全 文 ：　 　 倡 　 农业部 “９４８”引进项目 （No ．９９１０６３）资助
　 　 倡倡 通讯作者
收稿日期 ：２００６唱０３唱１８ 　 改回日期 ：２００６唱０７唱２６
免疫分析在农药残留检测中的应用和发展 倡
王文 １ 　刘兴春２ 　李 　季１ 倡倡
（１畅 中国农业大学资源与环境学院 　 北京 　 １０００９４ ；２畅化学工业出版社 　 北京 　 １０００１１）
摘 　 要 　 通过分析免疫分析技术的基础 ——— 抗原抗体制备技术 ，进一步论述了主要免疫方法（放射免疫分析 、酶免
疫分析 、荧光免疫分析 、化学发光免疫分析等）的发展过程及其在农药残留检测中的应用 。 重点介绍了近年来免疫
分析的新发展 ，尤其突出了免疫分析和理化分析联用技术这一痕量分析的新主流 。 探讨了免疫分析技术存在的问
题和免疫分析的未来发展趋势 。
关键词 　 免疫分析 　 农药残留 　 抗体 　 抗原
Development and application of immunoassay in pesticide residue analysis ．WANG Wen唱Jun１ ，LI U Xing唱Chun２ ，LI Ji１
（１ ．College of Natural Resources and Environmental Sciences ，China Agricultural Universit y ，Beijing １０００９４ ，China ；２ ．
Chemical Indust ry Press ，Beijing １０００１１ ，China） ，CJEA ，２００７ ，１５（６） ：１９５ ～ １９９
Abstract 　 This article reviews technical development of antibody and antigen preparation and application methods of a
handful of major immunoassay （ radioimmunoassay ，enzyme immunoassay ，fluorescence immunoassay ，chemiluminescence
immunoassay ，etc ．）in the analysis of pesticide residues ．With special emphasis on new formats developed in recent years ，
including coupled immunoassay and chromatography technique ，a new tendency of trace analyses is int roduced in detail ．
Underlying problems in the application of immunoassay are highlighted and future trends of immunoassay development
postulated ．
Key words 　 Immunoassay ，Pesticide residue ，Antibody ，Antigen
（Received March １８ ，２００６ ；revised July ２６ ，２００６）
我国是农药生产和使用的大国 ，农药的规模化生产和广泛使用导致农药残留问题日渐突出 。 农作物中
残留的农药会直接通过食物进入人体 ，而环境中残留的农药会先被动 、植物富集 ，然后通过食物链进入人
体 。 农药残留危害人体健康 、破坏生态环境 ，且极大影响我国出口贸易 ，造成巨大经济损失 。 发展实用可靠
的痕量分析技术无疑是监测和控制农药残留 ，保证食品安全 ，避免国际贸易争端的重要前提 。 农药残留分
析是对复杂混合物中微量组分的分析 ，分析技术应灵敏度高 、简便快速 、安全可靠 ，而免疫分析正因适应了
这一要求而蓬勃发展 。
1 　 抗原和抗体的制备技术
免疫分析是以抗原 、抗体的特异性结合为基础 ，抗原和抗体的制备是免疫分析的关键和基础的步骤 。
1畅1 　 抗原的制备
