全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 30(5)：682— 685 2010年 9月
柑橘愈伤组织生长速度与体细胞胚胎发生的关系
张俊娥
(江西师范大学 生命科学学院，南昌 330022)
摘 要：为了探讨柑橘愈伤组织不能再生的原因，试图寻找柑橘愈伤组织生长速度与其体细胞胚胎发生之间
的关系，对7种柑橘类型的29种基因型的愈伤组织的生长速度进行了测定，并对愈伤组织生长速度与体细胞
胚胎发生之间的相关性进行了统计分析。结果表明，柑橘愈伤组织生长速度与体细胞胚胎发生之间的相关系
数为 r=～0．3683。由此推断在这两者之间还存在其它影响因素。
关键词：柑橘 ；愈伤组织 ；生长速度；体细胞胚胎发生
中图分类号：Q943 文献标识码 ：A 文章编号：1OOO一3142(2O1O)O5—0682—04
Relation between callus growth spccd and
som atic em DI．v0 neSlS Ot CltrusA ● 1 ● ⋯
ZHANG Jun-E
(Colege of Life Science，Jiangxi Normal University，Nanchang 330022，China)
Abstract：In order to discuss the cause of loss of regeneration capability of citrus calus，and tO look for the relation be-
tween callus growth speed and somatic embryogenesis，in this study，ealli growth speed of twenty-nine genes from
seven citrus types were detected，and the correlation between calus growth speed and somatic ambryogenesis was sta—
tistieally analyzed．The results showed that correlation coefficient of the growth speed and somatic embryogenesis was
一 0．3683．It was thus deduced that other influence factors stil occured between them．
Key words：citrus；callus；growth speed；somatic embryogenesis
植物组织培养中，愈伤组织经长期继代后分化
能力的保持问题，一直是细胞工程研究中的重要课
题(45明光等 ，1982；Hao& Deng，2002)。已有不
少报道指出，愈伤组织长期继代后 ，分化能力降低是
较为普遍的现象，如胡萝 卜、烟草和水稻，在继代多
次后，愈伤组织分化植株的能力就会完全消失(Mu—
rashige＆Tucker，1969；佘建明等，1984)。但也有
一 些植物的愈伤组织在继代中，它们分化能力是可
以很好保持的。如玉米，花粉愈伤组织继代两年后
仍有很强的植株再生能力 (佘建明等 ，1984)。而不
同基因型的柑橘愈伤组织经长期继代后分化能力却
有所不同，一些柑橘愈伤组织继代多年后仍有再生
能力，但有些愈伤组织在继代不长时间就丧失了再
生能力(张俊娥等，2006)。这些丧失了再生能力的
柑橘愈伤组织是非常重要的遗传育种材料，它们在
柑橘遗传转化、离体诱变、离体筛选突变体、快速繁
殖中发挥重要的作用。我们面临的问题是，如何才
能让这些丧失了再生能力的柑橘愈伤组织恢复再生
能力?柑橘愈伤组织的再生能力又跟哪些因素有关
呢?张俊娥等(2006)对影响柑橘体细胞胚胎发生能
力的可能影响因素进行了分析，结果表明，柑橘体细
胞胚胎发生能力与愈伤组织的倍性变化无关，也与
愈伤组织继代时间无关。就在寻找影响柑橘体细胞
胚胎发生能力的可能影响因素之时，作者在对柑橘
收稿日期：2009-03-29 修回日期：2009—12—16
基金项目：国家自然科学~ (30370743)；江西师范大学博士启动资金(2441)[Supported bytheNationalNatural Science Foundation ofChina
