全 文 ：收稿日期:2005 -08 - 02
基金项目:黑龙江省骨干教师项目资助。
作者简介:张　晗(1979 - ) ,女 ,植物遗传学硕士研究生 ,从事种质检测研究工作。
　山 东 农 业 科 学 Shandong Ag ricultural Sciences 2006年　第 1期
紫萼藓科植物 DNA 提取及遗传多样性的分析
张　晗1 , 2 ,高永超3 ,沙　伟2 ,李汝玉1 ,戴　双1
(1. 山东省农业科学院作物研究所 ,山东 济南　250100;
2. 齐齐哈尔大学生命科学与工程学院生物系 ,黑龙江 齐齐哈尔　161006;
3. 山东省科学院中日友好生物技术研究中心 , 山东 济南　250014)
　　摘　要:采用随机扩增多态性 DNA(RAPD)方法对两种紫萼藓科植物的 6 个居群的 60 个个体进行遗传
多样性分析。用 11 个随机引物扩增出清晰谱带 52 条。聚类结果表明:紫萼藓科两种植物的 6个自然居群显
然聚为两大支 ,一支为东亚砂藓 , 另一支为毛尖紫萼藓。介绍了紫萼藓科植物 6 个自然居群及东亚砂藓与毛
尖紫萼藓的遗传变异情况。
关键词:DNA 提取;紫萼藓科;RAPD;遗传多样性
中图分类号:Q78;Q949. 35　　文献标识号:A　　文章编号:1001 - 4942(2006)01 -0007 -03
Study of DNA extraction and genetic diversity in grimmiaceae
ZHANG Han1 , 2 ,Gao Yong-chao3 ,SHA Wei2 , LI Ru-yu1 , DAI Shuang1
(1. Crop Research Institute , Shandong Academy o f Ag ricultural Sciences , J inan 250100 , China;
2. Department o f Biology , Col lege of Li f e Science and Engineering , Qiqihar University , Qiqihar 161006;
3. Biotechnology Research Center o f Shandong Academy of S ciences , J inan 250014)
　　Abstract　The genetic diversity o f six ty individuals of six populations o f Grimmiaceae were ana-
ly zed by random amplif ied polymorphic DNA (RAPD) markers. 52 loci w ere amplified by using 11
random primers. The results showed that six natural populations of Grimmiaceae were cluste red into
tw o of fshoots———Racomitrium canescens and Grimmia p il i fera , af ter the genet ic variabili ty analysis
and cluster analy sis.
Key words　Ex traction DNA;Grimmiaceae;RAPD;Genetic diversity
　　紫萼藓科(Grimmiaceae)紫萼藓属(Grim-
mia)和砂藓属 (Racom itrium)的毛尖紫萼藓
(Grimmia p il i fera)和东亚砂藓(Racomitrium
canescens)为典型的小型旱生藓类 ,植物体粗壮 ,
密集或松散丛生 ,主要生长在裸露的岩石表面或
岩石表面的薄土或砂土上。上无树木遮蔽 ,下无
湿润的土壤 ,而且 ,单层细胞的叶片没有特殊的抗
旱 、抗寒及抗紫外线的结构 ,其生存机理是否与其
特殊的遗传物质有关还有待进一步研究 。