农药小分子需与大分子物质（如载体蛋白）偶联后才能刺激动物产生抗体 ，因此待测农药小分子需具有
能与大分子物质反应的活性基团 。 大多数农药需要引入活性基团 ，合成具有活性基团并尽量保持待测物空
间构型和电子分布的半抗原 。 理想的半抗原一方面应具备待测物的特征结构 ，特别是立体化学特征 ；另一
方面与载体蛋白连接后应保证半抗原特征结构能最大程度地为免疫活性细胞识别和结合 ，即“突出抗原决
定簇” ，以制备具有预期选择性和亲合性的抗体 。 包被原与免疫原结构会对免疫分析的特异性和灵敏度产
生影响 ，对于同一种目标分析物 ，最好使用不同的半抗原并采用不同的方法与载体蛋白偶联 ，以减少针对免
疫原偶联蛋白 、“桥” 、“长臂”的抗体与包被原的特异性结合反应 ，提高分析的特异性和灵敏度 。
1畅2 　 抗体的制备
抗体的发展主要经历了 ３ 个阶段 ：多克隆抗体（PAbs） 、单克隆抗体（MAbs）以及基因工程抗体 。
第 １５卷第 ６ 期 中 国 生 态 农 业 学 报 Vol ．１５ 　 No ．６
２ ０ ０ ７年 １ １月 Chinese Journal of Eco唱Agriculture Nov ．，　 ２００７
PAbs 由免疫原免疫动物直接产生 ，是最为简单和应用历史最长的抗体制备方法 。
MAbs来源于免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合并筛选出的能稳定分泌目标分析物抗体的细胞株 。
在试剂盒开发上 ，MAbs 比 PAbs占有优势 ，因为它可以无限量的生产均质抗体 ，而对于 PAbs 来说 ，即使是同
一只动物不同次采血的抗血清都存在差异 。 近年来关于农药残留免疫分析文献报道中 ，MAbs 所占比例正
在逐年增加 。 但是 ，无论 PAbs 还是 MAbs 制备方法耗费高 、时间长 、且需要动物 。
基因抗体工程应用重组 DNA 技术或基因突变方法改造某种抗体基因的编码序列 ，产生自然界中原本
不存在的蛋白质分子［１］ 。 重组抗体技术 ，如噬菌体显示的发展 ，可通过克隆生产抗体片段 ，这些片段具有完
整抗体功能并能在生长繁殖迅速的大肠杆菌中大量表达 ，缩短了制备特异性抗体的时间 。 最常用的抗体片
段是 ScFv和 Fab ，与完整的 IgG 分子相比 ，ScFv 、Fab 片段具有更高的特异性 。 重组抗体加速了不依赖于动
物实验的新抗体的发展 ，近 １０ 年来工程抗体在农药残留分析领域逐步得到应用和发展 ，Wie［４］和 Ward［５］分
别将抗体的 Fab片段和 ScFv 片段应用在莠去津和毒死蜱的残留分析上 ，取得了良好的分析效果 。
2 　 免疫分析技术的发展
2畅1 　 主要农药免疫分析技术
根据标记物的不同 ，免疫分析法主要分为 ：放射免疫分析 （RIA） 、酶免疫分析（EIA） 、荧光免疫分析
（FIA） 、化学发光免疫分析（CLIA）等 。
１９６０ 年 ，Yalow 和 Berson 首先使用放射性同位素标记胰岛素 ，从而创立了 RIA 。 RIA 把放射性同位素
的灵敏性与抗原抗体反应的特异性相结合 ，可精确测定过去无法分析的痕量物质 。 低毒 、高效农药的大量
使用 ，推动了灵敏度高 、特异性强的 RIA 在农药残留分析上的发展 。 但 RIA 应用的同位素给人类及环境带
来的危害［２］ ，限制了其进一步发展 ，现在许多国家开始对 RIA 的使用加以限制 。
创立于 １９７１ 年的 EIA 克服了 RIA 的缺点 ，随着单抗的问世和亲和素唱生物素 、FITC唱anti唱FITC 放大系
统的引入 ，EIA 灵敏度明显改善 。 虽然 EIA 的酶活性受环境条件的影响较大 ，稳定性较差 ，但 EIA 极大推动
了免疫分析方法的普及 。 １９８３ 年以后 ，EIA 开始应用于农药残留分析 。 EIA 技术主要有两类 ：酶联免疫吸
附分析法（ELISA）和酶放大免疫技术（EM IT） ，前者最为常用 。 以微量反应板 、试管 、齿轮 、棒 、纸和珠等在
水中不改变形状的材料作为固相载体的 EIA 方法均称为 ELISA 法［３］ 。 影响 ELISA 分析灵敏度的因素很
