全 文 ：　第31卷 第3期　　　　　　 　　　　　　　　　宁夏大学学报(自然科学版) 2010年9月
　Vol.31 No.3　　　　　　　　 Journal o f Ningxia Unive rsity(Natural Science Edition) Sep.2010
文章编号:0253-2328(2010)03-0269-04
胡卢巴基因组 DNA提取及 RAPD引物筛选
王掌军 , 　刘　萍
(宁夏大学 农学院 ,宁夏 银川　750021)
摘　要:以胡卢巴叶片为材料 , 利用改良 CTAB 法提取基因组 DNA 并进行质量检测和含量测定 , 在优化 RAPD 反
应体系的基础上 ,对 100 条 RAPD 随机引物进行了筛选.结果表明 , 采用改良 CTAB法能从胡卢巴叶片中提取到高
质量的 DNA , 可以用于 RAPD分析;从 100条随机引物中筛选出了 16 条显示胡卢巴遗传差异的多态性引物 ,为胡
卢巴遗传多样性研究提供分子依据.
关键词:胡卢巴;基因组 DNA;RAPD;引物筛选
分类号:(中图)Q78　　　　文献标志码:B
收稿日期:2009-12-16
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30660017)
作者简介:王掌军(1978—), 男 ,讲师 , 硕士 ,主要从事植物分子遗传育种研究.
　　胡卢巴(Trigonel la foenum-graecum Linn)又名芸
香草 、香苜蓿 ,系豆科蝶形花亚科一年生草本植物[ 1] ,
国内外不少地区均有栽培或野生资源分布.胡卢巴以
种子入药 ,近年来 ,对胡卢巴的化学成分 、药理作用 、引
种及栽培管理方面的研究不断深入 ,但国内未见用分
子标记研究胡卢巴.分子标记技术的出现 ,使植物育种
中的“间接选择”成为可能 ,大大提高了遗传分析的准
确性和选育品种的有效性.随机引物扩增多态性(Ran-
dom Amplified Polymorphic DNA ,RAPD)标记 ,是 1990
年Williams和Welsh领导的两个研究小组同时提出
的[ 2] .该标记以一系列随机排列碱基顺序的寡聚核苷
酸单链为引物 ,对所研究的基因组 DNA 进行 PCR扩
增 ,当某一引物同模板 DNA有互补的结合位点 ,同时 ,
这些结合位点在基因组某些区域内的分布符合 PCR
扩增条件 ,且引物的两端相距在一定长度范围内
(200～ 4 000 bp),就可以扩增出PCR片段.目前 ,RAPD
标记在遗传图谱构建 、基因定位和克隆 、外源导入基因
的跟踪 、物种亲缘关系和进化关系研究 、遗传多样性检
测以及品种(杂种)快速鉴定等生物学的许多领域都得
到了广泛应用 [ 3-8] .本试验以胡卢巴为材料 ,研究了胡
卢巴基因组 DNA提取及 RAPD引物筛选 ,为从 DNA
多态性角度直接揭示胡卢巴遗传多样性奠定基础.
1　材料和方法
1.1　供试材料
　　供试的 22份种质均由宁夏大学植物遗传育种实
验室收集 ,其材料编号及来源如表 1所示 ,其中 ,国外
种质 6份 ,国内种质 16份 ,包括宁夏当地种质 8份.
表 1　供试胡卢巴种质资源编号及来源
材料编号 　来　源 材料编号 　来　源
1 宁夏银川市 12 河南陕县
2 宁夏彭阳县 13 云南昆明市
3 宁夏隆德县 14 内蒙鄂托克前旗
4 宁夏同心县 15 青海西宁市
5 宁夏青铜峡市 16 甘肃玉门市
6 宁夏西吉县 17 埃及Ⅰ
7 宁夏平罗县 18 埃及Ⅱ
8 宁夏固原市 19 中东某国
9 青海海西县 20 以色列
10 河北丰宁县 21 利比亚
11 内蒙巴彦淖尔盟 22 尼泊尔
1.2　主要试剂与仪器
　　2.5%CTAB 提取液 ,2% a-巯基乙醇 ,1%PVP ,随机
引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成 ,TaqDNA
聚合酶和dNTPs购自天根生化科技(北京)有限公司.
