonthehydrolysisdegreeofwalnutprotein
图5 酶解时间对核桃蛋白水解度的影响
Fig.5 Theefectofenzymesolutiontimeonthehydrolysisdegreeofwalnutprotein
表3 胃蛋白酶正交实验结果与分析
Table3 Theresultsandanalysisoforthogonaltestonpepsin
编号
No. A B C
水解度
Degreeofhydrolysis(%)
1 1 1 1 5.37
2 1 2 2 5.12
3 1 3 3 5.00
4 2 1 3 9.24
5 2 2 1 8.50
6 2 3 2 8.99
7 3 1 2 6.05
8 3 2 3 6.28
9 3 3 1 6.90
k1 5.163 6.887 6.880
k2 8.910 6.633 7.087
k3 6.410 6.963 6.517
R 3.747 0.330 0.570
大,该水平对试验指标的影响就越大,可断定A2为
A因素的优水平(kA2>kA1>kA3).同理B2和
C3分别为B、C两因素的优水平.故木瓜蛋白酶酶
解核桃蛋白的最佳工艺条件为 A2B2C3,即底物浓
度为4%,酶质量分数为5%,酶解时间为4h.
表4 木瓜蛋白酶正交实验结果与分析
Table4 Theresultsandanalysisoforthogonaltestonpapain
编号
No. A B C
水解度
Degreeofhydrolysis(%)
1 1 1 1 17.74
2 1 2 2 19.43
3 1 3 3 18.86
4 2 1 3 20.12
5 2 2 1 25.76
6 2 3 2 23.73
7 3 1 2 17.94
8 3 2 3 18.10
9 3 3 1 19.37
K1 18.677 18.600 19.857
K2 23.203 21.097 19.640
K3 18.470 20.653 20.853
R 4.733 2.497 1.213
3 结论与讨论
酶解蛋白释放出具某种生理功能的生物活性肽
与蛋白质的水解程度密切相关,即与水解度有关(周
7812期         颜小捷等:胃蛋白酶和木瓜蛋白酶水解核桃蛋白工艺研究
慧江等,2012).目前报道测定蛋白质水解度的方法
有pHGslat法、甲醛滴定法、三硝基苯磺酸法(TNG
BS)、茚三酮比色法等.其中,pHGslat法在研究中
仅适用于中性及碱性(pH>7)或pH<3的酸性溶
液中进行的水解,并且需要特别的仪器对反应体系
的pH值进行在线控制(徐英操等,2007);之所以测
定核桃蛋白水解度时不宜采用甲醛滴定法,是因为
核桃蛋白中富含脯氨酸(4.29%),易与甲醛反应生
成不稳定化合物,导致测定的水解度值偏低(毛晓
英,2012);TNBS法是国外较为常用的测定蛋白水
解度的方法,该法非常灵敏,且不受酶特异性影响,
但由于所用试剂较为昂贵且反应中需要较长时间,
不能实时反应水解过程的水解度(周慧江等,2012);
由于用水合茚三酮显色法无法判断水解后的游离氨
基是原样品中本来就含有的还是经水解产生的,且
采用的是单一氨基酸做标准,而不同的氨基酸对茚
三酮的呈色度不同,因此采用茚三酮比色法结果也
有偏差.郭兴凤(2000)采用待水解蛋白质的完全水
解液作为标准溶液,消除了由于蛋白质水解液中不
同的氨基酸对反应试剂的响应不同所带来的误差,
但我们试验中发现该完全水解液在中性条件下难于
保存,标准曲线制作过程中难于保持稳定性及重复
性,故选择甘氨酸作为标准,待水解原料的完全水解
液中总的游离氨基酸浓度减去其未酶解的游离氨基
酸浓度作为基准,虽然消除了原样品中含有的游离
氨基酸对测定结果造成的误差,但不同的氨基酸对
反应试剂的响应所带来的误差还有待进一步消除.
酶解方式对核桃蛋白酶解产物的水解度影响较
大,在一定条件下,木瓜蛋白酶酶解产物的水解度显
著高于胃蛋白酶酶解产物.而相关学者根据 AS.
1398中性蛋白酶等五种酶的最佳反应条件对核桃
蛋白进行水解能力比较,结果表明水解能力大小顺
序为AS.1398中性蛋白酶>胃蛋白酶>2709碱性
蛋白酶>胰蛋白酶>木瓜蛋白酶(丁晓雯等,2005).
推其原因为酶的最佳反应条件并不一定是其水解核
桃蛋白的最佳反应条件,水解蛋白质中各单因素对
整个酶解反应体系均具有一定的影响,同一型号蛋
白酶在水解不同蛋白中其最佳参数有所改变.本实
验通过单因素及正交试验优化胃蛋白酶及木瓜蛋白
酶水解核桃蛋白工艺参数,研究得出最优酶解工艺
为木瓜蛋白酶为酶制剂,底物浓度为4%,酶质量分
数为5%,酶解pH为7、酶解温度为50℃、酶解时
间为4h,下一步将对水解后核桃多肽的药理药效
及其功能性食品的开发进行深入系统地研究.
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