全 文 ：中国科学: 生命科学 2010年 第 40卷 第 4期: 342 ~ 358
SCIENTIA SINICA Vitae www.scichina.com life.scichina.com
英文版见: Luo K, Chen S L, Chen K L, et al. Assessment of candidate plant DNA barcodes using the Rutaceae family. Sci China Life Sci, 2010, doi:
10.1007/s11427-010-0089-1
《中国科学》杂志社
SCIENCE CHINA PRESS
论 文
基于芸香科的植物通用 DNA 条形码研究
罗焜①②, 陈士林①*, 陈科力②, 宋经元①, 姚辉①, 马新业①, 朱英杰③, 庞晓慧①,
余华①, 李西文①④, 刘震②
① 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所, 北京 100193;
② 湖北中医学院药学院, 武汉 430061;
③ 西南交通大学生命科学与工程学院, 成都 610031;
④ 清华大学化学系, 北京 100084
* 联系人, E-mail: slchen@implad.ac.cn
收稿日期: 2009-12-12; 接受日期: 2010-01-15
国家国际科技合作项目(批准号: 2007DFA30990)和卫生部卫生行业科研专项基金(批准号: 200802043)资助项目
摘要 植物 DNA条形码研究是近 10年来进展最迅速的学科之一, 其通用序列的筛选一直是
该领域研究的热点问题. 2009 年, 生命条形码联盟植物工作组推荐 rbcL+matK 组成复合序列作
为植物通用条形码, 但其研究对象中近缘属、种较少, 且物种水平鉴定成功率仅为 72%, 所以仍
在进行验证和新序列的研究工作. 本研究选取 nrDNA ITS2序列, 利用其具有Ⅱ级结构的特性、
通过不同物种类型模型判定全长, 将其和目前热点候选序列(matK, rbcL, psbA-trnH, rpoC1, ycf5)
及 nrDNA ITS序列针对芸香科 72属 192种 300个样本进行比较, 试图在同一科属下更多近缘种
存在时, 真实判定候选序列的鉴定能力. 结果表明, 自行设计引物的 ITS2 序列具有较好的 PCR
扩增和测序成功率, 在所考察的候选序列中具有最大的种间变异和较小的种内变异, 且两者存
在极显著差异, 同时物种鉴定成功率最高, 各评价指标均优于其他候选序列. 证实 ITS2 序列在
单一科属内的“高效性”, 故推荐其作为植物 DNA条形码通用序列之一.
关键词
DNA条形码
ITS2
芸香科
鉴定
DNA 条形码(DNA barcoding)由加拿大动物学家
Hebert 等人[1]首次提出, 即通过使用一段标准 DNA
片段, 对物种进行快速、准确地鉴定, 是近年来发展
最迅速的学科之一. Gregory[2]认为, DNA 条形码的研
究将会是全球性的“大科学计划”. Miller[3]以“DNA 条
形码与分类学的文艺复兴”为题发表文章, 认为 DNA
条形码技术将对分类学产生革命性的影响. 2003 年,
Hebert 等人[4]对动物界中共 11 个门 13320 个物种的
CO1(cytochrome c oxidase subunit 1)基因序列进行分
析, 发现该序列种间变异能较好地区分除刺胞动物
门以外的物种. 随后的研究中[5~7], CO1 基因被公认
为动物界中标准的 DNA 条形码基因. 植物由于在进
化历程中容易发生杂交、网状进化等事件, 而且同一
基因在不同类群的进化速率可能不同, 导致植物条
形码的研究比动物要复杂得多[8,9]. 近几年提出了一
些植物 DNA 条形码候选序列及其组合[10~12], 但尚未
达成一致意见. 2009 年, 生命条形码联盟植物工作组
(the plant working group of the consortium for the
barcode of life, CBOL)[13]分析了 550 个物种 907 个样
品后, 推荐以 rbcL+matK组成的复合序列作为整个植
中国科学: 生命科学 2010 年 第 40 卷 第 4 期
343
物界的 DNA 条形码序列, 但其在物种水平的鉴定成
功率仅为 72%. Chen 等人[14]挑选 7 条序列, 分析超过
6000 个样本后, 发现 nrDNA ITS2 序列在各评价指标
上优于包括 rbcL, matK 在内的其他 6 条序列, 且物种
水平的鉴定成功率达 92.7%.
理想的条形码序列应具备在大量科属间的“通用
性”, 同时应具备在单一科属内大量近缘物种鉴别时
的“准确性和高效性”. 尽管已有学者在近缘属、种中
开展植物条形码的研究工作[15~18], 但在被考察序列
受关注程度、样本的数目、取样密度及代表性、候选
序列的评价指标等方面存在一定局限性.
芸香科植物在世界上有 180 属, 1300~1600 种.
中国有 28 属, 150 种(包括引进栽培种). 该科植物具
有较大的经济价值, 其中花椒属(Zanthoxylum)、柑橘
属(Citrus)、黄檗属(Phellodendron)、吴茱萸属(Evodia)
植物是重要的中草药资源; 柑橘属植物是著名的香
料原料; 枳属(Poncirus)、金橘属(Fortunella)、柑橘属
等植物是优良的水果资源; 九里香属(Murraya)、酒饼
簕属(Atalantia)、柑橘属植物是良好的庭院绿化植物.
