全 文 ：试验研究 中国食品添加剂ChinaFoodAdditives
水酶法同时提取核桃仁油脂及水解蛋白的工艺研究
史双枝 , 刘忆冬 , 李疆 , 李哲
(石河子大学食品学院 , 新疆石河子市　832003)
　　摘　要:本试验主要研究了水酶法提取核桃油的酶解工艺。试验首先对 α-淀粉酶 、 中性蛋白酶 、 以及
淀粉酶与中性蛋白酶组成的复合酶的酶解效果进行了比较 , 确定中性蛋白酶的酶解效果最佳。在确定中性蛋
白酶的作用下 , 研究了酶解温度 、 pH、 酶的添加量 、 固液比对油脂提取率的影响。最后通过正交试验得出水
酶法提取核桃油脂的最佳工艺条件为:酶解温度 60℃, 蛋白酶添加量为 1.5% (m/m), 酶解 pH为 6.0, 料
液比 1∶4, 核桃的油脂提取率可达到 34.0%, 各因素对油脂提取率的影响主次顺序为:固液比 >酶解 pH>
酶解温度 >酶的添加量。在油脂提取的最佳工艺条件下 , 核桃水解蛋白的提取率可达 12.37%。
关键词:核桃油;核桃蛋白;水酶法
中图分类号:TS201.2+5　　　文献标识码:A　　　文章编号:1006-2513(2010)01-0131-05
Thestudyonaqueousenzymaticextractionprocessof
walnutoilandwalnutproteinhydrolysates
SHIShuang-zhi, LIJiang, LIUYi-dong, LIZhe
(FoodColegeofShiheziUniversity, Shihezi832003)
Abstract:Theprocessofextractionofwalnutoilbyaqueousenzymaticmethodwasstudied.First, thecomparisonof
theenzymolysislevelsamongα-amylase, neutral-proteaseandComplexPhosphoesterasumwasanalyzed.Theresults
showedthattheneutral-proteasewasthebestenzyme.Second, theinfluencesoftemperature, pH, theenzymesad-
ditionandtheratioofsolidtoliquidonthefreeoilyieldwithneutral-proteasewereinvestigated.Byorthogonalexperi-
ment, theresultshowedthattheoptimumhydrolysisconditionswereasfolows:enzymatichydrolysistemperature
60℃, proteaseadditionwas1.5% (m/m), pH6.0andratioofsolidtoliquidwas1∶4.Undertheseconditionsthe
freeoilyieldwas34.0%.Thesequencingofprimaryandsecondaryinfluenceofthefreeoilyieldwas:ratioofsolidto
liquid>pH>enzymolysistemperature>proteasecontent.Thewalnutprotolysateyieldwas12.37%underthisoptimal
conditions.
Keywords:walnutoil;Walnutprotein;aqueousenzymaticmethod
0　前言
核桃油富含油酸 、 亚油酸 、 亚麻酸等人体必
需脂肪酸 , 可作为高级保健食用油使用[ 1] 。在国
际市场上备受消费者青睐 , 市场前景广阔。同时
核桃还含有 14% ～ 17%的优质蛋白质 , 其可消化
率达 87.2%。核桃蛋白中 l8种氨基酸种类齐全 ,
且人体所需的 8种必需氨基酸含量合理 , 核桃蛋
白是一种很好的蛋白源[ 2] 。
收稿日期:2009-04-23
项目简介:石河子大学高层次人才科研启动资金。