(30370743)；Doctoral Start-up Foundation of Jiangxi Normal university(2441)]
作者简介：~ (1972一)，女，山西榆社人 ，博士，副教授，研究方向为植物生物技术与遗传育种 ，(E-mail)zhangjune2001@yahoo．corn．cn。
5期 张俊娥 ：柑橘愈伤组织生长速度与体细胞胚胎发生的关系 683
愈伤组织的继代过程中发现，具有再生能力的柑橘
愈伤组织生长速度比较慢，如暗柳橙，伏令夏橙等，
而失去再生能力的愈伤组织生长速度却较快 ，如国
庆 1号，意大利血橙等。那么，柑橘愈伤组织的生长
速度与体细胞胚胎发生是否是负相关的关系呢?如
果是，我们就可以通过调节愈伤组织的生长速度来
调节体细胞胚胎发生。为此，本试验对 7种柑橘类
型的29种基因型的愈伤组织的生长速度进行了测
定，对愈伤组织生长速度与体细胞胚胎发生之间的
相关性进行统计分析，为进一步研究柑橘体细胞胚
胎发生提供依据。
1 材料和方法
1．1试验材料
供试愈伤组织取 自华 中农业大学作物遗传改 良
国家重点实验室(供试材料的外植体主要来源于柑
橘幼嫩胚珠和未受精败育胚珠)。供试材料继代培
养基为改良的 MT4-30 g／L蔗糖 +7 g／L琼脂 ，不
加任何激素 。用于体细胞胚胎发生研究 的材料分别
属于 7种柑橘类型有 29种基因型。供试材料的基
因型和继代培养时间见表 1。
表 1 供试的 29种不同基因型的柑橘愈伤组织
Table 1 Twenty-nine citrus embryogenic ealli of different genotypes
1．2试验方法
1．2．1测定柑橘愈伤组织的生长速度 将柑橘愈伤
组织用滤纸吸干后称取 0．5 g接种到 MT固体培养
基上，在光照培养室培养 30 d，然后将增殖的愈伤组
织用滤纸吸干后称重 ，并根据公式计算生长速度 ，生
长速度一(增殖后重量一增殖前重量)／增殖前重量 。
每个基因型设 3次重复 。
1．2．2诱导体细胞胚胎发生及统计其个数 诱导体
684 广 西 植 物 3O卷
细胞胚的培养基为改 良的 MT+2O ml／L甘油 +7
g／L琼脂。愈伤组织在诱 导培养基上生长 1月后 ，
每种材料随机取 3瓶 ，在每瓶 中随机称取 0．3 g放
在小培养皿 中，加少量水使其散开 ，在体视显微镜下
统计体细胞胚个数 ，用记数器记数 。每瓶重复 3次 。
1．2．3分析方法 愈伤组织的生长量之间和胚状体个
数之间的差异显著性分析采用 SPSSIO．0分析软件。
表 2 柑橘愈伤组织体细胞胚胎发生能力的比较
Table 2 Comparison of competence for somatic
embryogenesis in citrus eali
注：差异显著性采用邓肯氏新复极差分析(P
Note；Significant difference was analysed via Duncan Analyse(P
d 0．01)，same capital letter in the column means insignificant．
图 1 佛罗斯特脐橙(A)和澳洲指橘(B)愈伤
组织在甘油培养基(20 ml／L)上再生胚状体
Fig．1 Somatic embryogenesis of Frost and
M icrocitrus on glycerol medium
2 结果与分析
2．1柑橘愈伤组织再生胚状体能力大小比较
本试验对 29种不同基因型的柑橘愈伤组织进
行体细胞胚诱导并统计其个数。结果表明，它们再
生胚状体的能力大小不同(表 2)。无 酸甜橙、佛罗
斯特脐橙、伏令夏橙、暗柳橙、美国酸橙有极强的再
生能力，每克再生群体 中胚状体数超过 1 600个(图
1)；红肉脐橙属于易再生的品种，每克再生群体中胚
状体数分别为890个和 853个；茶香柑、澳洲指橘具
有再生能力，每克再生群体中胚状体数分别为 607
个和349个(图 1)。具有再生能力的 8种愈伤组织
中，不同基因型愈伤组织的体细胞胚胎发生能力之
间存在显著性差异。其它 21种愈伤组织在甘油培
养基上长不出胚状体。分析表 2可见，12种甜橙愈
伤组织中，有 5种愈伤组织在甘油培养基上能长出