随着社会的发展, 已有不同行业的科学研究和生产
活动针对芸香科植物展开. 正确的物种鉴定是植物
研究的基础. 传统的植物鉴定方法依赖于经验丰富
的分类学专家通过形态学特征来识别, 但形态特征
不能很好解决近缘物种相似性的问题, 又易受地理
环境、生物群落等诸多因素的影响. 同时, 形态分类
在一定程度上需要依赖分类人员的主观判断能力 ,
从而影响其鉴定的准确性. 随着分子生物学和信息
技术的发展, DNA 分子鉴定技术已被广泛地应用于
各个实践领域. 其中 DNA 条形码技术具有不受个体
形态特征限制、不受个体发育阶段影响、从基因水平
上客观区分物种、操作方法相对简便等特点而引起广
泛关注 (http://phe.rockefeller.edu/barcode/). 因此 , 选
取芸香科开展植物通用 DNA 条形码序列研究, 旨在
大量近缘属、种存在时, 比较各候选序列的优缺点,
试图寻找到适合的条形码序列.
1 材料与方法
1.1 材料
研究材料涉及芸香科 72 属 192 种共 300 个样本.
实验实地采集 9 属 19 种共 32 个样本的属种名称, 采
集地点及GenBank登录号信息见附表 1(详见网络版).
样本经中国医学科学院药用植物研究所林余霖副研
究员鉴定, 凭证标本和数字影像信息保存于中国医
学科学院药用植物研究所标本馆. 从 GenBank 数据
库(数据下载日期为 2009 年 7 月 5 号)获得芸香科 70
属 182 种 268 条序列, 具体属种情况及登录号等信息
见附表 2(详见网络版). 研究材料中≥2 个物种数的
属有 29 个, ≥5 个物种数的属有 10 个; ≥2 个样本数
的物种有 49 个, ≥5 个样本数的物种有 8 个. 其中包
含枳属、黄檗属、柑橘属、吴茱萸属、金橘属等芸香
科经济类植物(药材、果树、香料、木材)的代表属, 涵
盖中国境内芸香科 70%以上的属.
1.2 方法
(1) 样品 DNA 的提取、PCR 扩增和测序. 选取
硅胶干燥的植物叶片约 10 mg, 用 DNA 提取研磨仪
(Retsch MM400, Germany)研磨 1 min(1800 r/min)后,
使用植物 DNA 提取试剂盒 (Tiangen Biotech Co.,
China)提取总 DNA. 扩增 ITS2 序列正向引物: 5′-
GCGATACTTGGTGTGAAT-3′, 反向: 5′-GACGCTTC
TCCAGACTACAAT-3′. PCR 反应体积 25 µL, 体系包
含 MgCl2 2 µL(25 mmol/L), dNTP 2 µL(2.5 mmol/L),
PCR 缓冲液 2.5 µL(10×), 引物各 1.0 µL(2.5 µmol/L)
(Sangon Co., China), 聚合酶 1.0 U(Biocolor BioSci-
ence&Technology Co., China), 总 DNA 1 µL(约 30 ng).
扩增程序: 94 , ℃ 变性 5 min; 94 ℃ 变性 30 s, 56℃退
火 30 s, 72℃延伸 45 s(进行 40 个循环); 72℃延伸 10
min. 其余各序列的 PCR 反应条件、通用引物及扩增
程序参考文献[14~16]. PCR 扩增产物经纯化后, 使用
ABI 3730XL 测序仪(Applied Biosystems Co., USA)进
行双向测序.
(2) 数据处理方法. 测序后所得峰图采用 Codon
Code Aligner V 2.06(CodonCode Co., USA)校对拼接,
去除低质量序列及引物区 , 利用 ClustalX V2.0
(Higgins D.G.)进行多序列比对并查错. ITS2 序列依照
Keller 等人 [19] 的方法处理 , psbA-trnH 序列根据
GenBank 上的注释处理, 其余序列采用 CodonCode
Aligner 处理, 剔除不确定碱基数目大于 10 个和长度
小于 100 bp 的序列.
实验材料采用 PCR 扩增效率和测序成功率评价
各候选序列的扩增情况. 利用 Kress 等人[8]和 Song 等
人[15]的方法(适合小样本量的比较), 比较不同条形码
序列在种间、种内变异的大小, 结合网上数据并改进
罗焜等: 基于芸香科的植物通用 DNA 条形码研究
344
Meyer和Paulay[20]的方法(适合大样本量的比较), 扩大
样本量以确认上述结果的正确性. 通过 Wilcoxon 检
验[14], 比较在相同样本量下两两序列种间、种内变异
的大小. 使用 TAXON DNA 软件[21]分析序列种内、种
间变异并作barcoding gap图. 通过Wilcoxon检验, 考
察单一序列种间、种内变异的 barcoding gap 显著性.
最后采用 Ross 等人[22]报道的比对法(BLAST 1)和最
小距离法(nearest distance)计算各序列的鉴定成功率.
2 结果
2.1 PCR 扩增效率和测序成功率
通过比较 7 条候选序列的 PCR 扩增效率、测序
成功率和序列获得率(有效序列比例)(图 1), 发现
psbA-trnH 序列扩增效率最高, ITS2 序列其次, ITS 序
列最低. 而测序成功率 ITS 最高, 其次是 rbcL 序列,
matK 序列测序成功率最低. 因 ITS 和 matK 序列获得
率过低, 故未将其纳入后续数据分析.