作者简介:史双枝 , 女 , 1980-, 硕士 , 讲师 , 主要研究方向:植物油脂及蛋白。
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中国食品添加剂ChinaFoodAdditives试验研究
传统的植物油脂提取方法主要是压榨和有机
溶剂浸出 。虽然这两种方法具有较高的出油率 ,
但在压榨或浸出前 , 油料大多需进行湿热处理 ,
这导致了油料中蛋白质因变性而降低了利用价
值 , 不利于油料的综合利用 [ 3] 。水酶法提油工艺
环保 , 安全无毒 , 酶解条件温和 , 作用温度低 ,
蛋白质不易变性 , 油脂的品质较高 。该方法不仅
能耗低 , 且能同时利用油脂和蛋白质 , 提取油脂
和蛋白的工艺与传统工艺相比具有明显优势 。
1956年 Sugarman首创了水剂法同时提取花
生油和蛋白的方法。为提高出油率 , 1981年 Ols-
en将蛋白酶应用到大豆油和蛋白质的水剂法分离
中 , 用酶降解蛋白质分子以释放油脂 , 从而使大
豆油出油率接近 60%。进入 20世纪 80年代后
期 , 许多新酶种投入了工业化生产 , 酶的生产成
本不断下降 , 为应用酶法提取植物油的研究打下
了坚实的基础 。到 90年代中后期 , 我国开始在这
方面做深入研究 , 王璋 、 钱俊清 、 钱志娟[ 4 ～ 6]等
人利用水酶法对大豆 、玉米胚等进行了油脂的提
取 , 并取得了一定的成果。
本论文通过对酶制剂的筛选 , 研究水酶法同
时提取核桃仁油脂及蛋白的工艺 , 丰富水酶法在
植物油脂提取上的应用 , 也为核桃仁油脂和蛋白
的开发奠定基础。
1　材料与方法
1.1　试验材料 、试剂及设备
核桃:石河子市售;淀粉酶:北京奥博星生
物技术有限责任公司;蛋白酶:北京奥博星生物
技术有限责任公司。高速冷冻离心机 (GL-20G
-Ⅱ):上海安亭科学仪器厂生产;自动电位滴
定仪 (ZD-2):上海安亭昌吉路 149号雷磁仪器
厂;打浆机 (HR2839):珠海经济特区飞利浦家
庭电器有限公司;20mL注射器 (L1942):安徽
华源医疗器械公司;电磁炉 (CR-168):广东容
声电器股份有限公司;电子秤 (BS2000):北京
赛多利益斯天平有限公司;快速恒温数显水箱
(HH-42):常州国华电器有限公司;冷冻干燥
机 (FDU-1200):岛津制作所分析仪器事业部 。
1.2　试验方法
1.2.1　工艺流程
1.2.2　操作要点
(1)原料选择与脱皮:选取无虫蛀 、 无压
坏 、色泽良好的优质核桃 , 除去外壳 , 采用碱液
脱皮 , 核桃仁去皮最佳条件:以浓度为 0.6%
NaOH溶液在 65℃下 , 浸泡 15min后 , 用水冲洗 ,
可得到乳白色 , 质地紧实核桃仁。
(2)破碎:采用干法粉碎 , 在酶解工艺中 ,
油料破碎程度不仅影响酶解效果 , 且还影响出油
率;一般油料粒度细有利于酶解作用 , 但若粒度
过细却会使酶解后酶解液乳化程度加重 , 在试验
中一般以 40目为宜。
(3)提取油脂:每组取一定量的脱皮核桃
仁 , 在一定 pH缓冲液 、 料液比下兑浆 , 然后加
入一定量的酶在一定温度下 , 酶解一定时间后 ,
于 80℃水中灭酶 3min。
(4)离心分离:酶解完成以后将核桃浆分装
于 30mL的离心管中 , 以 5000r/min进行离心 ,
20min。
1.2.3　计算公式
(1)油脂提取率 (%) =A/B×100
式中:A———油脂质量 , g;
B———核桃仁质量 , g;
(2)水解蛋白质提取率测定步骤:用移液管
准确吸取 0.1mL蛋白水溶液于烧杯中 , 加入
19.9mL蒸馏水稀释 200倍 。取稀释后的蛋白液少
许放入石英比色皿中 , 调零 , 然后分别测出波长
在 280nm和 260nm下的吸光值 。运用以下公式计
算提取率 [ 7] 。
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试验研究 中国食品添加剂ChinaFoodAdditives
水解蛋白提取率 =
