全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 29(6)：894— 898 2009年 11月
罗汉果 SRAP反应体系的建立与优化
刘丽华 ，马小军 ，孙晶晶2，覃嘉明3，魏建和l
(1．中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；2．辽宁工程
技术大学 理学院，阜新 123000；3．广西玉米研究所 ，南宁 530227)
摘 要：建立适合罗汉果的SRAP—PCR扩增体系，为罗汉果的遗传图谱构建及基 因定位奠定基础。实验对罗
汉果 SRAP—PCR反应体系的影响因素(引物，dNTP，Taq酶 ，Mg2+，模板 DNA)在多个水平上进行优化试验，
筛选出各反应因素的最佳水平，建立了罗汉果 SRAP—PCR反应 的最佳体系(10 L)：引物 0．6／~mol／L、dNTP
0．25 mmol／L、Taq DNA聚合酶 0．5U、Mg2+2．0 mmol／L和模板 DNA 30 ng。该体系的建立能很好的满足
罗汉果基因组 DNA 的扩增要求 ，SRAP标记应用于罗汉果遗传研究是可行的。
关键词：罗汉果；SRAP—PCR；反应体系；建立
中图分类号 ：Q943．2 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2OO9)06—0894—05
Establishment and optimization 0f SRAP
reaCtlOn system In tral tla ~ros venorll ●● ． ● ● ●● ●●
I IU Li—Hua ，MA Xiao—Jun1，SUN Jing-Jing ，
QIN Jia—Ming3，WEI Jian-HeI
(1．Institute of Medicinal Plant Development，China Academy Medicinal Science，Chinese Peking Union Medical
Colledge，Beijing 100193，China；2．Colege of Science，Liaoning Technical University，Fuxin 123000，
China：3．Guangxi Maize Research Institute，Nanning 530227，China)
Abstract：The design was used to establish SRAP-PCR amplification system on Siraitia grosvenorii DNA SO as to lay
foundation for genetic map construction and gene mapping．The factors influencing SRAP analysis，including primers，
dNTP，Taq polymerase，Mg抖 ，and the concentration of DNA template were studied in a number of levels respective—
ly．The results showed that：0．6,umol／L primer，0．25 mmol／L dNTP，0．5U Taq DNA polymerase，2．0 mmol／L
Mg + and 30 ng DNA template in 10／*L reaction system were the best suitable SRAP-PCR system for Siraitia gros—
venorii．It was feasible to app[y SRAP marker in genetic research in Siraitia grosvenorii．
Key words：Siraitia grosvenorii；SRAP—PCR reaction system；establishment
SRAP标记(Sequence_related amplified polymor—
phism，序列相关扩增多态性)是美国加州大学蔬菜系
等(2001)发明的一种新型分子标记技术。他们针
对基因外显子中GC含量丰富而启动子、内含子里
AT含量丰富的特点来设计引物进行 PCR扩增，因不
同个体的内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多
态性。该标记具有简便、高效、产率高、高共显性、重