2.2 单一序列种内、种间变异分析和各序列的长度
考察
分析单一序列种间、种内变异情况, 结果表明(表
1 和 2): ITS2 序列种间变异最大, psbA-trnH 序列次之,
且两者的种间变异程度明显大于其他 3 个候选序列.
rbcL, ycf5, rpoC1 序列种间变异逐个递减. ITS2 种内
变异最大, psbA-trnH 次之, 而 rbcL, rpoC1 和 ycf5 序
列种内不存在变异. 序列长度考察发现, rbcL 序列最
长, rpoC1其次, psbA-trnH和 ycf5序列长度相当, ITS2
最短. 同时 ITS2 和 psbA-trnH 序列长度在种间、种内
均存在差异, 且 psbA-trnH序列长度差异大于 ITS2序
列, 另外 3 条序列种间、种内长度无变化.
为验证实验结果的正确性 , 将实验数据和
GenBank 数据库内芸香科数据结合, 在更大样本量
下验证所得结论. 结果表明: ITS2, psbA-trnH 序列种
间变异明显大于其他 3 个候选序列, 这与表 1 和 4 结
论相符, 且二者种间变异最小值远大于其种内变异
的最大值, 其余 3 条候选序列的种间最小变异与种内
最大变异间差异不明显(表 3).
2.3 不同序列种间、种内变异的比较
利用 Wilcoxon 检验分析各序列种间、种内变异
的差异情况. 结果表明: 在种间变异上 ITS2 序列的
变异性大于其他序列, 其次是 psbA-trnH 序列. rbcL,
ycf5, rpoC1 序列种间变异不明显. 种内变异方面
ITS2 序列大于 psbA-trnH 和 rpoC1 序列, 其余各序列
间没有差异(表 4 和 5). 此结论与单一序列变异情况
结论相符. 由于 Wilcoxon 检验针对的是两两比对序
列间的共有序列, 但各序列数据的不对称性造成部
图 1 7 条序列 PCR 扩增效率、测序成功率和序列获得率
PCR 扩增时出现清晰明亮条带即判定 PCR 成功; 测序后获得高质量的序列即判定为测序成功
中国科学: 生命科学 2010 年 第 40 卷 第 4 期
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表
1
实
验
数
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条
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数
据
显
示
罗焜等: 基于芸香科的植物通用 DNA 条形码研究
346
分结果的缺失. 如实验中没有一个物种 2个或以上样
本同时具备 rbcL 和 rpoC1 序列 , 故两者的种内
Wilcoxon检验无法进行, 其值空缺. 同样原因空缺的
还有 ycf5 和 rpoC1 序列的种内 Wilcoxon 检验结果.
2.4 不同序列 barcoding gap 分析
使用 TAXON DNA 软件分析各候选序列, 并做
barcoding gap 图(图 2). 从不同序列种间、种内变异
的分布图看出, 5 条候选序列的 barcoding gap 均不明
显, 但 ITS2和 psbA-trnH序列种内变异和种间变异重
合较少; 种间与种内变异分布呈两边分开的趋势. 而
rbcL, rpoC1, ycf5 序列的种间变异偏小, 种间变异整
体向种内变异方向倾斜.
因 5 个序列的 barcoding gap 不明显, 采取
表 3 5 个序列的种间种内差异
ITS2 psbA-trnH rbcL rpoC1 ycf5
种间变异 0.0422±0.0468 0.0402±0.0510 0.0069±0.0051 0.0016±0.0017 0.0099±0.0128
平均种间变异 0.0844±0.0768 0.0656±0.0987 0.0090±0.0068 0.0024±0.0027 0.0099±0.0128
种间最小变异 0.0553±0.0832 0.0489±0.1030 0.0073±0.0081 0.0021±0.0029 0.0099±0.0128
种内变异 0.0123±0.0104 0.0029±0.0028 0.0028±0.0051 0.0000±0.0000 0.0000±0.0000
平均种内变异 0.0115±0.0157 0.0023±0.0028 0.0042±0.0061 0.0000±0.0000 0.0000±0.0000
种内最大变异 0.0172±0.0180 0.0045±0.0051 0.0043±0.0061 0.0000±0.0000 0.0000±0.0000
表 4 两两序列种间差异的 Wilcoxon 检验
W+ W− 种间变异相关性, n, P 值 结果
ITS2 rbcL W + = 28.0, W − = 0, n = 7, P≤0.0176 ITS2>rbcL
ITS2 rpoC1 W + = 55.0, W − = 0, n = 10, P≤0.0049 ITS2>rpoC1
ITS2 ycf5 W + = 1.0, W − = 0, n = 1, P≤0.3173 ITS2=ycf5
psbA-trnH ITS2 W + = 27.0, W − = 379.0, n = 28, P≤6.1193×10−15 psbA-trnH<
psbA-trnH rpoC1 W + = 28.0, W − = 0, n = 7, P≤0.0180 psbA-trnH>rpoC1