　　UV-2100紫外可见分光光度计 , TG L-16G 台
式离心机 ,GL-20G-Ⅱ高速冷冻离心机 , WD9402基
因扩增仪 , UV-Ⅵ A 紫外反射透射仪.
1.3　方法
1.3.1　基因组 DNA 的提取及检测　材料采用随
机区组试验 ,播种于宁夏大学实验农场 ,各种质资源
苗期随机取样 30株 ,每株取等量叶片混合 ,采用
CTAB方法提取基因组 DNA [ 9-10] .方法如下:①剪
取新鲜嫩叶约 1 g ,放入预先冷却的研钵 ,倒入液氮
将其磨成细粉状;②将细粉全部转入 1.5 mL Ep-
pendorf 管中 , 加入预热 65 ℃的 CTAB 提取液
500μL ;③将离心管放入 65 ℃的水浴锅中水浴
30 min ,期间不时摇动离心管;④将离心管取出置于
冰浴中10min ,加入 Tris饱和酚-氯仿-异戊醇(体积
比为 25∶24∶1)500 μL ,反复轻轻摇动使其充分混
合;⑤将离心管放入 4 ℃高速低温离心机中 ,
12 000 r/min离心 10 min ,将上清液吸出;⑥在上清
液中加预冷的 2/3体积异丙醇和 1/10 体积乙酸钠
(pH=5.2),上下轻轻摇动 3 min 后 ,放入-20 ℃
冰箱冷冻 20 min ,12 000 r/min离心 10 min;⑦弃上
清液 ,将白色 DNA 转入另一个 1.5 mL Eppendo rf
管 ,加入φ=70%酒精漂洗 30 min ,再用无水乙醇脱
水 2 min;⑧晾干后加去离子超纯水 800μL ,混匀后
作为原液.
1.3.2　RAPD 反应体系和反应条件　反应体系
20μL ,即 10×Buffer 2μL ,2.5 U/μL Taq DNA 聚合
酶0.4μL ,15μmol /L 引物1μL ,0.3mmol/L dN TPs
1μL ,模板DNA 20 ng ,最后用双蒸水补充到20μL.反
应条件为 94 ℃预变性 2 min ,94 ℃变性 20 s ,34 ℃退
火30 s , 72 ℃延伸 1 min , 40 个循环后 , 72 ℃延伸
10min ,于 4 ℃存放.扩增产物在 w=1.0%琼脂糖凝
胶(含 50μg/mL EB)中电泳50 min ,在紫外反射透射
仪下观察并用数码相机拍照.
1.3.3　RAPD 引物筛选　将 100 条随机引物(10
碱基)用 2 份胡卢巴 DNA 作为模板逐一筛选 , 以
0 ,1统计 ,建立数据库 ,在相同迁移位置 ,有带的记为
1 ,无带的记为 0 ,记录下条带清晰 、有多态性的引物
序号.将该引物再重复一次 ,验证其可靠性 ,如果能
够清晰 、稳定重复出现多态性 ,记录下引物序号 、条
带总数 、多态性条带数 、在模板上的分布及分子量 ,
以备用于遗传多态性分析.
2　结果与分析
2.1　胡卢巴基因组 DNA 质量及含量
　　将 22份胡卢巴 DNA 用改良 CTAB法提取后 ,
取母液 5 μL , 在 w =0.8%的琼脂糖凝胶(含
50μg/mL EB)上电泳检测 DNA 提取效果.图 1中
点样孔附近是基因组 DNA ,条带均匀一致 、无拖尾 ,
靠近正极向为降解的蛋白质和 RNA ,表明 DNA 的
质量符合本试验所涉及的 RA PD引物扩增要求.
M -DNA Marker(2 000 bp);1～ 22-材料编号
图 1　22份胡卢巴基因组 DNA质量检测结果
　　取 1μL DNA原液 ,加入 1 mL 蒸馏水 ,在紫外
分光光度计下测定其在 260 , 280 , 230 nm 处的 D
值 ,并根据其在 260 nm 处的 D 值计算其含量(表
2).结果显示 , 各种质 DNA 的 D 260/D280 值在
1.813 ～ 1.968 ,进一步表明蛋白质等杂质去除较干
净 ,符合本试验所涉及的 RA PD引物扩增要求 ,原
液中 DNA 含量在 0.050 ～ 2.790 μg/μL ,试验时将
每份材料的 DNA 稀释成 10 ng/μL.
