全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Jan．２０１４,３４(１):１３５－１３８　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．３９６９/j．issn．１０００Ｇ３１４２．２０１４．０１．０２６
王彦超,孙昊,周菲菲,等．流动注射化学发光法检测剑麻皂苷元[J]．广西植物,２０１４,３４(１):１３５－１３８
WangYC,SunH,ZhouFF,etal．DeterminationoftigogeninbytheflowＧinjectionchemiluminescence[J]．Guihaia,２０１４,３４(１):１３５－１３８
流动注射化学发光法检测剑麻皂苷元
王彦超１,孙　昊２,周菲菲２,郝再彬１,２∗
(１．东北农业大学 生命科学学院,哈尔滨１５００３０;２．桂林理工大学 化学与生物工程学院,广西 桂林５４１００４)
摘　要:采用LuminolＧK３Fe(CN)６化学发光体系,建立流动注射化学发光法检测从剑麻残渣和麻膏中分离得
到的皂苷元.当用０．１mol􀅰LＧ１NaOH作为溶剂配制鲁米诺浓度为１．０×１０Ｇ５mol􀅰LＧ１,用去离子水作为溶剂
配制K３Fe(CN)６浓度为１．６×１０Ｇ５mol􀅰LＧ１,主副蠕动泵转数均在５０~８０r􀅰minＧ１时,用无水乙醇溶解的皂苷
元流入体系具有最强的化学发光.在该条件下,剑麻皂苷元最低检出限为３．０×１０Ｇ３mg􀅰mLＧ１,标准曲线相关
系数为０．９９９６,平均回收率为９８．５％,相对标准偏差在２．９％~４．２％之间.同时与 HPLC检测方法对样品检
测结果进行了比较.
关键词:流动注射;化学发光;剑麻皂苷元
中图分类号:Q９４６．８３　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１４)０１Ｇ０１３５Ｇ０４
DeterminationoftigogeninbytheflowＧinjection
chemiluminescence
WANG YanＧChao１,SUNHao２,ZHOUFeiＧFei２,HAOZaiＧBin１,２∗
(１．CollegeofLifeSciences,NortheastAgricultureUniversity,Harbin１５００３０,China;２．Collegeof
ChemistryandBioengineering,GuilinUniversityofTechnology,Guilin５４１００４,China)
Abstract:LuminolＧK３Fe(CN)６wasusedtodetectcontentoftigogeninseparatedfromsisalresidueandsisalcreamby
theflowＧinjectionchemiluminescence．WhenLuminol(１．０×１０Ｇ５mol􀅰LＧ１)wasdissolvedinNaOH(０．１mol􀅰LＧ１),
K３Fe(CN)６(１．６×１０Ｇ５mol􀅰LＧ１)wasdissolvedindeionizedwaterandRPMofperistalticpumpwasfrom５０to８０．
Thissystemshowedthebestcharacterofchemiluminescencefortigogenindissolvedinethanol．Underthiscondition,
theLODwas３．０×１０Ｇ３mg􀅰mLＧ１．Thecorrelationcoeficientofstandardcurvewas０．９９９６,theaveragerecoverywas
９８．５％andtheRSDwas２．９％to４．２％．DeterminationoftigogeninbyHPLCwasusedforcomparativetrial．
Keywords:flowＧinjection;chemiluminescence;tigogenin
　　剑麻(Agavesisaiana),又名菠萝麻、西纱尔
麻、龙舌兰麻,是龙舌兰科龙舌兰属植物.剑麻皂苷
元(tigogenin)是螺甾烷醇的衍生物(５α,２５DＧ螺甾
烷Ｇ３β羟基,图１),它与薯蓣皂苷元(diosgenin)和番
麻皂苷元(hecogenin)均为合成甾体激素类药物的
医药中间体和重要原料,广泛应用于肾上腺皮质激
素、性激素及蛋白同化激素,三大类激素可以制造
２００多种药物(吴立军等,２０１１).药理研究表明,这
些皂苷元成分具有较明显的抗炎、抗菌、止血、抗衰
老和降血糖的生物活性(宣伟东等,２００５).剑麻皂
苷元来自于剑麻纤维传统产品之后废弃的麻汁和麻
渣.
检测植物体内提取的天然甾体皂苷元方法虽然
较多,薄层色谱法(万建波等,２００４)、气相色谱法(Cui
收稿日期:２０１３Ｇ０８Ｇ１９　　修回日期:２０１３Ｇ０９Ｇ０９
基金项目:国家自然科学基金(３１０６０１９３);国家麻类产业技术体系建设专项(CARSＧ１９).
作者简介:王彦超(１９７８Ｇ),男,黑龙江哈尔滨人,博士研究生,从事植物化学等研究,(EＧmail)yanchao_wang＠１６３．com.