复性好、易测序、便于克隆目标片段的特点，目前己被
成功的应用于作物遗传多样性分析、遗传图谱的构
建 、重要性状的标记以及基因定位的研究(Ferriol等，
2003a；Feriol等，2003b；Sun等，2007；Li等，2003)。
罗汉果(Siraitia grosvenorii)属葫芦科罗汉果
属多年生草质藤本植物，是我国特有的经济、药用植
物，为广西传统特产。罗汉果营养价值高，含有丰富
的果糖、蛋白质和多种维生素，共性凉味甘，具有清
肺止咳，润肠通便的功效 ，对慢性气管炎、急慢性咽
喉炎和扁桃体炎等疗效显著。其果实中含有低卡路
里的甜味成分，是理想的天然甜味剂，可作为食品、
收稿日期：2009—06一l6 修回日期：2009—10—2O
基金项目：国家科技支撑计划课题(2006BA109B01—07)[Supported by the National Key Technology R 8L D Program(2006BA109B01—07)]
作者简介：刘丽华(1980一)，女 ，河北献县人，博士研究生，生药学专业。
通讯作者(Author for c0rresp0ndence，E—mail：xjma@public．bm．net．cn)
6期 刘丽华等：罗汉果 SRAP反应体系的建立与优化 895
菜肴的甜味剂，是糖尿病人、肥胖病人理想的食糖代
用品，具有极高的经济价值 。目前应用于罗汉果的
遗传 标 记 有 ISSR(彭 云 滔 等，2005；周 俊 亚 等，
2005)，RAPD(周俊亚等，2006；秦新民等，2007；韦
素玲等，2008)等方法，主要用于罗汉果性别相关研
究、指纹图谱构建 以及遗传多样性分析等方面。但
SRAP应用于罗汉果的研究尚未见报道。本试验拟
对影响罗汉果 SRAP—PCR反应体系的主要因子进
行研究，建立适合 罗汉果 SRAP分 析的反应体系，
为罗汉果遗传多样性、亲缘关系和遗传图谱构建等
方面的研究提供技术支持 。
1 材料与方法
1．1材料及主要试剂
所用材料为长滩果和野 红一号杂交产生的 F2
组配苗 ，采摘嫩 叶一7O℃保存。以其 中一个 罗汉果
植株的基因组 DNA作为优化实验材料。SRAP引
物由上海生物工程有 限公司合成 ，Taq DNA聚合
酶、dNTP、1O×PCR buffer等购 白天根 生化科技有
限公司，DNA Marker(DL2000)分子量标 准购 自宝
生物工程(大连)有限公司。
图 1 提取样品的总 DNA检测结果
Fig．1 Electr0ph0resis results of genomic DNA of samples
1．2基因组 DNA的提取
用改 良 CTAB法提取 基 因组 DNA(Sterward
等，l993)。提取的总 DNA用 l％的琼脂糖凝胶电
泳检测其纯度及完整性(图 1)。分光光度计测定结
果显示，A： 。／A 。值位于 1．7～1．9之间。结果表
明，用改良的 CTAB方法 提取，能够得到高质量的
DNA，可以直接用于 SRAP—PCR反应。
1．3 SRAP-PCR程序
PCR反应在 BIOMETRA TGRADIENT96型温
度梯度 PCR仪上进行。PCR反应扩增程序：94℃预
变性 5 min，前 5个循环 94℃变性 45 S，35℃复性 45
S，72℃延伸 45 S；随后将退火温度升至 5O℃，其它条
件不变，进行 35个循环，最后 ，72℃延伸 7 rain。
1．4 SRAP-PCR体系
为得到扩增稳定 、重复性好的 SRAP—PCR反应
体系，对影响 PCR的 5个主要因素(模板 DNA，Taq
酶 ，Mg“ ，dNTP和引物)分别进行单 因子多水平的
优 化 实 验。 以 DC1(TAAACAATGGCTACT—
CAAG)和 OD3(CCAAACCTAAAACCAGGA)引
物组合进 行 PCR 扩增 已确定 最佳 反应体 系。
SRAP—PCR反应的主要因素水平见表 1。
表 l SRAP-PCR反应的因素与水平
Table】 Factors and leve1S of SRAP—PCR reaction
L evel P rime dNT P s Taq DNA
、 Mg 模板(ng)N#N(U Ivl~T
⋯ 。
(⋯
0．05．
0．10
0．15
0．2O
0．25
0．30
0．35
O．25
0．5O
0．75
1．OO
1．25
0．5
1．0
1．5
2．0
2．5
3．0
1．5 SRAP扩增产物的电泳检测
扩增产 物加 1 L Loading buffer混匀后 ，取
1．5 L用 6 非变性聚丙烯酰胺凝胶 电泳，电泳缓