psbA-trnH ycf5 W + = 3.0, W − = 0, n = 2, P≤0.1797 psbA-trnH=ycf5
rbcL ycf5 W + = 1.0, W − = 0, n = 1, P≤0.3173 rbcL=ycf5
rbcL rpoC1 W + = 3.0, W − = 0, n = 2, P≤0.1572 rbcL=ycf5
ycf5 rpoC1 W + = 0.0, W − = 3.0, n = 2, P≤0.1797 ycf5=rpoC1
表 5 两两序列种内差异的 Wilcoxon 检验 a)
W+ W− 种内变异相关性, n, P 值 结果
ITS2 rbcL W + =4.0, W− = 2.0, n = 3, P≤0.5930 ITS2=rbcL
ITS2 rpoC1 W + =15.0, W− = 0, n = 5, P≤0.0422 ITS2>rpoC1
ITS2 ycf5 W + =1.0, W− = 9.0, n = 4, P≤0.1305 ITS2=ycf5
psbA-trnH ITS2 W + =25.0, W− = 111.0, n = 16, P≤0.0260 psbA-trnH
psbA-trnH rpoC1 W + =10.0, W− = 0, n = 4, P≤0.0679 psbA-trnH=rpoC1
psbA-trnH ycf5 W + =1.0, W− = 5.0, n = 3, P≤0.2850 psbA-trnH=ycf5
rbcL rpoC1 − −
rbcL ycf5 W + = 0, W− = 3.0, n = 2, P≤0.1305 rbcL=ycf5
ycf5 rpoC1 − −
a) −: 示无数据显示
中国科学: 生命科学 2010 年 第 40 卷 第 4 期
347
Wilcoxon 检验考察单一序列种间、种内变异是否存
在显著性差异. 结果表明, ITS2 和 psbA-trnH 序列种
间变异和种内变异之间有极显著差异, 且 ITS2 序列
两者间差异更显著, rbcL 和 rpoC1 序列种间变异和种
内变异之间有显著差异, 而 ycf5 序列种间变异和种
内变异之间差异不明显. 此结论验证了前面各序列
种间、种内变异差异的计算结果.
2.5 候选序列的鉴定效率评估
实验中采用比对法和最小距离法同时评估各序
列的鉴定效率. 结果表明, 通过比对法分析, 发现在
属水平上 ITS2和 psbA-trnH序列鉴定成功率最高, 达
到 100%, 其次为 rbcL, ycf5, rpoC1 序列(表 6). 在物
种水平上, ITS2 序列鉴定成功率最高, 其次是 psbA-
trnH 序列. 通过最小距离法也得到同样的结论, 但各
图 2 5 个候选序列的 barcoding gap
罗焜等: 基于芸香科的植物通用 DNA 条形码研究
348
候选序列的鉴定成功率较比对法低.
3 讨论
3.1 芸香科候选序列的筛选
DNA 条形码的核心工作之一是寻找适合的条形
码序列. 与线粒体 CO1 基因在动物条形码研究中的
优异表现相比, 植物 DNA 条形码研究进展相对缓慢.
由于植物线粒体基因组进化速率较慢, 因此条形码
序列主要在叶绿体和核基因上进行选择, 被提议的
候选序列主要有叶绿体编码区 rbcL, rpoC1, ycf5,
matK 和非编码区 psbA-trnH 序列, 及核基因 ITS 序列
等. ITS序列最早被 Kress等人[8]作为植物条形码候选
序列提出, 由于 ITS, ITS1 种间变异高于 ITS2, 研究
者则更关注前 2 条序列[8,11], 但随着研究的深入, 越
来越多的研究发现, ITS 和 ITS1 序列在一些类群中扩
增并不成功[10,14,23,24]. 2007 年, 第 2 届国际条形码会
上 ITS 序列甚至被排除出植物条形码候选序列[12].
但是在系统发育和物种鉴定研究中, ITS2 序列以其
特有的优势引起人们的关注[19,25,26].
首先, 利用自行设计引物扩增出的 ITS2 序列长
度只有 450 bp 左右, 无论在新鲜或降解组织中都较
容易扩增和测序, 具有很高的应用价值; 其次, ITS2
序列可根据不同物种类型基于隐马尔可夫模型的
HMM 注释方法[19]去除两端 5.8 S 和 26 S 区段, 获得
标准 ITS2 间隔区序列, 使后续数据处理更准确可靠,
这也是目前其他候选条形码序列不具备的优势 .
Chen 等人已利用超过 6600 个植物样本证明, ITS2 作
为条形码序列具有良好的通用性 [14]. 在此背景下,
本文针对芸香科 72 属 192 个物种 300 个样本、纳入
目前条形码研究中的热点候选序列进行比较, 发现
ITS2 序列具有良好的 PCR 效率和测序成功率, 在所
考察的候选序列中具有最大的种间变异和较小的种
内变异, 且两者存在极显著差异, 同时物种鉴定成功
率最高, 各评价指标均优于其他候选序列.
CBOL 在最新的研究中推荐 rbcL+matK 作为植
物条形码序列[13]. rbcL 序列在 GenBank 中有大量的
数据, 并具有通用、易扩增、易比对的优点, 但是其
变异主要存在于物种以上水平, 物种水平通常变异
不够大[11,16]. 而 matK 片段相对于其他编码区片段进
化速率较快, 但其引物在不同物种间通用性差别较
大[10,14]. 本文将这 2 条序列纳入分析, 发现 matK 序
列扩增成功率过低无法进行后续数据分析, rbcL 序列
在属的水平鉴定效率达到 97.1%, 在种的水平为
76.5%, 但其鉴定效率不及 ITS2 序列.