多 ，如抗体特异性 、抗体稀释度 、包被抗原浓度 、吸附材料 、酶标记物质量 、工作浓度搭配 、底物显色系统及温
育时间等 。 EMIT 不需要固相载体 ，为均相免疫分析 。 反应时 ，将酶标农药 、待测农药和抗体加入反应管进
行竞争性结合反应 ，离心除去结合物 ，上清液中剩余的酶标农药量与待测农药的含量成正比 。 EMIT 检测时
间较 ELISA 短 ，但灵敏度不如 ELISA 高 。
FIA 用荧光素标记抗原或抗体 ，其中非均相时间分辨荧光免疫分析（TrF IA）应用最为广泛 。 因为无需
分离和酶显色步骤 ，FIA 分析时间较 EIA 短 。 TrF IA 用 La 系元素作为标记物 ，用时间分辨技术测量荧光 ，
同时利用波长和时间分辨 ，有效地排除了 FIA 分析中存在的背景非特异荧光干扰 ，大大地提高了分析灵敏
度 ，被认为是现有免疫方法中灵敏度最高的非均相免疫分析方法 。 此外 ，TrFIA 标记物制备简单 ，稳定性好 ，
有效使用时间长 ，标记蛋白时反应条件温和 ，测量快速易于实现自动化 ，而且 TrFIA 的荧光标记物不易受那
些抑制 ELISA 反应体系中酶活性干扰物的影响 。 由于需要荧光分光光度计及复杂的分析软件 ，FIA 在农药
残留检测方面发展受到限制 。
１９７７ 年 ，Tsuji基于 RIA 的基本原理 ，将酶的化学发光与免疫反应结合起来 ，发展创建了 CLIA 。 CLIA
的主要优点是灵敏度高 、线性范围宽 、标记物的有效期长 、无放射性危害 、可实现全自动化等 。 但不同化学
发光物质的发光机理和发光性能不同 ，不同类型的化学发光免疫分析系统原理和方法各异 ，都要求方法 、仪
器 、试剂三位一体 ，故在研究和生产上的应用难度较大 。 尽管如此 ，CLIA 在近 １０ 年来仍得到迅速发展 ，在
很多环境监测研究中应用 。 这种分析方法在农药快速检测中尚未得到广泛应用 。
2畅2 　 EIA法的发展
EIA 是使用最为广泛的免疫分析技术 ，人们利用某些非免疫分析试剂如 SPA（葡萄球菌 A 蛋白 ，它可以
和 IgG 的 Fc片段结合） 、凝集素等的作用 ，或对固相载体 、包被方法改进的 EIA ，使其更加符合检测的需要 。
聚合电解质 ELISA 。 Yazynina［６］以带相反电荷的水溶性聚电解质为均相系统 ，阳离子被固定在微孔板
上 ，SPA 起连接抗体和阴离子的作用 。 除阴阳离子的结合是在非均相中进行 ，其余的特异性反应都在溶液
中进行 ，通过正负电荷的吸引达到快速的非均相分离 ，从而极大地节省了反应时间 。 用这种方法对饮用水 、
１９６　 中 国 生 态 农 业 学 报 第 １５ 卷
橘子汁 、牛奶中西玛津进行检测 ，检测限为 ０畅５ng／mL ，与传统 ELISA 以及斑点印迹免疫过滤技术测定结果
相关性好 。
以磁微粒为固相载体的酶免疫分析法（Magnetic particle唱based ELISA） 。 抗体偶联到磁微粒上 ，在试管
中的反应体系内 ，待测物 、已知量的酶标记物与偶联到磁微粒上的抗体竞争性的结合 。 将检测试管放在磁
场中 ，磁微粒被吸引到测试试管底部 ，冲洗分离结合分析物与未结合的分析物 ，加入酶的底物液进行显色反
应 。 这种方法排除了抗体包被试管和微孔板造成的不确定性 ，整个反应不到 １h 就可完成 。 Lawruk［７］用这
种方法检测水中西维因 ，与用 GC 检测结果具有很好的相关性 。 该法已广泛用于水 、土壤 、农作物 、水果和果
汁 、啤酒 、肉类中的农兽药残留检测［８ ～ １０］ 。
Sato［１１ ，１２］用聚丙乙烯珠作为固相载体 ，珠子固定在微槽中 ，吸附在珠子表面的抗原与待测物竞争胶体
金标记的抗体 。 这种方法扩大了抗原与抗体反应的表面积 ，减小了抗体和抗原的反应距离 ，使反应时间成
倍减少 ，克服了非均相反应需要较长分析时间的缺点 。 此法用注射泵抽吸或开关阀门来代替烦琐的手工冲
洗过程 ，消耗试剂量较少 ，操作简化 ，利于实现自动化 。
2畅3 　 其他免疫方法的发展
除前边介绍的几种主要方法外 ，免疫方法还包括 ：荧光偏振免疫测定（PFIA） 、微脂粒放大免疫分析（Li唱
