全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 29(5)：689— 693 2009年 9月
假丝酵母菌 GXU08产脂肪酶发酵条件的优化
沈 芳1，刘雄民卜 ，刘力恒 ，黄荣韶0，李志刚3
(1．广西大学 化学化工学院，南宁 530004；2．玉林师范学院 化学与生物系，
广西 玉林 537000；3．广西大学 农学院，南宁 530004)
摘 要：以假丝酵母菌 GXU08产脂肪酶催化合成麝香类香料一环十五内酯 目前已备受关注，在一定条件下，
环十五内酯的转化率与脂肪酶的水解酶活有直接关系，酶活越高其催化合成环十五内酯的能力越强。通过单
因素试验和正交试验，对假丝酵母菌 GXU08产脂肪酶的发酵条件进行优化。结果表明 ：最佳发酵培养基配方
为蔗糖 0．5 ，淀粉 0．5 ，蛋白胨 1．5 ，KzHPO40．05 ，MgSO40．15 ，(NH4)2SO41 ，茶油 1．5 ，菜籽
油 1．5 ，pH一8，此培养基在 28℃，l80 r／min的条件下发酵培养 48h，脂肪酶水解活力达到 27．53 U／mL，是
初始发酵培养基条件下所得脂肪酶酶活的 3．74倍 ；其环十五内酯的转化率为 16．6 ，是优化前的 4倍。
关键词：假丝酵母菌；脂肪酶；发酵条件 ；正交实验；环十五内酯
中图分类号 ：Q789 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2009)05—0689—0 5
The optimization of fermentation conditions
of Candida sp．GXU08 lipase
SHEN Fang1，LIU Xiong-Minl ，LIU Li—Heng2，
HUANG Rong—Shao0，LI Zhi—Gang3
(1．Department of Chemistry and Chemical Engineering，Guangxi University，Nanning 530004，China：
2．Department of Chemistry and Biology。Teachers Colege，Yulin 537000，China；
3．Colege of,Agriculture。Guangxi University，Nanning 530004，China)
A~tmct；The synthesizing of cyc1opentadecanolide(a kind of macrocycle musk)by Candida sp． GXU08 lipase has
been concerned．Under certain conditions，the converse of cyclopentadecanolide was directly connected with lipase ac—
tivity．The higher the lipase activity was，the stronger the conversions were．The fermentation conditions of Candida
sp．GXU08 lipase were optimized through the single factor and the orthogonal experiments．The results showed that：
The compositions of optimal fermentation medium were sucrose 0．5 ，starch 0．5 ，peptone 1．5 ，Kz HPO4
0．05 ，MgSO4 0．15 ，(NH4)2SO4 1 ．camelia oil 1．5 ，rapeseed oil 1．5 ，pH一 8．0 Under the fermentation
condition of 28℃，180 r／min，48 h，the lipase activity would reach 27．53 U／mL，which was 3．74 times of the original
culture medium．The conversion of cyclopentadecanolide was 16．6 ，which was 4 times of unoptimized．
Key words：(~ndida sp．；lipase；fermentation condition；orthogonal experiments；cyclopentadecanohde
环十五内酯是一种重要的巨环麝香，具有良好
的定香作用，能使香精持久地保持芬芳气息。目前
国内尚无能力生产环十五内酯，完全依赖进口，因而
对环十五内酯的研究有非常重要的经济意义。广西
特产蒜头果(Malania Oleifer“)油中含有 5O 左右
的二十 四碳一l5烯 酸 (黄 品鲜等，1998；周永 红等，
2OO1)，经臭氧化一还原反应及 甲酯化后，得到 l5一
羟基十五烷酸甲酯，刘雄民等(2004)以假丝酵母菌
株 GXU08所产脂肪 酶催化该 酯合成环 十五表 lO
的方差分析验证了这一结果，从而得出最佳的培养
收稿日期：2008一O1—09 修回日期 ：2009—01—1 7
