全 文 ：生 物 技 术 通 讯LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol.23 No.6 Nov., 2012
doi: 10.3969/j.issn.1009-0002.2012.06.022 技术方法
一种快速提取葱属植物DNA的方法
王婵 1，2，田保华 1，裴雁曦 1，王永勤 2
1. 山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006；2. 北京市农林科学院 蔬菜研究中心，北京 100097
［摘要］ 目的：针对分子育种工作的繁琐性及葱属植物次生代谢物较多的特点，研究一种利用普通试剂及简单仪器
高效快速提取葱属植物DNA的方法。方法：对碱处理法稍加改进，在碱性环境中高温裂解细胞，将释放的DNA保存
在 Tris缓冲液中，用 PCR检测提取质量并分析DNA的保存时间。结果：与用试剂盒提取的DNA相比，扩增产物无显
著差异，利用此方法提取DNA并分析了 13个洋葱品种的细胞质雄性不育类型；保存时间分析显示，DNA在常温下只
能保存 5 d，在 4℃或-20℃可至少保存 2个月。结论：该方法方便快速、成本低、适于田间操作，得到的DNA可满足分
子生物学实验的基本要求，可用于以 PCR为基础的分子标记辅助育种。
［关键词］ DNA提取；碱处理法；保存时间；葱属
［中图分类号］ Q94-336; Q78 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1009-0002（2012）06-0860-03
A Rapid Method for Extracting DNA in Allium
WANG Chan1,2, TIAN Bao-Hua1, PEI Yan-Xi1*, WANG Yong-Qin2*
1. College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006; 2. Beijing Vegetable Research Center, Beijing Acad⁃
emy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097; China
*Co-corresponding authors, WANG Yong-Qin, E-mail: wyqty@sohu.com; PEI Yan-Xi, E-mail: peiyanxi@sxu.edu.cn
［Abstract］ Objective: Because breeding is tedious and Allium have many secondary metabolites, we described a
rapid method using common reagents and simple apparatus for extracting DNA in Allium. Methods: The alkali
treatment was improved. The plant cells were cracked in the high temperature when exist NaOH, then the re⁃
leased DNA were stored in Tris buffer. The quality and storage period of DNA were studied by PCR. Results:
Compared with DNA extracted by kit, their amplification product have no significant difference. Using this method
the DNA were extracted and the styles of cytoplasm were identified of 13 onion varieties. Analysis of the time of
storage showed that DNA can be kept for 5 days at room temperature, at least two months at 4℃ or -20℃. Con⁃
clusion: This rapid method is convenient and fast. Also, it has the low cost and is suitable for field operation.
The extracted DNA can be used for the molecular marker-assisted breeding based on PCR.
［Key words］ DNA extraction; alkali treatment; time of storage; Allium