posome唱amplified immunoassay） 、试纸条免疫分析（Dipstick immunoassay） 、免疫传感技术（SIT）等 。
PFIA属于均相竞争性免疫分析 ，通过检测自由态荧光标记抗原与结合态抗原唱抗体免疫复合物的荧光
偏振值的差异 ，确定标记试剂在结合相和游离相的比值 。 PFIA 因为简单 、精确和潜在的自动化在临床分析
中得到广泛应用 。 １９８８ 年 ，Colbert和 Coxon开始将 PFIA 法运用于农药检测 ，测定血清中的百草枯 。 Kras唱
nova用 PIFA 测定水样中敌稗 ，分析 １ 个样需要时间不到 １min ，检测范围为 １ ～ １００ng／mL ，和主要代谢产物
３ ，４唱dichloroaniline的交叉反应仅为 ０畅１ ％ ，SPE唱PFIA 测定结果与 SPME唱GC唱MS 测定结果有很好的相关
性［１３］ 。 PFIA 方法简便和特异性高的优点弥补了其反应过程标记试剂与血清蛋白的结合增大背景信号而造
成灵敏度较低的不足 。
微脂粒放大免疫分析利用包封在微脂粒内的标记物起信号增强子的作用 ，替代酶颜色反应 。 而且这种
信号增强作用是瞬时的 ，节省了孵育步骤 ，使反应极具自动化和现场检测的可能性 。 微脂在水中散开 ，自然
形成了微脂粒 ，并且包封了一部分水溶液进入小泡 ，其中包括溶液中的标记物 ，分析物也被整合在脂质体的
表面 。 标记微脂粒和包含分析物的样品通过固相表面固定到抗体上 ，自由态分析物和连接到微脂粒上的分
析物之间出现与抗体的竞争性结合 ，与抗体结合的微脂粒数目和样本中自由态分析物的数目成反比 。
Sieber t应用这种方法分析甲草胺在蔬菜中的残留 ，检测限为 １ng／mL［１４］ 。
试纸条免疫分析的最大优点在于易于现场使用 ，无须复杂的净化过程 ，只要把试纸条浸入到需要分析
的溶液中即可 。 试纸条免疫分析技术以竞争性免疫反应和颜色反应为基础 ，测定范围是 ０畅１ ～ １０μg／L ，具有
应用于现场分析的可能 。 Usleber［１５］用试纸条免疫分析测定小麦中 １５唱AcDON ，检测限为 ５０ ～ １００ng／g ，与以
微孔板为固相载体获的结果相近 。 与 EIA 相比 ，试纸条免疫分析很少受到介质干扰物和抽提物中有机物含
量的影响 。 包括抽提时间在内 ，试纸条免疫分析所需的时间不超过 ２h 。 试纸条免疫分析作为一种快速 、定
量的分析方法 ，特别适用于小样本（ ＜ １０）分析 。
SIT是利用抗体对抗原的识别和结合双重功能将抗原或抗体和换能器组合而成的装置 。 由于蛋白质分
子携带大量电荷 、发色团 ，抗原抗体结合就会产生电学 、化学 、光学等变化 ，通过适当的传感器可以检测这些
参数 ，从而构成不同的免疫传感器 。 免疫传感器的转换和相应放大元件放大 ，使 SIT 具有灵敏度高 ，分析时
间短 ，测量过程自动化等优点 。 光纤免疫传感器是 SIT 的重要发展方向 ，其体积小 、重量轻 ，可做成一次性
探针的形式 ，适合野外现场测量 。 Wittmann［１６］用光纤免疫传感器测定水样中 ２ ，４唱D 的含量 ，检测范围为
０畅２ ～ １００μg／L ，完全满足了对 ２ ，４唱D 环境检测的需要 。
2畅4 　 免疫分析技术与理化分析手段的联用
随着分析手段和工艺技术的不断改进提高 ，学科之间相互渗透加强 ，免疫分析与其他学科相互结合 ，涌
现出更多新的免疫分析手段和技术 ，推动了痕量分析技术的发展 。 高效液相色谱（HPLC）与免疫分析技术
的结合［１７ ，１８］ ，具备了色谱分析的高灵敏性和免疫分析的特异性 ，可分为 ２ 种模式 ：一是以免疫结合分离 、纯
化 、富集生物分子 ，色谱技术检测 ；二是 HPLC 分离得到生物分子 ，用免疫分析方法检测 。 亲和色谱柱是这
种技术的最普遍的应用 。
第 ６期 王文 等 ：免疫分析在农药残留检测中的应用和发展 １９７　
流动免疫分析（FIIA）是由竞争酶免疫技术与流动注射分析（FIA）相结合形成的 ，是现代免疫测定的主
要发展方向 。 FIIA 灵敏度可以通过选择更好的标记物 、多重标记 、更灵敏的检测手段来实现 。 FIIA 利用非