冲液为 1×TBE。180V 电泳 1．5 h，电泳结束后银
染 ，拍照观察。
2 结果与分祆
2．1引物浓度对 SRAP扩增结果的影响
要获得扩增清晰的特异性条带，引物的选择及
用量很重要。引物用量小，与模板 DNA结合效率
低 ，产物产量会受到影 响；引物浓度大，非特异性结
合的机率增加，引物之间形成引物二聚体的概率也
会增加，引物也会和Taq DNA聚合酶竞争与Mg
结合的机率 。由图 2可 以看 出，当引物浓度 为 0．5
umol／L时，扩出的条带少且模糊 ；浓度为 0．6～1．1
／lmol／L时，都能扩出特征带 ，以 0．6和 0．7／~mol／I
扩增清晰，但随着引物浓度的增大，条带逐渐减弱。
当引物浓度为 1．2 umol／L时，没有条带扩出。考
虑引物浓度过高会增加引物二聚体的形成机率，故
∞ ∞ ∞ ∞ ∞
5 6 7 8 9 O 1 2
0 O O O 0 1 1 1
896 广 西 植 物 29卷
选择 0．6 tzmol／I 为引物的最适浓度。
图 2 引物浓度对 SRAI 扩增结果的影响
Fig．2 Effect of SRAP amplified result
on c。ncentration of primers
M：Marker；1—8：0．5、0．6、0．7、0．8、0．9、1．0、1．1、1．2 t*mol／L。
2．2 dNTPs浓度对 SRAP扩增结果的影响
dNTPs是 PCR 扩增反应 的原 料，为 PCR中
Taq DNA 聚合酶 提供底 物，使得产 物得 以延 伸。
dNTPs浓度过低时，扩增产物减少；浓度过高时，会
增加错误率，同时会 与 Taq DNA 聚合 酶竞争
Mg抖，使反应体系中的 Mg抖总量下降，从而抑制
Taq DNA聚合酶的活性，影响 PCR效率 ，甚至会阻
止反应进行。由图 3看出，dNTPs浓度在 0．10～
0．30 mmol／L之间时，随着 dNTPs浓度的增加，扩
增条带 由弱到 强，主带 也 明显增 多，浓 度为 0．25
mmol／L和 0．3O mrnol／L时，扩增 效果相似；浓度
升高到0．35 mmol／L时，由于一部分 dNTPs竞争
了Mg抖，而使 Taq DNA聚合酶活性下降，扩增产
物量下降，出现条带缺失现象。因此我们确定 0．25
mmol／L为 dNTPs最适浓度。
2．3 Taq DNA聚合酶浓度对 SRAP扩增结果的影响
Taq DNA聚合酶浓度过大会造成浪费，并且会
导致非特异性扩增 ；浓度过小会影响扩增效率 ，降低
扩增产物的产量。Taq DNA聚合酶在 PCR中的用
量还会受反应体积 、酶活性 、酶耐热性等诸多因素的
影响。在本试验中，5个 Taq DNA聚合酶浓度都有
条带扩出，当 Taq DNA聚合酶用量为 0．25 U时，
扩增条带较弱；当 Taq DNA聚合酶用量为 1 U和
1．25 U 时，非特异性条带增加 ，而用量为 0．25 U和
0．5 U时，扩增条带较多且 清晰，差异不大 (图 4)。
出于节约试验成本 的考 虑，将 0．5 U 确定为 Taq
DNA聚合酶的适宜用量。
图 3 dNTPs浓度对 SRAI 扩增结果的影响
Fig．3 Effect of SRAP amplified result
on concentration of dNTPs
M ：Marker；1 7：0．05、0．10、0．1 5、0．20、0．25、0 30、0．35 mmol／L。
图 4 Taq DNA 聚合酶浓度的 SRAI 扩增结果
Fig．4 Effect of SRAP amplified result on
concentration of Taq DNA polymerase
M：Marker；1—5：0．25、0．5O、0．75、1．0、1．25 U／IO>L。
2．4 Me 浓度对 SRAP扩增结果的影响
Mg 浓度可直接影响 SRAP扩增条带的强弱。
它不仅影响酶的活性及合成的真实性，而且影响引
物的退火、模板和中间产物的解离温度、产物的特异
性 、引物二聚体 的形成等。Mg。’是 Taq酶 的激活
剂 ，Mg抖不足时 ，Taq酶的作用效率降低 ，且 dNTP
竞争 Mg抖。Mg抖受 dNTP总量的影响。本试验
对 Mg 浓度设 置了 6个处理 ，由图 5可以看出，
Mg 浓度为 0．5 mmol／g时 ，无扩增产物；Mg抖浓
度为 1．0～1．5 mmol／L时，扩增条带较少，比较模
糊；当浓度为2．O～3．5 mmol／L时，扩增条带增多，
主条带清晰，以 2．5 mmol／I 扩增效果最好。因此
Mg。 最适浓度为 2．5 mmol／I 。
2．5模板 DNA浓度对 SRAP扩增结果的影响