∗通讯作者:郝再彬,教授,博士生导师,研究方向为天然活性物质的开发与利用,(EＧmail)haozaibin２０１０＠１２６．com.
图１　剑麻皂苷元 (tigogenin)的结构式
Fig．１　Constitutionalformulaoftigogenin
etal．,１９９７)、HPLCＧUV(Lauetal．,２００４;Liet
al．,２００５;Wanetal．,２００６)、荧光分光光度法
(Shangguanetal．,２００１).色谱法可以检测皂苷元
的单体种类和含量;分光光度法不能做皂苷元的单
体分析,可以检测皂苷元的总含量.但是这些方法
有耗时长、设备昂贵等不足.流动注射化学发光法
是一种对皂苷元的总含量检测,使用该方法对剑麻
皂苷元进行检测鲜见报道,该方法容易操作、检测时
间短,为剑麻皂苷元的工业化生产在线检测提供新
技术和理论依据.
１　材料与方法
１．１材料与设备
剑麻皂苷元标准品(９８％,HPLC纯,上海研生
生物技术有限公司);剑麻残渣和麻膏(广西剑麻集
团);无水乙醇、石油醚、盐酸、氢氧化钠、鲁米诺和铁
氰化钾等生化试剂均为国产分析纯;高效液相色谱
所用试剂均为Fisher色谱纯.
IFFMＧE型流动注射化学发光分析仪(西安瑞
迈电子有限公司);EL１０４万分之一电子天平(梅特
勒Ｇ托利多仪器上海有限公司);DHGＧ９０９７电热恒
温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);KQＧ
４００KDE型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声
仪器有限公司);REＧ５２A旋转蒸发仪(上海亚荣生
化仪器厂);HHＧS数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪
器厂);SIGMA３K３０离心机(德国希格玛离心机有
限公司);岛津LCＧ２０AB高效液相色谱仪,ELSD检
测器;氮气(９９．９％,广西桂林海湾恒日化工气体有
限公司).
１．２试验方法
１．２．１皂苷元的提取与分离　取一定量的剑麻残渣,
干燥后粉碎过１００目筛,用６０％乙醇超声提取３次
后合并上清液干燥成粉.称取该粉末１００mg加入
到２５mL具塞玻璃试管中,再加入６mol􀅰LＧ１的
HCl９mL,置于９０℃水浴中水解５０min,冷却后用
６mol􀅰LＧ１的 NaOH 调节pH 为中性,４５００r􀅰
minＧ１离心１５min,弃上清液.分别向沉淀中加入沸
程６０~９０℃的石油醚３０mL,分三步进行萃取,合
并石油醚相,置于４０℃旋转蒸发浓缩干燥.
取一定量的麻膏,干燥后粉碎过１００目筛,称取
该粉末１００mg加水充分搅拌后置于８０℃水浴中
恒温２h,４５００r􀅰minＧ１离心１５min,弃上清液,沉
淀部分重复以上操作２次.分别向沉淀中加入沸程
６０~９０℃的石油醚３０mL,分三步进行萃取,合并
石油醚相,置于４０℃旋转蒸发浓缩干燥.
１．２．２试剂的配制　取一定质量的剑麻皂苷元标准品
和自制样品,用无水乙醇配制成浓度为１mg􀅰mLＧ１
的标准溶液和待测样溶液;取一定质量的鲁米诺固
体,用０．１mol􀅰LＧ１的NaOH作为溶剂配制鲁米诺浓
度为１．０×１０Ｇ１mol􀅰LＧ１;再取一定质量的K３Fe(CN)６
固体,用去离子水作为溶剂配制K３Fe(CN)６浓度为
１．６×１０Ｇ１ mol􀅰LＧ１,以上均作为储备液备用.
取一定质量的剑麻皂苷元标准品和自制样品,
分别用甲醇配制成浓度为１mg􀅰mLＧ１的标准溶液
和待测样溶液,以供HPLC使用.
１．２．３检测皂苷元条件的优化　乙醇浓度:用０．１
mol􀅰LＧ１ NaOH作为溶剂稀释鲁米诺储备液至浓
度为１．０×１０Ｇ５mol􀅰LＧ１,用去离子水作为溶剂稀释
K３Fe(CN)６储备液至浓度为１．６×１０Ｇ５mol􀅰LＧ１,去
离子水配置不同浓度的无水乙醇溶液进样,以去离
子水为空白,将发光体系溶液以５０~８０r􀅰minＧ１的
流速通过六通注射阀,注样时间１０~２５s,各液混
合,流入流通池检测其化学发光强度,记录数据.空
白发光强度记录为Io,乙醇发光强度记为Is,抑光
强度记为△I(△I＝Io－Is).上述测试过程均保
持在３５℃恒温下进行.