平衡态测定 ，反应时间缩短 ，测定快速 ，利于实现免疫分析的自动化和在线检测 。 Wittmann［１６］用 FIIA 方法
分析水中 ２ ，４唱D 的含量 ，检测范围为 ０畅０３ ～ ３ng／mL ，与 GC的测定结果相关性好 。 FIIA 系统测定一个样品
可以在 ２０min 内完成 ，而且一个反应器能够被循环使用 ７０ 次 。 在 FIIA 系统中 ，所用抗体被高倍稀释 ，抗体
消耗量小 。
毛细管免疫分析（CEIA）将免疫分析的特异性和毛细管电泳快速分离结合起来 ，较传统免疫有许多优
点 ，如 ：样品消耗少 、过程简单 、易于多残留分析和分析时间短等 。 但是在 CEIA 得到广泛应用前 ，还有几个
问题需要解决 ：改善分析灵敏度 ，不同分析物的大致分离要求 ，检测量的增加等［１９］ 。 毛细管区带电泳（CZE）
模式被利用来对抗原抗体形成的免疫复合物进行分离 ，实验采用了等电聚焦（IEF）的实验装置 ，必须在毛细
管中加入稳定介质或者两性电解质 。 后来 ，有人采用流动的缓冲溶液体系来填充毛细管作为分析介质 ，并
与传统的 IEF 和高效尺寸排阻色谱进行了比较 。 现在 ，激光诱导荧光（LIF）检测技术已被应用于 CEIA 中 ，
使得分析的灵敏度大大提高 ，LIF已经成为近几年 CEIA 分析的主要检测手段 。 此外 ，毛细管阵列和微片上
毛细刻蚀技术的发展也使分析通量大大增加 。 所有这些都使毛细管电泳免疫分析在临床以及药物分析中
得到广泛应用 。 Su 等［２０］用温敏凝胶检测方法填充毛细管柱作为分析介质 ，检测血清中雌二醇的含量 ，取得
满意的检测结果 。 而且 ，CEIA 实现了免疫分析在多组分检测上的突破［２１ ，２２］ 。
3 　 展 　 望
经过近 ４０ 年的发展 ，免疫分析已成为痕量分析领域的一个重要手段 。 但是 ，免疫分析的开发与应用仍
受到一定的限制 。 首先免疫分析开发周期长 ；其次 ，并非所有的农药分子都适用于免疫分析 ，一些没有特征
结构的农药分子无法设计相应的半抗原 ；第三 ，由于抗体特异性的局限 ，往往会出现假阳性和分析结果偏大
的现象［２３］ 。
针对免疫分析存在的缺点和不足 ，人们作了大量的工作 ，预示着免疫分析未来的发展方向 ：（１）将基因
重组技术或基因突变的方法应用于抗体改造 ，通过构建真核表达载体 ，采用 DNA 免疫 、细胞免疫等手段快
速制备高亲和力的抗体 。 （２）逐步增加均相酶免疫分析技术的应用 ，缩短免疫反应时间 。 （３）在多残留分析
方面 ，曾有人提出利用一些小分子物质存在的交叉反应进行相关分析物及其代谢物的多残留分析 ，或者把
抗几种结构相关或非相关的分析物的抗体混合 ，利用这种混合抗体同时进行几种农药残留检测［２４］ ；也有人
提出利用基因工程技术 ，把识别不同抗原的抗体的编码序列进行重新排列 ，形成可同时与不同抗原特异结
合的新型重组抗体 ；蛋白芯片技术的发展 ，实现了一直困扰免疫分析的多残留问题 ，目前国内蛋白芯片在食
品分析中才刚刚开始 ，但已显示出良好的应用前景 。 （４）发展免疫分析与 HPLC 、CE 等理化技术的联用 ，可
以弥补免疫分析技术的一些局限 ，将免疫技术的高选择性和理化技术的快速分离和灵敏性融为一体 ，避免
免疫分析直接测定样本信息量少 、假阳性或理化分析技术选择性低等不足 ，简化分析过程 。 IAC唱HPLC 、
IAC唱GC和 CEIA 是常见的联用方式 ，在药残分析中应用较多 。 未来农药残留分析技术中的免疫分析技术将
向试剂标准化 ，使用更灵敏和抗干扰性强的标记物和与理化分析技术联用方向发展 。 （５）免疫分析自动化
成为新的发展趋势 。 化学发光免疫分析在实现自动化方面已经先行一步 ，德国拜耳公司推出的化学发光全
自动检测仪 ACS １８０ SE可以实现 １０min 内分析检测 １８０ 个样本 。 （６）标记物的改进 ，如采用不同金属离子
标记抗体 ，将免疫分析与 ICP唱MS联用 ，在多组分免疫分析中实现了突破［２５ ，２６］ 。
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