全 文 ：鼠尾草属植物的 DNA及RNA高效提取方法
聂洪丽 , 宋先强 , 邓科君 , 杨足君＊　(电子科技大学生命科学与技术学院 ,四川成都 610054)
摘要　以鼠尾草属植物为原料 ,采用CTAB法提取DNA ,并在 TSB法及氯化锂沉淀法的基础上改进并建立了一种高效高质量提取 RNA
的方法。用核酸测定仪测浓度和琼脂糖凝胶电泳检测质量 ,均获得了高浓度和高质量的DNA及RNA ,为 RT-PCR、分子克隆等分子生物
学实验提供了很好的模板。
关键词　鼠尾草属;RNA提取;DNA提取
中图分类号　Q503　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2007)30-09474-01
Highly Efficient Method of DNA and RNA Extraction in Salvia
NIE Hong-li et al　(College of Life Science and Technology , University of Electronic Science and Technology of China , Chengdu , Sichuan 610054)
Abstract　CTAB method for extracting DNA , RNA isolation with high efficiency and high quality was put forward based on the TSB method and lithium
chloride precipitation method , in which the plants of Salvia was used as material.Through nucleic acid determinator and agarose gel electrophoresis detec-
tion , the DNA and RNA extracted from root , stem and leaf of the material werewith high concentration and quality.
Key words　Salvia;RNA Extraction;DNA Extraction
作者简介　聂洪丽(1986-),女 , 四川成都人 , 本科生 , 专业:生物技
术。 ＊通讯作者。
收稿日期　2007-06-03
　　我国丰富的药用植物包含了与药物形成有关的丰富基
因资源 ,这些资源不仅对于维持物种的多样性十分重要 ,而
且对探寻中药活性成分相关功能基因及表达规律 ,确定药用
成分合成的调控机制 ,获得中药药用成分关键代谢途径和其
中的关键调控因子 ,为实现中药可持续发展也至关重要。因
此 ,高质量核酸的获得是进行药用植物分子生物学研究的重
要基础。
唇形科(Labiatae)鼠尾草属(Salvia)植物是一类重要的药
用植物 ,全世界有 1 000多种 ,生长于温热带地区 。该属多种
植物如丹参(S .miltiorrhiza)、红根草(S .prionitis)、云南鼠尾草
(S .yunnanensis)和甘西鼠尾草(S.przewalskii)等都被我国民
间长期用作丹参使用 ,这些种类除可作为丹参的新资源 ,还
将可能成为优良丹参种质选育基因库的种质资源[ 1-4] 。
为了对鼠尾草属丹参近缘物种进行深入研究 ,笔者对已
报道的提取核酸的方法均做了尝试并在此基础上进行了改
进 ,发现用CTAB 法提取总 DNA ,TSB法提取总 RNA具有良
好的效果。产物经琼脂糖凝胶电泳检测 ,所得 DNA和 RNA
质量较好 ,其纯度和浓度均可满足分子生物学的研究需要。
1　材料与方法
1.1　植物材料　丹参(S .miltiorrhiza)采自四川中江 ,峨嵋鼠
尾草(S .omeiana var.grandibracteata)采自四川峨嵋山 , S .