以往国内对苔藓植物的研究大都集中在分
布 、形态 、细胞等方面[ 1 ～ 3] ,分子生物学方面的研
究较少 ,对紫萼藓科植物的研究更少 ,到目前为止
对紫萼藓科植物分子方面的研究未见报道。本试
验采用随机扩增多态性 DNA(RAPD)方法对上
述两种紫萼藓科植物的 6个居群的 60 个个体进
行遗传多样性研究 ,以初步了解两种藓类植物的
DNA 提取条件和居群的遗传多样性 。
1　材料与方法
1. 1　试验材料
采自五大连池(位于黑龙江省的北部地区 ,地
处中高纬度 。地理坐标为东经 126°06′～ 126°
26′,北纬 48°36′～ 48°50′)的石龙山 、黑龙山和火
烧山的火山岩上 ,样品距离 10 ～ 15 m ,采集后室
温培养 ,其上覆盖一层塑料膜 ,以保持水分。
1. 2　试验方法
7
DOI牶牨牥牣牨牬牥牳牫牤j牣issn牣牨牥牥牨牠牬牴牬牪牣牪牥牥牰牣牥牨牣牥牥牪
1. 2. 1　DNA的提纯　普通的 CTAB[ 4]法提取毛
尖紫萼藓和东亚砂藓的 DNA 较容易降解 ,针对
这两种藓类都属于小型旱生藓类及其特殊的生活
环境[ 2] ,主要从以下几个方面找出最佳试验条件:
EDTA 浓度分 别采用 60 mmol /L (E1)、 50
mmo l /L(E2)、40 mmo l /L(E3)、30 mmol /L(E4)、
20 mmo l /L(E5)进行试验;β -巯基乙醇的浓度为
0(β1)、0. 5%(β2)、1%(β3)、1. 5%(β4)、2%(β5);
将核糖核酸酶配制成 10 、20 、30 、40 、50 μg /ml 5
种浓度;对不同生活状态材料的 DNA 进行提取。
用紫外分光光度计检测 DNA 模板的浓度 , 用
0. 8%的琼脂糖凝胶电泳 、EB染色 、紫外灯下观察
照相 ,结果 DNA 带清晰 、无拖尾现象 ,表明 DNA
质量较好 。
1. 2. 2　引物筛选　用赛百盛公司生产的 100条
随机引物(10bp)、25 μl 的扩增反应体系进行筛
选。将扩增带清晰 、多态性强 、稳定 、重复性好的
11 条引物 , 全部用于两种紫萼藓科植物的总
DNA 样品的扩增 ,即:SBSA - 04 、SBSA - 11 、SB-
SA - 12 、SBSB - 01 、SBSB - 12 、SBSB - 18 、SBSC
- 01 、SBSC - 02 、SBSC - 04 、SBSC - 11 和 SBSC
- 14(其序列如表 1)。
　　表 1　　　　筛选出的各个引物及其序列
引物 序列 引物 序列
SBSA - 04 AATCGGGCTG SBSC - 01 TCGGCGA TAG
SBSA - 11 CAATCGCCGT SBSC - 02 G TGAGGCGTC
SBSA - 12 TCGGCGAT AG SBSC - 04 CCGCA TCT AC
SBSB - 01 GT TT CGCTCC SBSC - 11 AAAGCTGCGG
SBSB - 12 TCGGCGAT AG SBSC - 14 TGCGTGCTTG
SBSB - 18 CCACAGCAGT
1. 2. 3　PCR扩增及产物检测　用筛选好的 11
条随机引物(10bp)对全部的样品 DNA 进行 PCR
扩增 ,根据所需稀释基因组 DNA 的浓度 ,反应总
体积为 25 μl ,其中 dN TP 为 75 μmol /L ,引物为
0. 75 μmo l/L ,基因组 DNA为 30 ng , Taq 酶 1. 5
U ,其他成分为无菌双蒸馏水。扩增的程序为:
94℃4 min 1个循环;94℃1 min , 35℃1. 5 min ,
72℃2 min , 40 个循环;72℃10 min 1 个循环;
4℃保存。
扩增产物检测:扩增结束后 ,在反应混合物中
加入 5 μl /ml上样缓冲液(上样液含 0. 25%溴酚
蓝和 40%(W /V)蔗糖水溶液), 混匀。取 15 μl
点入含 0. 25 μg /m l溴化乙锭的 1. 5%琼脂糖凝