鲁米诺浓度:用０．１mol􀅰LＧ１ NaOH作为溶剂
稀释鲁米诺储备液至不同浓度,用无水乙醇稀释标
准剑麻皂苷元溶液浓度至０．５mg􀅰mLＧ１为待测样,
以无水乙醇为空白,其它操作方法同上.
K３Fe(CN)６浓度:用去离子水作为溶剂稀释
K３Fe(CN)６储备液至不同浓度,用无水乙醇稀释标
准剑麻皂苷元溶液浓度至０．５mg􀅰mLＧ１为待测样,
以无水乙醇为空白,其它操作方法同上.
１．２．４制备皂苷元的标准曲线　制备皂苷元的标准
曲线(FIＧCL法):准确吸取１mg􀅰mLＧ１皂苷元标准
６３１ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
液０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９和１．０mL
分别置于１０支１０mL容量瓶中,无水乙醇定容至
刻度,充分摇匀,静置１０min.取上述溶液分别与
１．０×１０Ｇ５mol􀅰LＧ１鲁米诺溶液、１．６×１０Ｇ５mol􀅰LＧ１
K３Fe(CN)６溶液在流动注射化学发光仪上测试(无
水乙醇为空白).以浓度为横坐标,发光强度为纵坐
标作图,绘制标准曲线.
制备皂苷元的标准曲线(HPLC法)(Zhouet
al．,２０１２;方惠娟等,２０１２):ShimＧpackVPＧODSC１８
柱(２５０mm×４．６mm,５μm),ELSDＧLTⅡ检测器,
漂移管温度４０℃,载气压力３５０kPa,柱温３５℃,
流动相为甲醇∶水＝９０∶１０(V/V),流速１．０mL􀅰
minＧ１,进样量１０μL,时间３５min.用甲醇作为溶
剂稀释剑麻皂苷元标准溶液定容于容量瓶中,制成
５０、１００、２００、３００、５００、１０００和２０００μg􀅰mLＧ１的不
同溶液,分别进样,以浓度为横坐标,以峰面积为纵
坐标绘制标准曲线.
１．２．５检测皂苷元的回收率实验　用无水乙醇为溶
剂稀释自剑麻残渣中提取的皂苷元样品溶液溶度至
０．１mg􀅰mLＧ１,作为加标试样.取浓度为０．１mg􀅰
mLＧ１的标准剑麻皂苷元溶液０．５、１．０和１．５mL,７０
℃烘干,分别加入加标试样溶液１mL,进行流动注
射化学发光检测(根据需要按相同比例增加体积).
２　结果与分析
２．１检测皂苷元条件的优化
１０％~４０％的乙醇对发光体系的抑光强度是逐
渐增强的,４０％~１００％的乙醇对发光体系的抑光强
度是趋于平稳的,所以选择无水乙醇作为皂苷元的
溶剂(图２).由图３和４可知,该发光体系检测皂
苷元的最佳条件鲁米诺和 K３Fe(CN)６的浓度分别
为１．０×１０Ｇ５mol􀅰LＧ１和１．６×１０Ｇ５mol􀅰LＧ１.
２．２检测剑麻皂苷元的标准曲线
流动注射化学发光法测得剑麻皂苷元标准曲线
方程为y＝７２１．４１x＋２５．２４２,其中x 以 mg􀅰mLＧ１
计,浓度在０．１~１．０mg􀅰mLＧ１范围内具有良好的
线性关系,R２＝０．９９９６(图５).
HPLC法检测剑麻皂苷元的标准曲线方程为y
＝６３１１x－７３３８９,其中x以μg􀅰mLＧ１计,浓度在５０
~２０００μg􀅰mLＧ１范围,R２＝０．９９９８.
２．３干扰试验
剑麻皂苷元来源于剑麻叶片,在提取过程中共
图２　乙醇浓度对发光体系的影响
Fig．２　Influenceofethanolconcentrationon
thechemiluminescencesystem
图３　鲁米诺浓度对测定皂苷元的影响
Fig．３　InfluenceofLuminolconcentrationon
thedeterminationoftigogenin
图４　K３Fe(CN)６浓度对测定皂苷元的影响
Fig．４　InfluenceofK３Fe(CN)６concentration
onthedeterminationoftigogenin
存其他组分,它们可能对该化学发光体系测定皂苷
元有一定的影响.为此,研究了 Na＋ 、Cl－ 、K＋ 、
BrＧ、CO３２－ 、SO４２－ 、NO３－ 、Fe３＋ 、Ca２＋ 、Cu２＋ 、
７３１１期　　　　 　　　　　　王彦超等:流动注射化学发光法检测剑麻皂苷元
图５　检测剑麻皂苷元标准曲线
Fig．５　Standardcurveoftigogenindetermination
Mn２＋ 、和淀粉、糊精、麦芽糖、蔗糖以及葡萄糖等分
别对１００μg􀅰mLＧ１的皂苷元进行干扰测定实验.