2.2　胡卢巴 RAPD引物筛选结果
　　对 100条随机引物逐一用 2份国内外地域差异
大的 DNA(编号 6和编号 21)进行筛选 ,结果 100
条随机引物中 89条引物都有扩增位点 ,占扩增引物
总数的 89%,每条引物可扩增出 1 ～ 8条带不等.其
中 ,16条引物在 2份 DNA 中能够清晰稳定地重复
表 2　胡卢巴基因组 DNA的含量
材料
编号 D260 D280 D230 D260/D280
DNA 含量/
(μg·μL -1)
材料
编号 D260 D280 D230 D260/D280
DNA 含量/
(μg ·μL -1)
1 0.033 0.017 0.004 1.941 0.050 12 1.172 0.597 0.347 1.963 1.758
2 0.160 0.084 0.026 1.905 0.240 13 0.489 0.252 0.197 1.940 0.978
3 0.131 0.070 0.026 1.871 0.197 14 0.914 0.465 0.313 1.966 1.828
4 0.219 0.115 0.039 1.904 0.329 15 0.630 0.324 0.201 1.944 1.260
5 0.174 0.096 0.061 1.813 0.348 16 1.245 0.640 0.342 1.945 2.490
6 0.636 0.328 0.266 1.939 1.272 17 0.911 0.463 0.332 1.968 1.822
7 0.259 0.139 0.106 1.863 0.518 18 0.800 0.407 0.273 1.966 1.600
8 0.280 0.151 0.111 1.854 0.560 19 0.524 0.280 0.059 1.871 1.048
9 0.273 0.144 0.112 1.896 0.546 20 0.865 0.450 0.319 1.922 1.730
10 0.411 0.218 0.085 1.885 0.617 21 0.663 0.339 0.244 1.956 1.326
11 1.860 0.954 0.475 1.950 2.790 22 0.680 0.357 0.148 1.905 1.360
270 宁夏大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　第 31卷　
出现带型上的差异.表 3是筛选出的 16条引物在 2
份模板 DNA 上的扩增结果 ,共扩增出 117条带 ,平
均每条引物能扩增出 7.31条带 ,其中 ,有多态性条
带 27条 ,平均筛选出的每条引物能扩增出 1.69 个
多态性位点;最多的一条引物(序号 27)能够在 2份
模板 DNA上扩增出 4 个多态性位点 ,有少数引物
(如序号 62)虽仅在 2份模板 DNA 上共扩增出 4条
带 ,但都能扩增出多态性位点 ,大多数引物模板扩增
1 ～ 2个多态性位点;16条引物的多态性条带在 2份
模板 DNA 上分布 ,分别占 40.7%,59.3%,比例为
1∶1.46 ,整个扩增的 DNA 条带分子量在 200 ～
2 000 bp ,图 2是部分引物在 2份模板 DNA 上的初
筛结果 ,图 3是 16条多态性引物的复选结果 ,其复
选结果与初选结果的清晰度 、条带数目 、多态性条带
分布以及在 2份模板上的分布一致.
表 3　16 条引物序列及其在 2 份胡卢巴 DNA上的扩增结果
引　物
序号 序列 5′-3′
多态性数目
编号 6 编号 21
扩增总条
带数
引　物
序号 序列 5′-3′
多态性数目
编号 6 编号 21
扩增总条
带数
3 AA TCGGGCTG 1 0 7 40 GTCCCGTGGT 1 0 5
5 CAATCGCCGT 0 1 9 47 TCGCCGCAAA 0 1 11
6 CAGCACCCAC 0 2 10 57 CTGCGCTGGA 0 1 5
7 CAAACGTCGG 0 2 6 61 AGAGCCGTCA 1 0 7
10 TGCGCCCT TC 1 1 8 62 CTCAGTCGCA 0 2 4
12 CCACAGCAGT 1 1 6 69 AAGTGCACGG 1 1 8
27 ACGCATCGCA 3 1 8 79 GATGCGATGG 1 0 5
28 CTGCATCGTG 1 2 9 97 TGTCGTGGTC 0 1 9
总计 11 16 117
M-DNA Marker(2000 bp);其余为引物序号图 2　RAPD引物在 2份胡卢巴模板 DNA上的初选结果
M-DNA Marker(2000 bp);其余为引物序号图 3　RAPD引物在 2份胡卢巴模板 DNA上的复选结果
3　讨论
　　RAPD技术相对于其他分子标记 ,需要的模板
DNA 量极少 ,实验设备和操作简单 ,费用较低 ,且检
测快速 、灵敏度高 、无放射性 ,因其特有的优点而被
广泛应用.但由于该技术自身的明显缺陷 ,如 RAPD
标记为显性标记 ,不能判断检测到的多态 DNA 片
段为纯合子还是杂合子 ,引物的碱基数目少 , PCR
反应的退火温度低 ,碱基错配几率大 ,重复性和稳定
性差 ,这些不足都大大降低了 RAPD 标记的可行
性.影响 RAPD 分析技术稳定性的原因是多方面
的 ,如反应体系中 Taq DNA 聚合酶用量 、引物浓
度 、Mg2+含量 、dN TPs浓度 、模板 DNA 用量 ,反应
条件中退火温度 、循环数 、扩增时间 ,以及实验室条
件和操作者的能力等.