胚状体，且胚胎发生能力均较强；而 1O种宽皮柑橘
愈伤组织中，只有 1种具有再生能力，且胚胎发生能
力次于甜橙类愈伤组织。柑橘愈伤组织再生胚状体
如图 1所示。
2．2柑橘愈伤组织生长速度与体细胞胚胎发生能力
之 间的关 系
试验中发现，暗柳橙、伏令夏橙和佛罗斯特脐橙
等愈伤组织在 MT培养基上生长比较缓慢，当转入
甘油培养基时，它们能够再生胚状体；而国庆 1号、
意大利血橙和默科特桔橙等愈伤组织在 MT培养
基上增殖很快，但是当转入甘油培养基上时，它们不
能再生胚状体。于是，对 29种基因型的愈伤组织的
生长速度进行测定 ，试 图发现柑橘愈伤组织生长速
度与体细胞胚胎发生能力之间的定量关系。结果如
表 3所示。不同基因型愈伤组织的生长速度之间存
在显著性差异。分析柑橘愈伤组织生长速度与体细
胞胚胎发生能力之间的相关性发现，两者的相关系
数是 r一一0．3683(P
到显著水平，可能在两者之间还有其它影响因素起
作用。
3 讨论
在植物繁殖和遗传操作中，研究离体再生体系
所面临的主要问题之一是胚胎发生能力和器官发生
能力的丧失 。Torrey(1967)和 Murashige(1969)等
认为，随着时间的推移，多倍化和非整倍化提高，胚
胎发生能力逐渐丧失。这些变化是遗传因素或生理
因素引起的。D，Amato(1985)却认为，离体培养条
件下，再生能力的决定因素不一定总是遗传因素引
起的。高频率的体细胞胚胎发生对于植物细胞的遗
传转化、离体诱变、离体筛选突变体、快速繁殖等工
作具有特别重要的意义。但柑橘愈伤组织具有普遍
不能再生胚状体现象。为探询柑橘愈伤组织不能再
5期 张俊娥 ：柑橘愈伤组织生长速度与体细胞胚胎发生的关系 685
生胚状体的原因，作者做了诸多探索。张俊娥等
(2006)分析了柑橘愈伤组织倍性变化及其与体细胞
胚胎发生能力的关系，结果表明，柑橘愈伤组织倍性
变化与体细胞胚胎发生能力之间的相关性较小。另
外 ，柑橘胚性愈伤组织继代时间与体细胞胚胎发生
能力之间的相关性也不显著。本文对 29种柑橘愈
表 3 29种不同基因型的愈伤组织生长速度与体细胞胚胎发生能力的比较
Table 3 Comparisons between the growth speed and competence for somatic embryogenesis of twenty-nine citrus calli
伤组织生长速度进行 了定量测定 ，对愈伤组织生长
速度与体细胞胚胎发生的关系进行了研究，分析了
29种愈伤组织生长速度与体细胞胚胎发生能力之
间的相关关系。结果发现，具有再生能力的柑橘愈
伤组织生长速度确实比较慢 ，如暗柳橙 的生长速度
只有 2．23-+-0．33，伏令夏橙的生长速度 只有 3．29±
0．16，对于失去再生能力的愈伤组织生长速度也确
实较快 ，如国庆 1号 的生长速度达 到 8．33±0．22，
意大利血橙的生长速度达到 8．24±1．00。然而，在
统计分析柑橘愈伤组织的生长速度与体细胞胚胎发
生能力之间的相关关 系时却发现 ，它们 的相关系数
仅为 r一一0．3683。由此推断 ，在这两者之 间还有其
它影响因素的存在。另外，作者也对其它可能影响
柑橘愈伤组织再生能力的影响因素(碳源、高温和低
温等)作了探索，结果发现，不同碳源对具有体细胞
胚胎发生能力的柑橘愈伤组织的影响各异，但对于
失去再生能力的愈伤组织而言，不同碳源似乎对其
体细胞发生不起作用 。高温与低温处理的愈伤组织
体细胞胚胎发生能力的影响也不是很明显。有望为
研究柑橘愈伤组织体细胞胚胎发生提供依据。
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600 广 西 植 物 30卷
谱数据库能够灵敏、可靠、稳定地反映甘蔗种质资源
的遗传特 性。本研究 中 21对核心 引物 由 Pan
(2006，2007)从 221对 SSR引物中筛选而来 ，利用
SSR荧光标记结合 DNAMAN软件、NTSYS软件，
满足了构建甘蔗种质资源指纹图谱数据库和遗传分
析的要求。在以后的研究中，随着甘蔗材料数量增
加，可筛选增加 SSR引物，使指纹图谱数据库满足
鉴定甘蔗品种与甘蔗育种的要求。
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