模板 DNA浓度对 PCR扩增有很重要的影响，
6期 刘丽华等：罗汉果 SRAP反应体系的建立与优化 897
它的用量关系着产物的产量和特异性 模板 DNA
浓度过低，扩增产物无或不稳定；浓度过高，产物的
背景太强影响读 带。由图 6可 以看 出，8个 模板
DNA浓度都扩增出完整的条带 ，但在 10～2O ng时
条带较弱；在 3O～70 ng时可得 到一致且清晰的扩
增条带 ，因此模板 DNA浓度在 3O～7O ng时均可；
当模板浓度增加到 8O ng时条带反而减弱。考虑到
模板浓度过高会相应增加非特异性条带的扩增，因
此 ，选择 3O ng为 PCR扩增时的模板浓度。
图 5 Mg +浓度对 SRAP扩增结果的影响
Fig．5 Effect of SRAP amplified result
on M g + concentration
M ：Ma rker；1 5：0．5、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0 mmol／L。
图 6 模板 DNA浓度对 SRAP扩增结果的影响
Fig．6 Effect of SRAP amplified result
on DNA concentration
M ：Marker；卜8：10、20、3O、40、50、60、70、80 ng。
2．6罗汉果 SRAP—PCR反应体 系的建立及群体检测
根据以上实验结果确立罗汉果 SRAP—PCR反
应体系：反应总体积 1O L中，模板 DNA 30 ng，
MgH 2
． 0 mmol／L，引物 0．6 gmol／L，dNTPs 0．25
mmol／L，Taq DNA聚合酶 0．5 U。采用该体系筛
选出6O对 SRAP引物，进行 SRAP群体检测。引
物组合 PM8(CTGGTGAATGCCGCT CT)和 GA8
(GGCTTGAACGAGTGACTGA)对群体扩增结果
如图 7，扩增条带清晰，个体间有不同程度的多态性。
3 讨论
近年来 ，随着罗汉果研究的深入 ，已有多种分子
标记用于罗汉果的分子生物学研究，主要有 AFLP
(陶莉等，2005)，RAPD(秦新民等 ，2007；周俊亚等，
2006)，ISSR(彭云滔等 ，2005；周俊亚 等，2005)等。
RAPD技术操作简单，但稳定性差、扩增产率低；
AFLP技术虽具很高的扩增产率 ，但其操作步骤繁
琐、技术难度高，且为显性标记；ISSR技术操作简
单、快速，重复性好，遗传多态性高，但也是显性标
记，且 PCR扩增时需要一定时间摸索最适反应条
件。SRAP标记技术结合 RAPD和 AFLP二者的
优点 ，通过设计独特的上下游引物，对外显子、内含
子区域、启动子区域进行特异性扩增，具有简便、稳
定 、中等产率、便于克隆 、测序 目标片段 的特点。此
标记的应用将进一步推进罗汉果分子生物学研究进
程 。
SRAP扩 增 体 系 中模 板 DNA、Mg 、引物 、
dNTPs、Taq DNA 聚合酶等各组分的用量均会影响
扩增结果。本试验在优化 SRAP扩增体系时发现，
引物、dNTPs、Mg抖 、Taq DNA聚合酶作为 PCR扩
增的原料，有一个相对适宜的用量范围，浓度过低，
不能满足扩增要求；浓度过高，组分间可能会产生竞
争，影响扩增效果 。在对模板 DNA 进行 优化时发
现，SRAP扩增对模板 DNA 的浓度要求不高 ，1O～
80 ng的模板都可 以扩增 出条带 。此结果与任羽等
(2004)对辣椒、武志朴等 (2005)对小麦 、周春娥等
(2009)对怀地黄的研究结果基本一致 ，说 明 SRAP
分子标记对 DNA模板的浓度要求不高。
有关 SRAP的程序和反应体系优化的报道很
多(徐莹莹等，2008；曾柏全等，2008；邹枚伶等，
2009)，但不同植物适合的 SRAP体系不同，而且同
一 种植物在不同实验室所做的研究也会有差异。因
此，构建同一物种在相同仪器设备和一定操作规范
下的最佳优化技术体系是进行 SRAP研究的关键
所在。本实验优化 了适应 罗汉果 的 SRAP反应 体
系，体系稳定且扩增条带丰富，重复性好，将为后续
研究罗汉果遗传多样性、基因定位、基因克隆及遗传
图谱构建打下良好基础。
898 广 西 植 物 29卷
参考文献 ：
图 7 SRAP引物 PM8一GAS对罗汉果的群体检测
Fig．7 E1ectrophoresis of amplification products of Siraitia grosvenorii
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