　　RAPD标记对反应体系以及外界条件的变化非
常敏感 ,所以在整个反应过程中首先要保证模板
DNA 的质量 ,同时 ,有效地解决稳定性也是 RAPD
能否成功的一个核心问题.有报道称 RAPD的重复
性较差 , RAPD所用引物序列是随机的 ,检测到的
基因组位点不清晰.因此 ,有学者在不同的植物 、同
一植物的不同器官上采用不同的 DNA 提取方法 、
优化反应体系和反应条件 ,目的就是用高质量的
DNA 来提高试验效率 ,使扩增结果更加稳定 、重复
性更好.TaqDNA 聚合酶浓度是 PCR反应中最为重
要的因子 , TaqDNA 聚合酶特别依赖于 Buf fer 中的
Mg 2+ ,Mg2+是影响扩增特异性的主要因素之一 ,
Mg 2+浓度高易产生特异性产物 ,浓度过低则会使
TaqDN A 聚合酶失活 , 扩增不到产物或产物量很
少;dNT Ps浓度 、引物浓度及模板 DNA用量决定扩
增条带的数目和亮度 , dN TPs浓度和引物浓度对扩
增特异性有很大影响;退火温度的高低对特异性条
带有很大影响 ,一般情况下 ,退火温度越高条带数越
少 ,而条带的特异性增强.此外 , RA PD标记在具体
271　第 3期　　　　　　　 王掌军等:胡卢巴基因组 DNA 提取及 RAPD引物筛选
领域应用时 ,要用大量的 RAPD 引物进行试验 ,从
中筛选出多态性丰富 、检测效率高的引物.
　　本试验采用 CTAB 法提取了 22份胡卢巴基因组
DNA ,DNA含量测定结果表明 ,各种 DNA的D260/D280
值在 1.813～ 1.968 ,表明蛋白质等杂质去除较干净 ,原
液中 DNA含量在0.050 ～ 2.790μg/μL ,其纯度和浓度
均符合本试验中 RAPD扩增要求.研究表明 ,如果
RAPD反应体系和反应条件一致 ,则试验的重复性很
好.同时 ,利用来源地域差异较大的 2份模板 DNA 对
100条随机引物进行逐一筛选 ,其中 ,16条引物在 2份
模板 DNA中均能够清晰 、稳定重复出现多态性位点 ,
共扩增出 117条带 ,有多态性条带 27条 ,为下一步胡卢
巴遗传多样性分析提供了分子依据.
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Genomic DNA Extraction and RAPD Primers Screening of
Trigonella f oenum-graecum Linn
Wang Zhang jun , Liu Ping
(Schoo l o f Ag riculture , Ningxia Univer sity , Yinchuan 750021 , China)
Abstract:Improved CTAB method is used to ext ract genomic DNA from leaves of T .Linn , and the quality
and content of DNA are detected , the 100 random 10-base primers are screened based on the optimal RAPD
reaction sy stem .The results show that the good quali ty DNA could be obtained , which fit ted fo r RAPD
analyzing.A t the same time ,16 random 10-base primers have higher polymorphic in T .foenum-graecum ,
which could be used in the genetic dive rsity research.
Key words:T.foenum-graecum ;genomic DNA;RAPD;primer screening
(责任编辑 、校对　李　琼)
272 宁夏大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　第 31卷