胶中 ,用 1×TBE 电泳缓冲液在 3 V /cm(84 V)的
电场下电泳 2 h左右 ,然后在紫外凝胶成像系统
下观察照相和分析。
1. 2. 4　数据处理　为了保证良好的可重复性 ,选
取清晰 、稳定 、重复性好的谱带用于最终的数据分
析。根据 Tadara DGL2000 标准分子量 ,依据统
一的标准 ,有带记为“ 1” ,无带记为“0” ,缺失数记
为“. ” ,形成 0 /1矩阵图 ,根据软件的需要输入计
算机 。用 POPG EN E 1. 00版软件计算东亚砂藓
和毛尖紫萼藓居群分支情况 ,按照 UPGMA 法进
行聚类分析。
2　结果与分析
2. 1　最佳条件组合
试验中 ,筛选出一组提取 DNA 的最佳条件 ,
即 EDTA 浓度为 20 mmol /L , 0. 5%β-巯基乙醇
30 ml 、RNAase浓度 50 mg /ml ,新鲜材料 。在此
条件下 ,重新对上述样品进行电泳 ,结果显示 ,
DNA 的质量和纯度较高 ,谱带清楚且均匀。经紫
外分光仪检测 ,A 260 /A 280比值在 1. 75 ～ 1. 85之间
(图 1)。
图 1　提取基因组 DNA 的紫外吸收光谱
2. 2　扩增结果及分析
用筛选好的 11条引物对紫萼藓科植物的 6
个自然居群的样品进行 RA PD 扩增。每个引物
的扩增片段在 3 ～ 9 条之间 ,利用 11 个随机引物
共获得 52条谱带 ,即共检测到 52个位点 ,平均每
个引物检测到 4. 73个位点。
2. 3　两种紫萼藓科植物遗传多样性分析
由表 2可以看出 ,各居群间的遗传多样性差
别比较大 。其中 ,火烧山东亚砂藓的居群(H′S)
具有最多的多态位点数(41)以及最高的多态位点
数比率(78. 85%)、Nei′s基因多样性(0. 2654)、
Shannon′s指数(0. 4021),遗传多样性最高;石龙
东亚砂藓居群(S′S)的各指标均最低 ,遗传多样性
最低;火烧山毛尖紫萼藓居群(H′Z)的遗传多态
性也较低 ,石龙毛尖紫萼藓居群(S′Z)、黑龙山东
亚砂藓居群(HS)和黑龙山毛尖紫萼藓居群(HZ)
的各指标居中 ,遗传多样性逐渐减小。
由表 3的从属间分析可知 ,毛尖紫萼藓和东
8
亚砂藓之间存在明显的遗传差异 ,且毛尖紫萼藓
的遗传多样性较丰富 ,东亚砂藓的遗传多样性相
对贫乏。
　　表 2　　紫萼藓科植物 6个自然群体的遗传变异
居群 个体数
总位
点数
多态位
点数
多态位点
比率(%)
Nei′s基
因多样性
Shannon′s
指数
HS 10 52 36 69. 23 0. 2433 0. 3657
S 0. 1925 0. 2723
HZ 10 52 35 67. 31 0. 2282 0. 3472
S 0. 1839 0. 2651
S′S 10 52 30 57. 69 0. 2149 0. 3190
S 0. 2049 0. 293
S′Z 10 52 37 71. 15 0. 2475 0. 3730
S 0. 1889 0. 2672
H′S 10 52 41 78. 85 0. 2654 0. 4021
S 0. 1809 0. 2496
H′Z 10 52 31 59. 62 0. 2061 0. 3111
S 0. 1951 0. 2801
居群平均 10 52 35 67. 31 0. 2342 0. 3530
S 0. 1910 0. 2712
　　注:S 指标准差 ,下同;H S指黑龙山东亚砂藓;HZ 指黑龙山
毛尖紫萼藓;S′S指石龙东亚砂藓;S′Z 指石龙毛尖紫萼藓;H′S
指火烧山东亚砂藓;H′Z 指火烧山毛尖紫萼藓。
　　表 3　　 东亚砂藓和毛尖紫萼藓的遗传变异
居群 个体数
总位
点数
多态位
点数
多态位点
百分比率
Nei′s基
因多样性
Shannon′s
指数
东亚砂藓 30 52 45 86. 5 0. 2510 0. 3902
S 0. 1686 0. 2275
毛尖紫萼藓 30 52 51 98. 08 0. 2833 0. 4406
S 0. 1490 0. 1878