基金项目：广西大学科研基金(DD040045)[Supported by the Scientific Research Foundation of Guangxi University(DD040045)]
作者简介：沈芳(1978一)，女，湖北天门人．在读博士．主要从事植物有效成分的提取及天然香料的合成研究．(E-mail)nnbonnie@126．com。
‘通讯作者(Author for correspondence，E—mail：xmliul@gxu．edu．cn)
69O 广 西 植 物 29卷
基配 方：蔗 糖 0．5 ，淀 粉 0．5 ，蛋 白胨 1．5 ，
K2HPO40．05 ，MgSO40．15 ，(NH4)2SO,1 0／4，茶
油 1．5 0A，菜籽油 1．5％，pH值 8，发酵时间 48 h。内
酯。研究表明(沈芳等，2006)：在一定条件下，环十五
内酯的转化率随脂肪酶酶活的增加而增加，因而要提
高环十五内酯的转化率，有必要开展提高脂肪酶酶活
的研究。尽管目前国内外对产酶菌株发酵条件的优
化试验有很多研究 (牛冬云等，2003；张搏等，2007；
Zheng等，2000；Li等，2002；伍时华等，2006)，但对于
提高可催化合成环十五内酯脂肪酶活性的研究尚未
见任何报道。本研究主要通过单因素实验和正交实
验，对假丝酵母菌株 GXU08所产脂肪酶的发酵条件
进行优化，优化条件下所产脂肪酶将对提高天然香料
环十五内酯的合成转化率具有极大的意义。
1 材料与方法
1．1菌种
假丝酵母 菌株 Candida sp．GXU08，从广西大
学南区食堂下水道附近筛选得到。
1．2培养基
种子培养基(9／6)：葡萄糖 2．0，(NH ) SO4 0．5，
K HP04 0．1，MgSO4．7H O 0．1，蛋白胨 2．5，橄榄油
】．0，pH=7．0。搅拌均匀后分装于 500 mL锥形瓶
中，每瓶装量 100 mL，高温灭菌待用。发酵培养基
(9，6)：蛋白胨 1．0，酵母膏 0．2，牛肉膏 0．2，橄榄油
1．0，pH=6．0，搅拌均匀后分装于 500 mL锥形瓶中，
每瓶装量 100 mL，高温灭菌 20 rain，待用。
1．3培养方法
种子培养 24 h，接种量 1O 至发酵培养基 ，28
℃、180 r／min摇床培养 72h。
1．4分析方法
脂肪酶活力测定方法 ：用橄榄油乳化液法测定。
一 个酶活单位是在 pH7．0，40℃条件下，每 l rain
释放 l mmol游离脂肪酸的酶量(郭杰炎等，1986)。
2 结果与讨论
2．1单因素条件对产酶的影响
2．1．1碳源对产酶的影响 试验考察了8种碳源，
发现不同碳源对菌株产酶的影响不同，其中麦芽糖
对菌株产脂肪酶最有利，发酵液酶活为 7．78 U／
mL，是葡萄糖的 5．33倍 。其次是甘露醇 ，但这两者
都比较昂贵，从经济角度选择蔗糖和淀粉作为正交
试验的碳源(表 1)。
2．1．2氮源对产酶的影响 氮源分为有机氮源和无
机氮源，本试验分别研究了这两类氮源对产酶的影
响。(1)有机氮源对产酶的影响：考察了6种有机氮
源对菌株产酶的影响。从表 2可知，牛肉膏和蛋白
胨对产酶有较好的促进作用，但牛肉膏比较昂贵，从
经济角度考虑选择蛋白胨作为正交试验的有机氮
源。(2)无机氮源对产酶的影响：考察了6种无机氮
源对菌株产酶的影响。从表 3可知，硫酸铵对产酶
最有利 ，发酵 液酶活达 1O．96 U／mL，是硝酸钾 的
4．61倍 ，因 此选 择 硫 酸 铵 作 为正 交 试验 的无 机
氮源 。
表 1 不同碳源对菌株 GXU08产酶的影响
Table 1 Effect of different carbon sources on the lipase production of GXU08
表 2 不同有机氮源对菌株 GXU08产脂肪酶的影响
Table 2 Effect of different organic nitrogen sources on the lipase production of GXU08
2．1．3油料对产酶的影响 分别考察了 6种油料对
GXU08菌株产酶的影响。从表 4可知，茶油和菜籽
油对菌株产酶最有利，这两种油料价格适中，且原料
易得，故选茶油和菜籽油作为正交试验的油料。
2．1．4初始 pH值对产酶的影响 使用精密 pH计
将发酵液调成不同的 pH值，研究 pH一5．0～9．4
范围内发酵液的产酶情况。从表 5可知，当 pH值
为 9．0时对菌株产酶最有利，发酵液酶活高达 27．4
5期 沈芳等 ：假丝酵母菌 GXU08产脂肪酶发酵条件的优化 691
酶 活力 I．ipase activity(U mI ) 6．026 10．96 2．375 6．941 4．019 2．923
R 0．418 1．106 3．I58 1．281 3．900 0．712
酶活力 1．ipase activity(U／ml )
R
10．58
2．105
U／mL，是酸性条件 pH一5．0的 19．6倍 ，其次 为
pH一8．0和 pH=7．0。因此 ，可选择 pH一7．0，
8．0，9．0分别作为正交试验的条件。
2．1．5发酵时间对产酶的影响 每一种菌株都有一
个最适发酵时间，在最适时间下产酶量最高 ，而随着
时间的延续 ，菌株逐渐衰退，产酶量随之下降。为寻
找最适发酵时间，实验分别考察了 GXU08菌株在
发酵不同时间后的产酶情况。从表 6可知，菌株发