另外, 由于 psbA-trnH 片段是进化速率最快的叶
表 6 比对法和最小距离法分析 5 条候选序列的鉴定效率 a)
鉴定成功率(%) 鉴定错误率(%) 模糊鉴定率(%)
序列 鉴定方法 物种数
物种水平 属水平 物种水平 属水平 物种水平 属水平
比对法 197 89.3 100 0 0 10.7 0
ITS2
最小距离法 197 77.7 100 0 0 22.3 0
比对法 65 83.1 100 0 0 16.9 0
psbA-trnH
最小距离法 65 75.4 97.0 0 0 24.6 3.0
比对法 67 77.6 97.0 0 0 22.4 3.0
rbcL
最小距离法 67 74.6 97.0 0 0 25.4 3.0
比对法 20 40.0 100 0 0 60.0 0
rpoC1
最小距离法 20 40.0 100 0 0 60.0 0
比对法 14 78.6 85.7 0 0 21.4 14.3
ycf5
最小距离法 14 78.6 85.7 0 0 21.4 14.3
a) “比对法”中“鉴定成功”指通过碱基相似性搜索后, 研究对象与相同物种材料具有最高相似性的情况; “鉴定模糊”指通过碱基相似
性搜索后, 研究对象同时与相同物种材料和不同物种材料具有最高相似性的情况; “鉴定失败”指通过碱基相似性搜索后, 研究对象与不
同物种材料具有最高相似性, 而与相同物种材料相似性反而更低的情况. “最小距离法”中“鉴定成功”指进行多序列比对并利用 PAUP4b10
计算 K-2-P 距离后, 研究对象与同种材料间距离值最小的情况; “鉴定模糊”指计算 K-2-P 距离后, 研究对象同时与相同物种材料和不同物
种材料距离值最小的情况; “鉴定失败”指计算 K-2-P 距离后, 研究对象与不同物种材料距离值最小, 而与相同物种材料距离值更大的情况
中国科学: 生命科学 2010 年 第 40 卷 第 4 期
349
绿体间隔区之一, 而且其两端存在约 75 bp 的保守序
列, 可用于设计通用引物 [27]. 后经 Kress 等人 [8,11],
Yao[28]等人验证发现其通用性较好, 扩增成功率较高,
而在条形码研究中重点推荐. 本研究发现, psbA-trnH
序列在属的水平鉴定成功率达到 100%, 种的水平达
83.8%, 并且种间、种内变异存在显著性差异, 虽然其
鉴定效率较 ITS2 序列低, 但可视为潜在的植物条形
码序列. ycf5 序列在涉及的样本数较少(20 个样本)的
情况下, 显示出在种和属的水平有较高的鉴定效率,
但也是唯一种间、种内变异没有显著性差异的候选序
列, 是否能真的反映其鉴定能力, 还有待进一步研究.
rpoC1 在先前的研究中被认为其引物通用性好, 扩增
成功率高, 但进化较慢, 鉴别能力较低. 本实验中,
rpoC1 序列在样本数较少的情况下, 鉴定成功率仍然
偏低(物种水平鉴定成功率为 40%), 与前人的结论
相符.
3.2 考察序列鉴定成功率方法
尽管 CBOL 推荐复合序列(rbcL+matK)作为植物
条形码序列, 但使用复合序列需要有足够对齐的实
验数据, 导致实验费用增大. 所以本实验只考虑单一
序列的可行性, 并采取比对法和最小距离法同时评
价各序列的鉴定效率, 力求客观反映各序列的鉴定
能力. 比对法是将样本的 DNA 序列与全体序列进行
碱基比对, 按碱基差异进行排名, 具有运行速度快精
度高的特点. 最小距离法是比较样本 DNA 序列与全
体序列的 K-2-P 距离, 此方法基于全局比对, 量化单
个序列的差异数值, 速度较慢, 同时对于缺失位点和
变异位点等价处理, 易造成数据结果与真实情况的
轻微差异, 这也是两种验证结果数值不一致的原因.
在评价鉴定效率过程中, 会考察每一条序列存
在或不存在时, 整体数据会如何发生改变. 当数据异
常时, 将可疑序列与 GenBank 数据库内数据进行比
对, 以排除“假阳性”数据的干扰. 与多数研究一致,
在实验中对“种间变异”定义其实是属内不同物种之
间的变异情况, 并没有打破属的界限, 使用上述“种
间”范围的界定得到的计算结果可能比实际情况要小.
Lahaye 等人[16]的研究也得出相同的结论, 所以在今
后的实验中, 会采取一些新的评价鉴定成功率的方
法, 如 PCI(probability of correct identification)[29], 避
免人为因素干扰实验结果.
3.3 未鉴定成功样本的探讨
本文采用 ITS2 序列作为 DNA 条形码鉴定芸香
科植物, 但在供试样本中, 仍有 21 个样本无法鉴定,
其中有 18 个样本属于柑橘属. 自 1753 年林奈确立柑
橘属以来, 尽管它的系统分类比其他任何果树都更
受重视, 但有关该属的分类, 特别是种的划分一直存
在很大分歧[30~32]. 原因一方面是柑橘植物本身容易
发生芽变, 种属间易杂交且杂种可育, 体细胞突变率
高, 无融合生殖占优势, 并且该属植物人工栽培历史
悠久, 类型繁多, 形态复杂. 另一方面则是研究者主
观上对柑橘演化过程的看法不同, 因而采用和建立
的分类标准不同. 本文中 18 个未鉴定成功的柑橘属
物种主要为宽皮柑橘类、甜橙类和杂柑类的部分种或
品种. 这些种主要是通过芽变选育的, 芽变是一种体
细胞变异, 芽变系与母本之间的遗传组成绝大部分
是相同的, 甚至某些芽变系只发生了单核苷酸突变,
因此利用部分遗传特征信息的条形码技术很难将它
们区分开来, 此结果与 Francois 等人[33]的研究相符.