快速提取DNA是作物分子育种发展的前提，无
论是对植物遗传多样与亲缘关系的研究、种质资源
与种子纯度的鉴定，还是相关基因的定位与克隆，都
需要大批量地提取 DNA。目前植物 DNA提取最常
用的方法有 CTAB法、SDS法、果胶酶法、高盐低 pH
值法，虽然这些方法都已成熟，但均步骤繁多、费时
费力、成本高 [1-2]，不适合田间大批量提取，而且所用
试剂中的氯仿、苯酚等有机物质对人体有害。近年
来，针对部分作物提出了一些便捷的提取方法，如碱
处理法 [3]、高温水煮法 [4]、直接 PCR扩增法 [5]等，大大
缩短了提取时间，且提取的DNA也能满足分子生物
学研究的需求，但这些方法在葱属中还未见相关应
用报道。
葱属（Allium）植物含有丰富的含硫化合物、黄
酮类化合物及多糖等，具有多种生理功能 [6-7]，如抑菌
消炎、抗血小板聚集、抗氧化、降低胆固醇、抗肿瘤和
缓解糖尿病等，但这些次生代谢物却严重影响了提
取DNA的质量。虽然相关报道认为 CTAB法可以有
效地去除多糖 [8-9]，但本实验室通过改良 CTAB法提
取大葱、洋葱基因组 DNA，发现样品中仍含有多糖
等胶状物质，影响正常 PCR的进行。因此，改用试剂
盒提取 DNA，可以有效地去除多糖，然而试剂盒价
格昂贵，不适于大批量提取。基于此，我们通过改进
碱处理法，提出了一种快速、操作简单、成本低、适合
在缺乏设备的田间提取DNA的方法，所提取的DNA
收稿日期：2012-03-23
基金项目：国家自然科学基金（31071794）；农业部“九四八”项目
（2011-Z61）；北 京 市 农 林 科 学 院 科 技 创 新 能 力 建 设 专 项
（KJCX201101010）
作者简介：王婵（1988- ），女，硕士研究生
通信作者：王永勤，（E-mail）wyqty@sohu.com；裴雁曦，（E-mail）pei⁃
yanxi@sxu.edu.cn
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王婵等：一种快速提取葱属植物DNA的方法
可满足分子生物学实验的基本要求，对大批量提取
植物DNA的分子育种研究具有实际意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1个大葱（A.fistulosum L.）细胞质雄性不育品
种、13个洋葱（A.cepa L.）细胞质雄性不育品种，由北
京市农林科学院蔬菜研究中心提供。Taq DNA聚
合酶和 dNTP均购自 TaKaRa公司；引物由上海生工
公司合成。
1.2 碱处理法提取DNA
参照Wang等 [10]的方法并加以改进。采集葱属
植株的幼嫩叶片或鳞茎 5 mg，放进 1.5 mL无菌离心
管中，加入 60 μL 0.4 mol/L NaOH溶液，将 1.0 mL
离心管的盖子剪去，套在削好的铅笔头上，用力将材
料研磨至碎；将研磨后的样品轻甩，沸水中煮 1
min，10 000 r/min离心 1 min（也可不离心）；取 10
μL上清液到新的 1.5 mL离心管中，加入 490 μL
0.1 mol/L Tris-Cl（pH8.0）溶液，混匀备用。
1.3 对照DNA的提取
对照DNA的提取采用博凌科为公司的 CTAB植
物基因组DNA提取试剂盒进行，具体方法参照试剂
盒说明书。
1.4 PCR检测不同条件提取的DNA的质量
rrn26是线粒体上编码 26S rRNA的基因 [11]，利
用该基因的 PCR效果来检测所提取的 DNA的质
量。PCR反应体系（20 μL）包括模板 DNA 2 μL、
10×缓冲液 2 μL、dNTP（2.5 mmol/L）1.6 μL、Taq聚
合酶（5 U/μL）0.2 μL、rrn26上下游引物（引物序列
见表 1）各 1 μL、ddH2O 12.2 μL。反应程序：94℃预
变性 5 min；94℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸
1 min，35个循环；72℃延伸 10 min，4℃保存扩增产
物。取 5 μL在 1.0%琼脂糖凝胶上水平电泳（110 V
恒定电压 35 min），用凝胶成像系统观察并拍照。
1.5 细胞质雄性不育类型的鉴定
cob是线粒体上编码细胞色素 b的基因。研究
表明 [12]，洋葱 S型雄性不育 cob基因上游区域插入一
个 471 bp的片段（起始密码子上游-523~-53），Sato
根据这一序列设计了 3条 cob引物（表 1），在 S型与N
型胞质中分别扩增出 414和 180 bp的条带，能方便
地从群体中找出含 S型不育细胞质的植株。PCR体
系及程序同上（退火温度为 57℃）。
2 结果
2.1 取材部位及是否离心对提取DNA质量的影响
由于用本快速方法提取的DNA浓度较低，直接
用琼脂糖凝胶电泳很难观察到，因此我们采用普通
PCR检测DNA的质量。实验中以 1个大葱品种为材
料，设计了 2个变量（取材部位及是否离心，其中取
材部位分为叶片和鳞茎）。利用 rrn26 引物进行