酵36 h和 48 h对产酶比较有利，发酵液酶活可达
l2．55 U／mL和 11．40 U／mL。故选择 36h和 48 h
作为正交试验的发酵时间。
2．1．6发酵温度对产酶的影响 脂肪酶作为一种蛋
白质，在 4j℃以上极易失活。一般来说，在一定范
围内，酶的活力随温度的升高而增加，超过一定温度
表 5 不同初始 pH值对菌株 GXU08产脂肪酶的影响
Table 5 Effect of different original pH on
the lipase production of GXUO8
酶活力(U／mI ) 1．40 5．67 9．15 9．78 27．4 8．1
Lipase activity
R 4．461 2．450 1．446 0．354 1．931 3．241
表 6 不同发酵时间对菌株GXU08产脂肪酶的影响
Table 6 Effect of different time on the
lipase production of GXUO8
表 7 不同温度对菌株 GXU08产脂肪酶的影响
Table 7 Effect of different temperature on the lipase production of GXU08
温度 Temperature(℃ ) 20 22 24 26 28 30 32 34
酶活力 Lipase activity(U ml ) 12．30 12．79 12．97 17．36 17．58 17．49 14．42 l3．66
R 3．544 2．854 2．142 3．893 3．985 2．658 1．927 3．517
酶活即下降．为了寻找最适发酵温度本试验按 1O 9，6
的接种量接人菌株后 ，分别置于 8种温度的摇床 中
以 18O r／min的速度振荡培养 48 h，测定发酵液酶
活。由表 7可见 ，在 26、28、3O℃的条件下发酵液酶
活相对较高，且三者酶活大小几乎相等，因而直接选
择 28℃作为发酵温度。
上述讨论的单因素条件：碳源、氮源 、油料 、初始
pH值、时间、温度的实验中R值均小于 j，在正常误
差范围内，因而实验数据具有科学依据。
2．2正交试验
2．2．1三水平十因素正交试验 根据单因素试验的
结果，选择三水平十因素对发酵培养基进行正交试验
(表8、9、10)。从表 9可见，不同的试验因子对菌株产
酶的影响次序：时间>茶油>蛋白胨>pH值>菜籽
油>K：HPO4>淀粉>蔗糖>(NH )2SO4>MgS04。
表 l0的方差分析验证了这一结果，从而得出最佳的
培养基配方：蔗糖 0．5 ，淀粉 0．5 ，蛋白胨 1．5 ，
K2HP04 0．05 ，MgSO4 0．15 ，(NH )2SO4 1％，茶
油 lI 5 ，菜籽油 1．5Vo，pH值8，发酵时间48 h。
2．3验证试验及结论
在最优发酵培养基组成和发酵条件下，测定发酵
液酶活。结果表明：初始发酵培养基条件下所得脂肪
哪
2
唧
8
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酶 ¨ R
692 广 西 植 物 29卷
表 9 L27{310)正交试验结果分析 (直观分析法)
Tahle 9 Analysis of L27(310)orthogona[
design (visual analysis)
酶的酶活为7．36 U／mL，而优化条件下所得脂肪酶的
酶活为27．53 U／mL，是优化前酶活的 3．74倍。以优
化条件下所得脂肪酶为催化剂 ，l5一羟基十五烷酸甲
酯为底物，在 4O℃，180 r／rnin条件下反应 72 h，所得
环十五内酯的转化率为 16．6 ，是未优化前转化率
4．1 的 4倍。与查阅的相关文献报道的微生物产脂
肪酶催化长链脂肪酸酯合成环十五内酯相比较 ，该技
术尚处于国内外领先水平。
表 10 L27(310)正交试验结果分析 (方差分析法)
Table l0 Analysis of L27(310)orthogonal
design (variance analysis)
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Shen F(沈芳)，Liang JJ(梁静娟)，Liu XM()Ij雄民)．Lipase cata一
(上接第 643页 Continue from page 643)
burg，1994；Rascio等，1998)。通常把束缚水当作抗旱
重要因素，植物保水力与束缚水含量有关，束缚水多干
旱时植物体内保持的水量也就多，从而不易受旱害。
渗透调节是植物在逆境条件下降低渗透势，抵抗逆境
胁迫的一种重要方式，在一定胁迫范围内，某些植物通
过自身的渗透调节作用表现出抗外界胁迫的能力，它
是植物重要的抗逆生理机制(朱志梅等，2003；Levit，
1980)。甘草是典型的耐旱沙生植物，耐旱机理除已有
的研究指出其具有发达的根系能吸收沙地、沙漠深层
水分外，本研究发现可溶性多糖是甘草重要的渗透调
节物质，并且叶片专门分化出具有遗传特征和生物活
性的能分泌多糖的外分泌腺，通过腺体向外分泌多余
的多糖来维持叶片内部一定的多糖含量和渗透势，在
一 定范围内主动调节自身和干旱环境的适应性也是甘
草在形态和生理上特有的重要耐旱特征和作用。
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