该结果也揭示了这些种具有较近的亲缘关系, 其中
有些种也可能被不适当地划分, 同时说明清晰、准确
的物种界定对 DNA 条形码分类具有重要影响. 对于
这些近缘和近期分化的物种, 可能需要采用其他更
多的分子标记(如 SNP, SSR 等)方法来解决, 而不局
限于单一条形码序列.
尽管还存在争议, 但 DNA 条形码已经在动物中
得到广泛应用, 在植物中的研究也正在迅速开展, 这
将有助于非分类学专业工作者对物种进行快速、准确
地鉴定. DNA 条形码不能取代传统的分类学, 但作为
数字信息的 DNA 序列, 其准确性、丰富性以及独一
无二的可重复性将使该技术成为分类学家有用的工
具[13,34,35]. 本研究为 DNA 条形码技术在植物中的应
用进行了新的探索, 同时也为植物的分子分类鉴定
和亲缘关系研究提供了新的方法和思路. 研究中由
于采样条件的限制, 有些物种缺乏重复个体, 一些属
内关系最近的姊妹种没有能纳入分析. 同时还有一
些问题有待进一步研究, 如如何直接从干燥的药材
中提取 DNA 并避免真菌的污染; 采用 2 条或多条复
合序列能否在植物鉴定成功率达到或接近 100%等.
相信随着材料数的增加和研究的进一步深入, 能够
提供更多有效的信息和可靠的方法.
罗焜等: 基于芸香科的植物通用 DNA 条形码研究
350
致谢 感谢中国医学科学院药用植物研究所林余霖副研究员对样本进行物种鉴定, 赵娜在实验过程中提供帮助.
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罗焜等: 基于芸香科的植物通用 DNA 条形码研究
352
附表 1 The collection sites and GenBank accession of collected samples of the Rutaceae family
Species Collection sites ITS2 psbA-trnH rbcL matk rpoC1 ycf5 ITS
Citrus grandis Nanning GQ434825 GQ435442 GQ436255 GQ435827
Citrus grandis Beijing GQ434826 GQ435443 GQ436256
Citrus grandis Beijing GQ434827 GQ435444 GQ436257
Citrus grandis Nanning GQ435445
Citrus grandis Huazhou GQ435446
Citrus grandis var. tomentosa Nanning GQ434817 GQ435433 GQ434283 GQ435822
Citrus grandis var. tomentosa Beijing GQ434818 GQ435434 GQ436734
Citrus limonum Xishuangbanna GQ434832 GQ435450 GQ436744 FJ980439
Citrus medica Xishuangbanna GQ434836 GQ436749 GQ435836 FJ980440
Citrus medica Putian GQ434837 GQ435453 GQ436263
Citrus medica Xinglong GQ435454 GQ436750
Citrus medica var. sarcodactylis Bozhou GQ434821 GQ435437 GQ436251
Citrus reticulata Putian GQ434822 GQ435438 GQ436736 GQ436252
Citrus sinensis Beijing GQ434833 GQ436746 GQ436261
Clausena excavata Huazhou GQ436740 GQ435828
Dictamnus dasycarpus Qinling GQ434819 GQ435435
Evodia lepta Putian GQ436745
Evodia rutaecarpa Chengdu GQ434834 GQ436747 GQ434286 GQ436262 GQ435834
Evodia rutaecarpa Chongqing GQ435451
Glycosmis pentaphylla Xishuangbanna GQ434835 GQ435452 GQ436748 GQ435835
Murraya exotica Nanning GQ434828 GQ435447 GQ436258 GQ435829
Murraya exotica Beijing GQ434829 GQ436741 GQ434284 GQ436259 GQ435830
Murraya exotica Chengdu GQ435448 GQ436742
Murraya exotica Xinglong GQ434830 GQ435831
Murraya exotica Nanning GQ434831 GQ435449 GQ436743 GQ434285 GQ435832 FJ980438
Phellodendron amurense Beijing GQ435440 GQ436738 GQ436253 GQ435825
Phellodendron chinense Beijing GQ434820 GQ435436 GQ436735 GQ436250 GQ435823
Poncirus trifoliata Chengdu GQ434823 GQ435439 GQ436737 GQ435824
Zanthoxylum armatum Xishuangbanna GQ434838 GQ435455 GQ436751
Zanthoxylum bungeanum Beijing GQ434824 GQ435441 GQ436739 GQ436254 GQ435826
Zanthoxylum nitidum Xishuangbanna GQ435833
Zanthoxylum nitidum Nanning GQ436260
中国科学: 生命科学 2010 年 第 40 卷 第 4 期
353
附表 2 The Species of Rutaceae family downloaded from GenBank
Species ITS2 psbA-trnH rbcL rpoC1
Acmadenia obtusata AM500886
Acmadenia rupicola AM235114
Acmadenia teretifolia AM500887
Acmadenia trigona AM500888
Acronychia acidula U38862
Acronychia baeuerlenii AY588596
Acronychia imperforata AY588597
Acronychia oblongifolia AY588598
Acronychia oblongifolia EU493185
Acronychia oblongifolia EU493204
Acronychia pauciflora AY588593
Acronychia pubescens AY588594
Acronychia suberosa AY588595
Acronychia wilcoxiana AY588592
Adenandra brachyphylla AM500889
Adenandra rotundifolia AM500890
Adenandra uniflora AF066803
Adenandra villosa AM500891
Aegle marmelos FJ434169
Aegle marmelos AF066811
Afraegle paniculata FJ434170
Agathosma adenandriflora AM500892
Agathosma bathii AM500893
Agathosma bifida AM500894
Agathosma capensis AM500895
Agathosma namaquensis AM500896
Agathosma ovata AM235115
Asterolasia asteriscophora AY631937
Asterolasia muricata AY631936
Asterolasia nivea AY631939