结果表明,它们不干扰测定.
２．４剑麻皂苷元加标回收率实验
剑麻皂苷元样品溶液中不同的加标量所测得的
回收率分别为９４．４％、９６．８％和１０４．３％,相对标准
偏差在２．９％~４．２％,均在误差允许范围内(表１).
表１　检测剑麻皂苷元加标回收率实验
Table１　Recoverytestoftigogenindetermination
编号
No．
含量
Content
(mg􀅰mLＧ１)
加标量
Addedvalue
(mg􀅰mLＧ１)
测得值
Measuredvalue
(μg􀅰mLＧ１)
回收率
Recoveryrate
(％)
RSD
(％)
１ ０．１０ ０．０５ ０．１４７ ９４．４ ３．７
２ ０．１０ ０．１０ ０．１９７ ９６．８ ２．９
３ ０．１０ ０．１５ ０．２５６ １０４．３ ４．２
表２　HPLC与FIＧCL方法测定皂苷元含量比较
Table２　Contrastcontentoftigogenindetermination
byHPLCandFIＧCL
实验材料
Experimentmaterial
测定方法
Determination
method
百分含量
Percentageof
composition(％)
RSD
(％)
皂苷元标准品Rutinstandard － ９８．０ －
剑麻残渣Sisalresidue HPLC ３．２ １．２０
FIＧCL ３．０ ２．１４
麻膏Sisalcream HPLC １６．７ １．５０
FIＧCL １６．３ ２．２１
３　结论与讨论
FIＧCL方法检测的样品大部分易溶于水,极少
部分微溶于水.如杨丹等(２００６)、马艳等(２０１３)和
Jiangetal．(２０１３)在用该方法分别检测大豆异黄
酮、黄体酮和穿心莲内酯时都是先用少量乙醇溶解
再用去离子水定容,曾华金等(２０１３)在用该方法检
测芦丁时用二甲基亚砜溶液(V(DMSO)∶V(H２O)
＝１∶１００)对芦丁片作预处理.本文选择了无水乙
醇作为检测样品的溶剂,溶解性较好.首先,乙醇比
水对LuminolＧK３Fe(CN)６化学发光体系有很强的
光抑制作用(图２);其次,当乙醇中溶解了一定质量
的皂苷元时,这种光抑制作用会减弱(即反抑光强
度)(图３,图４);最后,这种减弱的抑光强度与皂苷
元的浓度在一定的范围内成正比(图５).
FIＧCL方法分别测定了剑麻残渣和麻膏中皂苷
元的含量,同时与HPLC方法对样品检测结果进行
比较可知(表２),该方法检测两种材料中皂苷元的
结果与HPLC方法比较接近,HPLC方法的相对标
准偏差较小更接近于实际值,两种方法相对标准偏
差均在误差允许的范围内.麻膏中皂苷元的含量比
剑麻残渣中皂苷元的含量高出近５倍,是因为麻膏
来源于剑麻叶片经抽丝加工过程中压榨出的汁液,
经长期自然发酵风干而成.FIＧCL方法的优点是容
易操作且检测时间短,可实现皂苷元工业化生产中
的在线检测,极大地降低生产成本(Jiangetal．,
２０１３);缺点是检测样品结果的稳定性和重现性稍差
一些,稳定性和重现性由多种因素决定,比如光电倍
增管的灵敏度、反应池前进液管路的长短以及环境
的温度等.在实际操作中要尽量熟练,减小操作失
误产生的误差.
本文建立了流动注射LuminolＧK３Fe(CN)６化
学发光体系检测剑麻皂苷元的方法,并对检测条件
进行了优化;无水乙醇作为皂苷元样品的溶剂可行,
该方法为检测剑麻皂苷元提供了新技术及其理论依
据;由于该方法检测一个样品可以在３~５min内完
成,所以可以实现样品的批量检测,缩短检测时间,
以HPLC作为末端样品检测相结合,可应用于剑麻
皂苷元的工业化生产在线检测和农业上的剑麻皂苷
元高含量育种及栽培.
参考文献:
吴立军,娄红祥,周晶．２０１１．天然药物化学[M]．北京:人民卫生
出版社:３５０
CuiJF,BjorkhemI,EnerothP．１９９７．GaschromatographicＧmass
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Determinationofthreesteroidsapogeninsincrudesaponinof
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８３１ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