全 文 ：部分景天属植物 DNA条形码引物的筛选
张 洋，郝海叶，那冬晨* (山西师范大学生命科学学院，山西临汾 041004)
摘要 ［目的］对景天属植物分类所需用的相关 DNA条形码引物进行筛选。［方法］以景天属(Sedum)中的佛甲草、八宝景天、华北景
天、费菜、垂盆草 5种植物为研究材料，采用 CTAB法分步提取核 DNA和叶绿体 DNA，PCＲ扩增筛选引物，琼脂糖凝胶电泳检测 PCＲ扩
增产物。［结果］从 psbA-trnH、ropB、rbcL、rpoC1、ITS 2、matK 6 个候选序列引物中初步筛选出适合景天属植物 DNA 条形码的 4 对引
物———psbA-trnH、ropB、rpoC1、ITS 2，这 4对引物的扩增率均达到 100%。［结论］为景天属植物 DNA条形码研究提供相关依据。
关键词 景天属植物;引物筛选;DNA条形码
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2015)16 －053 －02
The Primers Selection of Sedum Plants DNA Barcoding
ZHANG Yang，HAO Hai-ye，NA Dong-chen* (Life Science College，Shanxi Normal University，Linfen，Shanxi 041004)
Abstract ［Objective］The aim was to select relevant DNA barcoding primers that the classification of Sedum plants needed． ［Method］
Choosing 5 species from Sedum plants as research materials，which was Sedum lineare Thunb，Sedum spectabile Boreau，Sedum tatarinowii Max-
im，Sedum aizoon L． and Sedum sarmentosum Bunge． Chloroplasts DNA and nuclear DNA of 5 species from Sedum plants were extracted by
CTAB method to step-by-step extracting，primers were selected by PCＲ，PCＲ productions were tested by agarose gelelectrophoresis．［Ｒesult］
Four pairs of primers(psbA-trnH、ropB、rpoC1、ITS 2)had been obtained preliminarily from six pairs candidate primers(psbA-trnH、ropB、rbcL、
rpoC1、ITS 2、matK)． The amplification rate of four pairs primers reached 100% ． ［Conclusion］The study provided related basis for studying
DNA barcoding of Sedum plants．
Key words Sedum plants;Primers selection;DNA barcoding
基金项目 山西省大学生创新实验项目(SD2012CXSY-24)。
作者简介 张洋(1992 －) ，男，山西临汾人，硕士研究生，研究方向:群
体遗传学。* 通讯作者，副教授，博士，从事植物分子生物
学研究。
收稿日期 2015-04-15
景天属(Sedum)植物多为一年生或多年生草本，大多为
肉质植物，茎叶多汁液，耐旱性极强，花朵美丽，花色丰富。
植株矮小，株高 20 ～ 50 cm。景天属在我国共有 124 种，1 亚
种，14变种以及 1变型，大多数产于热带干旱地区，主要野生
于岩石地带、山坡石缝、林下石质坡地、山谷石崖等处。喜光
照，适生温度为 15 ～18 ℃，部分种耐阴，对土质要求不严［1］。
喜湿润，但忌涝［2］，性耐寒，宜于砂壤土生长。
DNA条形码(DNAbarcoding)是利用 DNA片段快速鉴别
物种的基因工具，可通过比对一段较短的 DNA 序列进行物
种鉴定。在理论上，这段短序列可以区分并鉴定地球上所有
物种。构建 DNA条形码标准数据库，利用该项技术鉴别己
知物种和发现新物种，是目前分子生物学和分类学发展的最
新方向［3］。笔者以部分景天属植物为材料，寻找该属植物
DNA条形码的适宜引物，为确定该属植物的 DNA 条形码序
列、快捷有效地鉴别该属植物奠定基础，同时也可促进该属
植物亲缘学和化学分类学等的研究。
1 材料与方法
1． 1 试验材料 佛甲草、八宝景天、华北景天、费菜、垂盆
草。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 DNA 提取。分别采摘上述 5 种植物生长良好的嫩
叶，进行叶绿体 DNA和核 DNA的分步提取［4 －6］。所得 DNA
于 －20 ℃冰箱保存。
1． 2． 2 引物筛选。参考相关的 DNA 条形码通用序列研究
资料，结合景天属植物的形态特征和生理特征，初步选取 ps-
bA-trnH、ropB、rbcL、rpoC1、ITS 2、matK作为候选序列(表 1)。
表 1 候选引物序列
序列名称 引物名称 碱基序列(5 －3) 浓度∥μmol /L 基因组 序列大小∥bp