Asterolasia pallida subsp. hyalina AY631934
Asterolasia pallida subsp. pallida AY631935
Asterolasia phebalioides AY631938
Asterolasia squamuligera AY631940
Atalantia ceylanica FJ434159
Atalantia ceylanica AF066812
Atalantia monophylla AB456047
Balsamocitrus dawei FJ434166
Bergera koenigii FJ434147
Boronia heterophylla AM500897
Calodendrum capense AM500898
Calodendrum capense AF066805
Casimiroa edulis AF066808
Casimiroa edulis EU042975
罗焜等: 基于芸香科的植物通用 DNA 条形码研究
354
续附表 2
Species ITS2 psbA-trnH rbcL rpoC1
Choisya mollis AF066800
Chorilaena quercifolia AY631915
Chorilaena quercifolia AF066810
Citropsis gilletiana FJ434171
Citrus amblycarpa AB456105
Citrus aurantiifolia AB456054
Citrus aurantiifolia AB456118
Citrus aurantium AB456074
Citrus aurantium GQ248907
Citrus bergamia AB456056
Citrus hassaku AB456121
Citrus hassaku AB456122
Citrus hystrix AB456053
Citrus junos AB456112
Citrus junos AB456113
Citrus junos AB456114
Citrus macroptera AB456052
Citrus maxima AM398229
Citrus maxima FJ980437
Citrus medica AM260544
Citrus medica var. sarcodactylis AM260543
Citrus montana AB456057
Citrus natsudaidai AB456119
Citrus neoaurantium AB456078
Citrus nobilis AB456087
Citrus paradisi AJ238407
Citrus reticulata AB456091
Citrus reticulata AB456092
Citrus reticulata AB456115
Citrus reticulata AM398230
Citrus sinensis AB456079
Citrus sinensis AB456120
Citrus sinensis AB456127
Citrus sinensis DQ864733 DQ864733 DQ864733
Citrus sinensis NC_008334 NC_008334
Citrus sinensis var. brasiliensis AB456080
Citrus sinensis var. brasiliensis AB456081
Citrus sinensis var. brasiliensis AB456111
Citrus sudachi AB456086
Citrus sunki AB456102
Citrus tachibana AB456095
Citrus tachibana AB456096
Citrus tachibana AB456097
Citrus tumida AB456104
中国科学: 生命科学 2010 年 第 40 卷 第 4 期
355
续附表 2
Species ITS2 psbA-trnH rbcL rpoC1
Citrus unshiu AB456088
Citrus unshiu AB456089
Citrus unshiu AB456117
Clausena anisata AM500899
Clausena anisata AM235116
Clausena excavata FJ434152
Clausena excavata AF066813
Clymenia polyandra FJ434162
Cneorum pulverulentum AF206752
Cneorum pulverulentum U38858
Cneorum tricoccon EU042977
Coleonema juniperinum AM500900
Coleonema pulchellum L12567
Coleonema pulchrum AM500901
Correa pulchella AF066816
Crowea exalata AY631903
Dictyoloma vandellianum AF066823
Diosma hirsuta AM500902
Diosma oppositifolia AM500903
Diosma sabulosa AM500904
Diosma sabulosa AM235117
Diosma subulata AM500905
Diplolaena dampieri AF066807
Drummondita hassellii AY631904
Empleurum unicapsulare AM500906
Empleurum unicapsulare AM235118
Eremocitrus glauca AB456049
Eremocitrus glauca FJ434161
Eremocitrus glauca AF066819
Eriostemon brevifolius AF156883
Euchaetis albertiniana AM235119
Euchaetis glabra AM500907
Euchaetis glomerata AM500908
Euodia pubifolia EU493186
Feroniella lucida AB456046
Feroniella oblata FJ434168
Flindersia australis U38861
Fortunella japonica AB456051
Fortunella japonica AB456108
Fortunella japonica AB456110
Fortunella japonica AF066799
Fortunella polyandra FJ434160
Glycosmis pentaphylla AF066820
罗焜等: 基于芸香科的植物通用 DNA 条形码研究
356
续附表 2
Species ITS2 psbA-trnH rbcL rpoC1
Haplophyllum bastetanum AY484576
Haplophyllum blanchei AY484571
Haplophyllum broussonetianum EU531658
Haplophyllum coronatum AY484573
Haplophyllum linifolium AY484572
Haplophyllum rosmarinifolium AY484574
Haplophyllum suaveolens AY484575
Leionema carruthersii AY631917
Leionema diosmeum AY631920
Leionema ellipticum AY631916
Leionema equestre AY631922
Leionema lamprophyllum AY631918
Leionema phylicifolium AY631919
Leionema ralstonii AY631921
Lunasia amara AF066814
Macrostylis ramulosa AM500909
Macrostylis ramulosa AM235120
Macrostylis squarrosa AM500910