tesquicola 来源于俄罗斯 , S.sclarea 来源于南斯拉夫 , S .offici-
nalis来源于意大利巴西利卡塔州 , S.verticillata 来源于西班
牙 , S.azurea来源于美国堪萨斯州 , S .virgata 来源于土耳其。
1.2　主要试剂
1.2.1　DNA提取试剂。DNA提取缓冲液:0.02 g/ml CTAB ,
100mmol/L Tris-HCl(pH值8.0),25 mmol/L EDTA(pH值 8.0),
1.4 mol/L NaCl , 1%β-mercaptoethanol(用前加入);chloroform∶
isoamyl alcohol(24∶1),isoamyl alcohol , 70%ethanol 。
1.2.2　RNA提取试剂 。TSB Buffer(pH 值 8.5):100 mmol/L
Tris-HCl ,1%SDS , 2%β-mercaptoethanol;APC:satured-phenol(pH
值 4.3):chloroform=1∶1;NET Buffer:0.1 mol/L NaCl , 1mmol/L
EDTA(pH 值 8.0), 10 mmol/L Tris-HCl(pH 值 8.0);3 mol/L
NH4Ac ,8mol/L LiCl , butoxy-ethanol。
1.3　DNA提取方法　在 1.5ml离心管中加入 500μl DNA提
取液;取新鲜植物材料 0.2 ～ 0.3 g ,在液氮中研磨成粉并快速
转移到离心管中 ,60 ℃水浴 1 h ,其间缓慢摇动几次;加入 625
μl氯仿/异戊醇(24∶1),小心缓慢混匀 , 8 000 r/ min离心 15
min;取上清液置于另一个洁净离心管中 ,加入等体积异丙
醇 ,上下颠倒几次 ,冰上放置 30min ,8 000 r/ min 离心 4min;
小心倒掉上清液 ,沉淀用 70%的酒精洗 2～ 3次 ,放置至挥发
无味;加入 100μl ddH2O和 1μl RNase(10mg/ml),在 4 ℃条件
下溶解DNA , -20 ℃保存备用 。
1.4　RNA提取方法　RNA 酶活性灭除:用于RNA提取的器
皿以 1.1 MPa(121 ℃)高压灭菌 40min ,塑料器皿用DEPC水
处理后灭除 RNA酶。
①研钵用无水乙醇充分燃烧后 ,冷却;②取新鲜植物材
料 0.5 g左右 ,加 5%不溶性PVP(聚乙烯吡咯烷酮),置研钵
中 ,加液氮研磨至粉末状 ,转入 1.5 ml离心管;③加入 500μl
TSB Buffer ,室温放置 5min ,加入 250μl APC ,剧烈震荡混合 15
s ,室温放置 2min ,13 000 r/ min离心 2min;④取上清液加入
500μl APC ,剧烈混合 ,室温放置 2 min , 13 000 r/ min离心 2
min;⑤取上清液加入 500μl氯仿 ,剧烈混合 ,室温放置 2min ,
13 000 r/min离心 2min;⑥重复步骤⑤1次;⑦取上清液加入
50μl 3mol/L NH4Ac ,加入 2.5倍体积的无水乙醇 ,混合 , -80
℃放置 30min ,4 ℃、13 000 r/min离心 10min ,去上清液 ,沉淀
用 70%乙醇洗涤 2次 ,室温放置至挥发至无味;⑧沉淀用 750
μl NET悬浮 ,加入 300μl乙二醇丁醚 ,混匀 ,加入 0.625体积
的 8mol/L LiCl ,80 ℃放置 1 h , 4 ℃、13 000 r/min离心 15min;
⑨去上清液 ,沉淀用 70%乙醇洗涤 2次 ,室温放置至挥发无
味 ,加 30 ～ 50μl ddH2O溶解即得总 RNA , -80 ℃保存备用。
1.5　质量鉴定
1.5.1　DNA鉴定。取 5μl样品 ,稀释 100倍 ,用岛津核酸蛋
白测定仪进行测定 ,检测 A260/A280及样品浓度。同时在 1%
的琼脂糖凝胶上电泳检测提取质量 。
1.5.2　RNA鉴定。取 5μl样品 ,稀释 100倍 ,用岛津核酸蛋
(下转第 9479页)
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2007 , 35(30):9474 ,9479　　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　孙红忠　责任校对　李洪
灌浆速度也快 ,使百粒重增加;结荚初期追施氮肥 ,虽能使单
株荚数 、单株粒数增加 ,秕荚数减少 ,但并不能加快灌浆速
度 、提高光能利用率 ,从而使百粒重降低。
　　表 2 不同时期追施氮肥对产量及构成因素的影响
处理 单株荚数
秕荚
数