(1.45×A280 -0.74×A260) ×v×V
M×1000 ×100%
式中:v———稀释倍数
V———料液总体积
M———称取核桃仁的质量
1.2.4　酶的筛选对油脂提油率的影响
在 pH为 6.0, 恒温水浴箱酶解 2h, 酶解温
度 50℃, 酶添加量为 2.0%, 5000r/min离心
20min条件下 , 淀粉酶 、 蛋白酶及二者复配使用
时对油脂提油率的影响 。
1.2.5　单因素试验
确定了最佳酶种类以后 , 在 5000r/min,
20min的恒定条件下离心分离 , 分别研究了酶解
pH、固液比 、酶解时间 、酶添加量 、 酶解温度五
个因素对核桃仁油脂提取率的影响 。
1.2.6　正交试验
在单因素试验基础上 , 选择酶解温度 、 酶的
添加量 、 酶解 pH、 料液比进行 4因素 3水平正交
试验 , 正交试验因素水平表见表 1。
表 1　因素水平表
　　因素
水平　　
酶解温度
(℃)A
酶的添加量
(%)B
pH值
C
料液比
(w/s)D
1 55 1.5 5 1∶2
2 60 2.0 6 1∶3
3 65 2.5 7 1∶4
1.2.7　核桃水解蛋白的粗提取及干燥
在最佳条件下提取油脂 , 取下层水解液调 pH
为 5.0 左 右 , 静置 片刻 , 离 心 (5000r/min,
20min), 取沉淀并水洗数次 , 后放入冷冻干燥瓶
中 , 进行冷冻干燥得核桃水解蛋白 。
2　结果与分析
2.1　酶解工艺条件对油脂提取率的影响
2.1.1　酶的筛选对油脂提油率的影响
α-淀粉酶记为 M, 中性蛋白酶记为 N, M
∶N=1 ∶1, 考察不同酶种类对油脂提取率的影
响 , 结果见图 1。
图 1　酶的筛选对油脂提油率的影响
由图 1可知:α-淀粉酶单一使用时 , 油脂
提取率较低 , 为 7.30%。中性蛋白酶和 α-淀粉
酶复配使用时和中性蛋白酶单一添加时 , 油脂提
取率都较高 , 复配时提取率达 27.74%, 中性蛋
白酶单一使用时提取率达到 26.90%, 两者相差
不多。考虑到试验的操作性及经济利益 , 因此 ,
确定最适酶制剂为中性蛋白酶 。
2.1.2　酶解 pH对油脂提油率的影响
在固液比为 1 ∶5, 酶解 2h, 酶解温度 55℃,
中性蛋白酶添加量为 2.0%下 , 不同 pH对油脂提
取率的影响如图 2所示。
图 2　酶解 pH对油脂提油率的影响
由图 2可以看出 , 当酶解体系为弱酸性时 ,
油脂提取率较高;在碱性或中性条件下蛋白酶的
油脂提取率都大幅度下降。一方面中性蛋白酶的
有效 pH范围在 6.0 ～ 8.0 (最佳 6.0)。在偏酸和
偏碱性条件下 , 酶的活性受到抑制 , 导致酶活下
降 , 使油脂提取率降低 。另外随 pH的增加 , 蛋
白质更易被萃取 , 使得乳化层增加 , 也减少了游
离油脂的量 。因此 , 确定最适 pH值为 6.0, 油脂
提取率为 25.75%。
2.1.3　固液比 (w/s)对油脂提油率的影响
在 pH为 6.0, 酶解 2h, 酶解温度 55℃, 蛋
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中国食品添加剂ChinaFoodAdditives试验研究
白酶添加量为 2.0%, 5000r/min离心 20min条件
下 , 不同固液比 (w/s)对油脂提取率的影响结
果如图 3所示 。
图 3　固液比 (w/s)对油脂提油率的影响
由图 3可知:w/s=1 ∶2 ～ w/s=1 ∶4, 油脂
提取率呈上升趋势 , w/s=1 ∶4 ～ w/s=1 ∶6, 油
脂提取率快速下降 。且 w/s=1 ∶4时 , 油脂提取
率最高 , 表明此反应条件下酶解最充分 。固液比
过小时 , 核桃仁浆料黏度较大 , 体系流动性较
差 , 不利于蛋白酶的作用。固液比过大时 , 底物
浓度和酶浓度较底 , 影响了酶的反应速度 , 因而
影响了油脂提取率 , 所以 , 选择固液比 (w/s)
为 1 ∶4, 提取率达 34.00%。
2.1.4　酶解时间对油脂提油率的影响
在 pH为 6.0, 固液比为 1 ∶5, 酶解温度