Macrostylis villosa AM500911
Melicope clusiifolia EU493178
Melicope clusiifolia EU493197
Melicope degeneri EU493179
Melicope elleryana EU493184
Melicope elliptica EU493180
Melicope hivaoaensis EU493173
Melicope inopinata EU493176
Melicope inopinata EU493195
Melicope knudsenii EU493168
Melicope knudsenii EU493187
Melicope lucida EU493177
Melicope lucida EU493196
Melicope nukuhivensis EU493175
Melicope ovalis EU493169
Melicope paniculata EU493171
Melicope polybotrya EU493183
Melicope polybotrya EU493202
Melicope puberula EU493172
Melicope quadrangularis EU493170
Melicope quadrangularis EU493189
Melicope revoluta EU493174
Melicope revoluta EU493193
Melicope simplex DQ499137
Melicope ternata AF116271
Merrillia caloxylon FJ434149
中国科学: 生命科学 2010 年 第 40 卷 第 4 期
357
续附表 2
Species ITS2 psbA-trnH rbcL rpoC1
Microcitrus australasica AB457061
Microcybe multiflora AY631932
Microcybe pauciflora AY631933
Micromelum minutum FJ434148
Muiriantha hassellii AY631911
Murraya koenigii AJ879084
Murraya koenigii FN292997
Murraya koenigii FN292998
Murraya koenigii FN292999
Murraya koenigii FN293000
Murraya koenigii FN293001
Murraya paniculata AB456044
Murraya paniculata AJ879085
Murraya paniculata FN293002
Murraya paniculata FN293003
Murraya paniculata FN293004
Murraya paniculata FN293005
Murraya paniculata FN293006
Murraya paniculata U38860
Nematolepis elliptica AY631906
Nematolepis frondosa AY631907
Nematolepis phebalioides AY631910
Nematolepis rhytidophylla AY631905
Nematolepis squamea subsp. coriacea AY631909
Nematolepis squamea subsp. squamea AY631908
Pamburus missionis FJ434155
Phebalium ambiguum AY631931
Phebalium canaliculatum AY631924
Phebalium clavatum AY631923
Phebalium elegans AY631925
Phebalium festivum AY631928
Phebalium filifolium AY631930
Phebalium glandulosum AY631926
Phebalium squamulosum subsp. ozothamnoides AY631927
Phebalium tuberculosum AY631929
Phellodendron amurense AF066804
Phellodendron amurense EU266075
Phyllosma capensis AM500912
Pilocarpus pennatifolius AF066809
Platydesma rostrata EU493181
Platydesma rostrata EU493200
Platydesma spathulata EU493182
Platydesma spathulata EU493201
Pleiospermium alatum AF066821
Pleiospermium latialatum FJ434157
Poncirus trifoliata AB456050
罗焜等: 基于芸香科的植物通用 DNA 条形码研究
358
续附表 2
Species ITS2 psbA-trnH rbcL rpoC1
Poncirus trifoliata FJ606752
Poncirus trifoliata AJ235806
Rhadinothamnus anceps AY631914
Rhadinothamnus euphemiae AY631912
Rhadinothamnus rudis AY631913
Ruta angustifolia EU531646
Ruta chalepensis EU531645
Ruta graveolens EU591989
Ruta graveolens FJ434146
Ruta graveolens AY128251
Ruta graveolens U39281
Ruta montana AY484577
Sarcomelicope simplicifolia AF066817
Severinia buxifolia AB456048
Severinia buxifolia FJ434156
Severinia buxifolia AF066806
Sheilanthera pubens AM500913
Skimmia anquetilia AF066818
Spathelia excelsa AF066798
Staphylea trifolia AJ238406
Swinglea glutinosa AB456045
Swinglea glutinosa FJ434165
Tetradium ruticarpum DQ499601
Tetradium ruticarpum EF432817
Tetradium ruticarpum EF432818
Tetradium ruticarpum EU663533
Tetradium ruticarpum EU663534
Tetradium ruticarpum EU663535
Tetradium ruticarpum EU663536
Tetradium ruticarpum EU663537
Tetradium ruticarpum EU663538
Tetradium ruticarpum EU663539
Tetradium ruticarpum EU663540
Tetradium ruticarpum EU663541
Tetradium ruticarpum EU663542
Tetradium ruticarpum EU663543
Tetradium ruticarpum EU663545
Tetradium ruticarpum EU663546
Triphasia trifolia FJ434172
Vepris lanceolata AM500914
Wenzelia dolichophylla FJ434150
Zanthoxylum bungeanum DQ016542
Zanthoxylum bungeanum DQ016543
Zanthoxylum bungeanum DQ016544
Zanthoxylum capense AM500915
Zanthoxylum monophyllum U39282
Zanthoxylum piperitum AB445491