PCR，扩增出一条约 400 bp的片段（图 1）。从图 1可
以看出，鳞茎比叶片的条带稍亮，但没有显著差异，
说明选材鳞茎比叶片稍好，鳞茎因含水分较多而易
于研磨；是否离心对本实验没有影响，结果没有差
异，只须注意未离心时要尽量吸取上清，这样适于缺
乏仪器的田间操作，能方便快捷地完成植物DNA的
提取；用本方法快速提取的DNA与用试剂盒提取的
DNA相比无显著差异，说明这种快速方法提取的
DNA可用于 PCR扩增，其结果稳定、可靠。
2.2 提取DNA的保存条件与保存时间分析
为了检测用本方法提取的DNA的保存期限，我
么将 DNA分别保存在常温（10~15℃）、4℃、-20℃条
件下，定期对其进行 PCR检测（引物为 cob）（图 2）。
第 5 d，在 4℃与-20℃条件下保存的条带较亮，而常
温下保存则无条带或条带很暗，说明常温下该DNA
可保存 5 d；在 4℃或-20℃条件下保存 30 d，DNA质
量均良好；保存 60 d，在 4℃条件下条带暗或无条
带，在-20℃条件下条带均较暗，表明储存 60 d后
DNA质量发生改变。由此得出，在常温下DNA只能
保存 5 d，4℃或-20℃下至少可保存 2个月。
2.3 利用提取的 DNA鉴定洋葱细胞质雄性不育类
型
利用 cob分子标记鉴定了 13个洋葱雄性不育细
胞质类型（图 3）。可以看出，用这种快速方法提取
的DNA均能扩增出稳定的条带，其中 2个品种（2、11
号）扩增出 180 bp的片段，其余均扩增出 414 bp的
表 1 引物及序列
引物
rrn26 F
rrn26 R
cob（S）
cob（C）
cob（N）
序列
5-GATCCTTCCCAGTAAAACG-3
5-CTTCAACCTGCTCATGGC-3
5-GTCCAGTTCCTATAGAACCTATCACT-3
5-CTTTTCTATGGTGACAACTCCTCTT-3
5-TCTAGATGTCGCATCAGTGGAATCC-3
图 1 大葱 rrn26基因扩增结果
M：MarkerⅡ DNA marker；1-4：叶片取材；5-8：鳞茎取材；
1、2、5、6：经离心；3、4、7、8：未经离心；9：用试剂盒提取的DNA
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片段（这其中部分品种也扩增出了 180 bp片段，但
条带均比 414 bp弱）。这与吴海涛等 [13]的实验结果
一致，说明 2号和 11号品种为 T型细胞质，其余品种
为 S型细胞质。由此可见，用该方法提取的 DNA质
量达到了预期效果，可应用于细胞质类型鉴定等分
子育种研究。
3 讨论
提取植物DNA的传统方法，如 CTAB法、SDS法
及高盐低 pH值法步骤繁多，不适于田间操作。我们
将碱处理法稍加改进，提出了一种简便快捷、适合于
田间操作的葱属植物 DNA提取方法。在碱性环境
下加热裂解细胞，将释放的 DNA保存在 Tris缓冲液
中，方便快捷、操作简单，8~10 min就可以完成 40个
样品的 DNA提取；不需要组织破碎仪、离心机等仪
器，只需普通的试剂和离心管，适于田间大批量
DNA的提取；样品取材用量少，5 mg足够，适于某些
珍贵材料DNA的提取。陆雪莹等 [14]用碱处理法提取
荒漠植物 DNA，用量为 40~50 mg，且步骤中需要 2
次离心；楼巧君等 [15]用碱处理法提取水稻基因组
DNA，对 DNA保存时间进行了分析，发现 4℃存放
30 d后基本扩增不出可见条带。而我们对保存时
间做了更精细的研究，发现常温下可放置 5 d，在
4℃或-20℃条件下可放置 2个月，从条带亮度上
看，-20℃还可以存放得更久一些。
我们探讨了提取部位及是否离心对所提 DNA
质量的影响，发现以肉质鳞茎为材料稍好，是否离心
对提取质量无影响，进而优化了田间操作条件。将
用该方法提取的 DNA扩增产物与试剂盒提取的
DNA扩增产物相比，无显著差异，说明该方法提取
的 DNA质量较好，完全适用于 PCR。此外,通过 cob
标记鉴定了 13个洋葱雄性不育的细胞质类型，表明
该方法提取的 DNA可用于分子标记辅助育种，如
RAPD、SSR，还可用于筛选抗病虫基因、雄性不育相
关基因等。
本研究为葱属植物 DNA提取提供了一种快速
高效的方法，适于田间大批量提取，从而为分子育种
工作奠定了良好的基础。
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图 2 提取的DNA保存条件与保存时间分析
A、B、C：分别为保存第 5 d、30 d和 60 d的 PCR检测结果；M：MarkerⅡ DNA marker；1、2：4℃保存；3、4：-20℃保存；5、6：常温保存
图 3 洋葱雄性不育细胞质类型的鉴定
M：MarkerⅡ DNA marker；1-13：13个洋葱细胞质雄性不育品种
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