50℃, 酶添加量为 2.0%的条件下 , 不同酶解时
间对油脂提油率的影响如图 4所示 。
图 4　酶解时间对油脂提油率的影响
由图 4的数据可知:反应时间少于 150min
时 , 油脂提取率随酶解时间的延长几乎呈线性增
加 , 而后略有下降 , 随着酶解时间增加 , 油脂提
取率的变化趋于缓慢 , 但随着时间增加 , 产品受
微生物污染的机会也随之增加 , 且油的品质也会
有所下降 , 因此 , 在单因素条件下 , 最佳酶解时
间为 150min, 提取率可达到 34.75%。
2.1.5　蛋白酶添加量对油脂提油率的影响
在 pH为 6.0 , 固液比为 1 ∶5, 酶解 2h, 酶
解温度 50℃条件下 , 不同蛋白酶添加量对油脂提
油率的影响如图 5所示。
图 5　蛋白酶添加量对油脂提油率的影响
由图 5可知油脂提取率随着酶添加量的增加
而缓慢增加 , 当加酶量在 1.5%时 , 就可获得较
高的提取率 , 说明酶的作用效果很明显 , 当加酶
量超过 2.0%时 , 油脂提取率增长趋于缓慢 , 结
合生产成本考虑选定蛋白酶添加量添加量为
2.0%。此时油脂的提取率达 26.5%。
2.1.6　酶解温度对油脂提取率的影响
在 pH为 6.0 , 固液比为 1 ∶5, 酶解 2h, 酶
添加量为 2.0%条件下 , 不同酶解温度对油脂提
取率的影响结果如图 6所示。
图 6　酶解温度对油脂提取率的影响
由图 6可以看出 , 随着温度的升高 , 油脂提
取率先升高后下降 , 当酶解温度为 60℃时 , 油脂
提取率最高 , 达 32.2%。可能是 60℃为蛋白酶的
最适作用温度 , 另外随着温度的升高 , 乳化现象
也会加重 , 不利于油脂的提取 , 使得油脂提取率
下降。因而 , 确定酶解温度为 60℃, 提取率为
32.2%。
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2.2　正交试验结果
正交试验结果见表 2。
表 2
　　因素
试验号　
酶解温度
(℃)
A
酶的添加
量 (%)
B
pH值
C
料液比
(w/s)
D
油脂提取
率 (%)
1 1 1 1 1 17.2
2 1 2 2 2 24.4
3 1 3 3 3 24.8
4 2 1 2 3 34.0
5 2 2 3 1 17.2
6 2 3 1 2 22.8
7 3 1 3 2 23.2
8 3 2 1 3 26.0
9 3 3 2 1 20.5
K1 66.4 74.4 66.0 54.9
K2 74.0 67.6 78.9 70.4
K
3 69.7 68.1 65.2 84.8
k1 22.13 24.8 22.0 18.3
k2 24.67 22.53 26.3 23.47
k3 23.23 22.7 21.73 28.27
R 2.54 2.27 4.57 9.97
由表 2可见 , 在酶解工艺中 , 各因素对油脂
提取率的影响主次顺序为:固液比 >酶解 pH>酶
解温度 >酶的添加量 , 其最优组合为 A2 B1C2D3 ,
即固液比 1 ∶4、酶解 pH为 6.0、酶解温度 60℃、
酶的添加量为 1.5%, 酶解 2.5h时油脂提取率最
高 , 可达到 34.0%。
2.3　核桃蛋白的粗提取
在提取油脂的最佳条件下 , 核桃水解蛋白的
提取率可达 12.37%。所得的核桃水解蛋白粉味
微苦 , 色微黄。
3　结论
(1)本文确定了中性蛋白酶从核桃仁中提取
油脂与蛋白 。在反应温度 6O℃、 pH为 6.0、 固
液比 l∶4 (w/s)、 加酶量 1.5%、 酶解时间 2.5h
的条件下 , 游离油提取率为 34.0%, 水解蛋白得
率为 12.37%。
(2)对核桃水解蛋白提取的研究不够深入还
需进一步探讨 , 如进一步提高蛋白产品的得率 ,
通过优化工艺提高蛋白质的色泽 , 口感以及测定
水解蛋白的组成等。
(3)对酶作用效果的提高 , 水酶法处理后水
解液与油脂能有效分离的问题都值得深入研究。
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