psbA-trnH PA GTT ATG CAT GAA CGT AAT GCT C 10 叶绿体 400 ～700
TH CGC GCA TGG TGG ATT CAC AAT CC 10
ropB rB1f AAG TGC ATT GTT GGA ACT GG 10 叶绿体 400 ～500
rB4r GAT CCC AGC ATC ACA ATT CC 10
rbcL rl1 ATG TCA CCA CAA ACA GAA AC 10 叶绿体 500 ～700
rl2 TCG CAT GTA CCT GCA GTA GC 10
rpoC1 rpoC1-2f GGC AAA GAG GGA AGA TTT CG 10 叶绿体 500 ～600
rpoC1-4r CCA TAA GCA TAT CTT GAG TTG G 10
matK 390f CGA TCT ATT CAT TCA ATA TTT C 10 叶绿体 900 ～1 000
1326r TCT AGC ACA CGA AAG TCG AAG T 10
ITS 2 IT5af CCT TAT CAT TTA GAG GAA GGA G 10 核 400 ～500
IT4r TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 10
对上述 6对候选序列引物进行筛选，并进行 PCＲ反应体
系和反应条件的优化。各对引物相应的 PCＲ反应体系见表
2，反应条件见表 3。其中 matK 序列需要进行 2 次 PCＲ 扩
增，第 2次扩增以第 1 次 PCＲ扩增产物为模板，用同样的反
应条件进行第 2次扩增。
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2015，43(16):53 － 54 责任编辑 李占东 责任校对 李岩
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2015.16.022
表 2 PCＲ反应体系 μl
反应体系各组分 叶绿体 DNA引物 总 DNA引物
Buffer(10 ×) 2． 5 4． 0
dNTP(10 mmol /L) 0． 5 0． 5
ddH2O 18． 5 16． 8
5-引物 0． 5 0． 5
3-引物 0． 5 0． 5
Taq酶(2 U /μl) 0． 5 0． 7
DNA模板 2． 0 2． 0
总体积 25． 0 25． 0
表 3 PCＲ反应条件
序号 程序
psbA-trnH、rbcL
温度∥℃ 时间
ropB、rbcL、matK
温度∥℃ 时间
ITS 2
温度∥℃时间∥min
1 预变性 94． 0 5 min 94． 0 4 min 94． 0 5
2 变性 94． 0 1 min 94． 0 30 s 94． 0 1
3 退火 55． 0 50 s 53． 0 40 s 55． 0 1
4 延伸 72． 0 1 min 72． 0 40 sc 72． 0 1． 5
5 go to 2 35循环 go to 2 35循环 go to 2 35循环
6 延伸 72． 0 7 min 72． 0 7 72． 0 7
1． 2． 3 电泳检测。提取的核 DNA 和叶绿体 DNA 用 0． 8%
琼脂糖凝胶电泳检测;PCＲ扩增产物用 1． 5%琼脂糖凝胶电
泳检测。
2 结果与分析
2． 1 叶绿体 DNA序列引物的筛选
2． 1． 1 psbA-trnH、ropB、rpoC1。研究表明，psbA-trnH、ropB、
rpoC1 3对引物均可作为景天属植物的 DNA条形码引物。3
对引物的扩增率都达到 100%，扩增产物大小分别为 250 ～
450 bp、500 bp左右、500 ～650 bp，且种间差异明显，种内差异
较小(图 1 ～3)。
注:1．佛甲草;2．八宝景天;3．华北景天;4．费菜;5．垂盆草。
图 1 psbA － trnH序列扩增结果
注:1．佛甲草;2．八宝景天;3．华北景天;4．费菜;5．垂盆草。
图 2 ropB序列扩增结果
注:1．佛甲草;2．八宝景天;3．华北景天;4．费菜;5．垂盆草。
图 3 rpoC1序列扩增结果
2． 1． 2 rbcL、matK。研究表明，rbcL、matK 2 对引物不适合作
为景天属植物 DNA条形码的引物。其中 rbcL序列的扩增率
仅为 40%，扩增出来的片段大小在 750 bp左右。matK 序列
经过 2次扩增未能检测到相关产物。
2． 2 核 DNA序列引物的筛选 ITS 2序列 PCＲ扩增率也达
到 100%，扩增片段大小为 700 ～750 bp(图 4)。
注:1．佛甲草;2．八宝景天;3．华北景天;4．费菜;5．垂盆草。
图 4 ITS 2序列扩增结果
3 结论与讨论
(1)该试验最终在 psbA-trnH、ropB、rbcL、rpoC1、ITS 2、
matK 6对引物中成功筛选出 3 对叶绿体 DNA 引物对(psbA
－ trnH、ropB、rpoC1)和 1 对总 DNA 引物对(ITS 2)。这 4 对
引物可以进行相互组合，从而能更好地对景天属植物进行
分类。
(2)据文献记载，ITS 2序列大小一般在 400 ～ 500 bp，而
该试验经过多次重复，结果显示 ITS 2 序列大小为 700 ～ 750
bp;另有文献显示一些景天科植物中 rbcL的扩增率达 100%，
该试验进行多次重复，扩增率均不超过 40%。以上差异之处
还有待于进一步深入研究。
参考文献
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45 安徽农业科学 2015 年