单株
粒数
百粒
重∥g
小区产
量∥kg
折单位面积
产量∥kg/ hm2
较 CK
±%
① 69.6 　5.6 124.9 21.6 　2.38 aA 3 300.00 　　19.3
② 56.9 14.0 108.3 22.8 2.23 aAB 3 100.05 12.1
③ 66.5 5.1 120.6 20.8 1.68 bB 2 333.40 -15.7
④ck 65.3 13.2 114.0 22.0 1.99 abAB 2 766.75
　注:小区产量为 3次重复的平均产量;不同大、小写字母分别表示在
0.01和 0.05水平上差异显著。
　　产量以 6片复叶期追氮和盛花期前 10 d追施氮肥能明
显增加 ,以 6片复叶期追氮增产最多 ,增幅为 19.3%,盛花期
前 10 d追氮增产 12.1%,但经方差分析表明 ,增产不显著 ,在
结荚初期追氮则减产较多 ,减幅为 15.7%,减产不显著。
3　小结与讨论
(1)不同时期追氮对神豆 2号的营养生长和生殖生长都
有一定的影响。都可降低结荚高度 、增加有效分枝。其中在
6片复叶期追氮能增加株高 、单株荚数 、单株粒数;盛花期前
10 d追氮株高降低 ,秕荚数增多 ,单株荚数 、单株粒数减少 ,
百粒重高;结荚期追氮株高 、秕荚数明显减少 、单株荚数 、单
株粒数增多 ,但百粒重降低。
(2)6片复叶期 、盛花期前 10 d追施氮肥 ,可促进大豆健
壮生长 ,增强抗倒伏能力 ,但在结荚期追氮易造成大豆后期
营养生长与生殖生长失调 ,使大豆旺长 ,田间郁闭 ,抗倒伏能
力减弱 ,灌浆速度减慢 ,百粒重下降 ,3个时期追氮对大豆外
观品质均无规律影响。
(3)6片复叶期 、盛花期前10 d追施氮肥 ,都可增加产量 ,
但增产不显著 ,结荚期追氮 ,减产较多。
(4)该试验是在追施纯氮 51.75 kg/hm2 的情况下做的 ,
至于不同地力水平 ,以及在该试验中 51.75 kg/hm2 是否为最
佳追肥量 ,有待于进一步研究。
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(上接第 9474页)
白测定仪测定 ,检测 A260/A280及样品浓度。同时在 1%的琼
脂糖凝胶上电泳检测提取质量。
2　结果与分析
2.1　DNA提取结果　用岛津核酸蛋白测定仪测定提取DNA
的 A260/A280值都在 1.8以上 ,电泳显示条带清晰且亮。
2.2　RNA提取结果
2.2.1　用岛津核酸蛋白测定仪测定提取RNA的结果。A260/
A280值均在 1.8～ 2.0。
2.2.2　琼脂糖电泳结果 。如图 1所示 ,能够看到泳道上28S 、
18S rRNA条带清晰 ,条带整齐 ,无背景 ,该方法提取鼠尾草属
植物 RNA完整性好 ,纯度高 ,浓度高。
　注:1～ 2.S.miltiorrhiza;3～ 4.S.omeiana var.grandibracteata;5.
S.tesquicola;6.S.sclarea;7.S.officinalis;8.S.verticillata;9.
S.azurea;10.S.virgata 。
图1　TSB法提取鼠尾草属总 RNA电泳结果
3　讨论
由于物种之间的差异性 ,不同植物的 DNA及 RNA提取
方法有很大的不同 ,特别对于富含次生代谢产物的植物 ,其
DNA及 RNA的提取方法必须经过实践和摸索才能建立。
(1)运用CTAB法[ 5] 提取鼠尾草属植物的 DNA ,氯仿/异
戊醇(24∶1)分离蛋白 ,结合低浓度的 NaCl进行沉淀 ,有利于
DNA与多糖和其他次生代谢产物相分离。
(2)RNA在生物体中含量少且不稳定 ,在植物中还有大
量的次生代谢产物干扰 ,因此提取高质量RNA较为困难[ 6] 。
经过多次试验 ,综合多种方法的优势 ,建立了一种高产率 、高
纯度 、高完整性 、快速易操作的鼠尾草属植物 RNA的提取方
法。在提取RNA的过程中 ,分别采用TSB法[ 7] 、苯酚法[ 8] 、异
硫氰酸胍法[ 9]提取鼠尾草属植物叶片 RNA ,结果显示只有
TSB法提取的 RNA产率较高。由于丹参含大量的次级代谢
产物 ,如丹参酮 、酚酸类成分等 ,影响了 RNA的提取质量 ,因
此对提取液中的Tris-HCl进行了考察 ,发现 pH值为 8.5时提
取效果最佳。液氮研磨时按比例加入 PVP[ 10] ,它可以与多
酚 、原花色素等在接下来的抽提中一起去除。在纯化 RNA
的过程中 ,用无水乙醇进行沉淀 ,并配合NET Buffer和乙二醇
丁醚[ 11] ,去除次生代谢产物的干扰 ,得到高质量的 RNA。
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