2. 4　居群间聚类分析
聚类结果显示 ,紫萼藓科两种植物的 6个自
然居群显然聚为两大支。一支为东亚砂藓 ,黑龙
山东亚砂藓居群与火烧山东亚砂藓居群先聚类 ,
然后再与石龙东亚砂藓聚类;另一支为毛尖紫萼
藓 ,黑龙山毛尖紫萼藓居群先与石龙山毛尖紫萼
藓居群聚类。表明距离较近的居群遗传上很明显
地优先聚类。
3　结论与讨论
3. 1　两种紫萼藓科植物的遗传多样性
苔藓植物是植物界的一个重要门类 ,属孢子
植物 ,为高等植物的一个重要分支。一般结构较
简单 ,以矮小的身躯和广泛的适应性为特征 。它
以独特的生活方式代表着植物界从水生向陆生的
过渡类型 。苔藓植物具有丰富的遗传多样性[ 5] ,
其生物多样性较人们普遍的概念和印象要丰富和
复杂得多 。尤其在我国 ,气候类型多样 ,地貌类型
丰富 ,苔藓植物资源幅员辽阔 ,是世界上苔藓植物
种类最丰富的国家之一。
试验结果表明 ,火烧山东亚砂藓的居群在 6
个居群中具有最高的遗传多样性 ,石龙东亚砂藓
的居群具有最低的遗传多样性 ,火烧山毛尖紫萼
藓的居群的遗传多样性较低 ,石龙毛尖紫萼藓居
群 、黑龙山东亚砂藓居群及黑龙山毛尖紫萼藓居
群的遗传多样性逐渐减小 ,遗传差异的大小可能
与各自的生长环境 、所处的地理位置及自身的生
理机制有关。
3. 2　RAPD试验注意事项
为了得到更好的试验结果 ,在试验及数据处
理过程中需要特别注意以下几点:(1)DNA 的纯
度:汪小全等[ 6 , 7]在银杉(Cathaya argyrophy l la)
上的研究发现 , RNA 对扩增结果无影响 ,模板中
一定量的蛋白质不影响扩增;而 DNA 模板中残
留的微量氯仿 、SDS 、CTAB 、异丙醇等往往影响
扩增结果 ,这主要是因为这些未被除尽的小分子
有机物 ,直接影响了 Taq聚合酶的活性 。因此 ,
提取 DNA时 ,要把小分子有机物的含量降到最
低 ,从而减小对 PCR扩增的影响 。(2)条件的一
致性:试验药品 、流程要相同;电压恒定 、电流时间
一致 、琼脂糖的浓度一致 、读带的标准始终一致 ,
最大限度减少人为误差。(3)严防污染:由于采用
较低的退火温度及短的随机引物 , RAPD 对污染
非常敏感 。共生物 、寄生物以及标本保存过程中
出现难以预料的变化 ,都可能影响 RAPD 结果。
提取模板 DNA 之前 ,要用双蒸无菌水清洗标本;
加样过程中注意防止污染;试验中应设空白对照 ,
以排除系统误差。(4)勤换电泳缓冲液:多次使用
的电泳缓冲液内存在杂质 ,易产生拖尾或者谱带
模糊不清的现象 ,影响电泳效果。
参　考　文　献:
[ 1] 　中国科学院昆明植物研究所编著. 云南植物志[M ]. 昆明:
云南科学出版社 , 2002 , 18:330-343.
[ 2] 　J Fridovich. The biology of oxygen radical [ J] . S cience ,
1975 , 201:875-880.
[ 3] 　Pallit t K E , Young A J , Alscher R G. Ant ioxidants in high-
er plan ts[ M]. Boca Raton , CRC Press:1992 , 59-60.
[ 4] 　邹喻苹 ,葛　颂 ,王晓东 , 等. 系统与进化植物学中的分子
标记[ M ]. 北京:科学出版社 , 2001.
[ 5] 　崔明昆. 苔藓植物的染色体多样性[ J]. 生物学杂志 , 2001 ,
18 (3):8-10.
[ 6] 　汪小全 ,邹喻苹 ,张大明 ,等 . 银杉遗传多样性的 RAPD 分
析[ J]. 中国科学(C辑), 1996 , 26(5)∶436-441.
[ 7] 　汪小全 ,邹喻苹 ,张大明 ,等. RAPD应用于遗传多样性和系
统学研究中的问题[ J]. 植物学报 , 1996 , 38(12)∶954-962.
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