全 文 ：火焰兰属SRAP-PCR体系的建立优化及验证
姚 婧1， 唐燕琼1， 黄明忠2， 丁亚操1， 杨光穗2
（1.海南大学农学院，海南 海口 570228；2.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南 儋州 571737）
摘 要：为建立火焰兰 SRAP-PCR 体系，采用 U20(55)均匀试验设计，以 10 份火焰兰种质基因组 DNA 为模板，用
3对 SRAP引物对 DNA模板、Mg2+、引物、Taq DNA聚合酶和 dNTPs等 5 个因素的浓度进行优化组合和验证。 结果表
明，提取的火焰兰基因组 DNA 纯度高、完整性好；利用引物对 Me6/Em6 进行 PCR 扩增，对 20 个处理初步筛选出扩
增条带较清晰，多态性丰富的处理，再用 2 个 DNA 模板进行复筛，获得最佳反应体系（20 μL）：模板 DNA 60 ng、Mg2+
2.0 mmol/L、引物 1.0 μmol/L、Taq DNA聚合酶 1.2 U、dNTPs 0.20 mmol/L。 最后用 2对引物、8份火焰兰种质来验证优
化 SRAP-PCR 体系，其所获条带清晰，多态性丰富。
关键词：火焰兰； SRAP-PCR； 体系优化
中图分类号：S682.31 文献标识码：A 文章编号：1004-874X（2014）20-0141-04
Optimization and verification for SRAP - PCR
system in Renanthera Loureiro
YAO Jing1, TANG Yan-qiong1, HUANG Ming-zhong2, Ding Ya-cao1, YANG Guang-sui2
（1.College of Agriculture, Hainan University, Haikou 570228, China; 2.Tropical Crops Genetic Resources
Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou 571737, China）
Abstract: In order to optimize SRAP-PCR reaction system for Renanthera Loureiro, the U20(55) uniform experimental
design was applied to optimize concentration of DNA template, Mg2+, primers, Taq DNA polymerase and dNTPs. Then the
system was verified with 10 R. germplasm genome DNA as template and three pairs of SRAP primers. The results showed
that the extraction of genomic DNA was of high purity and had good integrity; The bands of 20 treatments amplifing with
Me6/Em6 primers, were clear, polymorphic processing of rich; Further screening using 2 DNA template for getting, the best
system was the total volume of 20 μL reaction solution containing 60 ng genomic templates DNA, 2.0 mmol/L Mg2+, 1.0
μmol/L Primers, 1.2 U Taq DNA polymerase, 0.20 mmol/L dNTP. The bands obtained in the verification experiment were
clear and highly polymorphic.
Key words: Renanthera Loureiro; SRAP-PCR; system optimization
火焰兰属 （Renanthera Loureiro） 植物为兰科
（Orchidaceae）多年生附生或半附生草本，单轴茎，生长
旺盛，大型圆锥花序，着花多朵，多红色或橙黄色 [1]，鲜
亮艳丽，可广泛用于切花、立篱、布景和制作盆栽等，具
有极高的园艺应用价值。 火焰兰具有很高的杂交亲和
性，常作为兰科植物杂交的亲本，是一种重要的育种材
料[2]。 分子标记因不受环境条件的影响，常应用于种质
资源遗传多样性分析。 目前火焰兰分子生物学领域的
研究主要是采用 RAPD、ISSR 等标记技术对火焰兰的
杂交后代进行鉴定与评价 [3]。 SRAP （sequence-related
amplified polymorphism） 分子标记技术是 2001 年由 Li
等[4]开发出来的一种基于 PCR 的新型标记技术。 该标
记具备 RFLP、RAPD 等分子标记的优点， 操作简便、快
速，多态性丰富，重复性好，不需预知物种序列信息以
及成本较低，目前广泛应用于遗传多样性分析 [5-6]、亲缘
关系分析[7]、遗传图谱构建[8]等诸多领域。 目前国内外尚
未见有关 SRAP 标记在火焰兰植物中的应用。 本研究
拟构建火焰兰 SRAP-PCR 体系， 为今后 SRAP 分子标
记技术运用于火焰兰遗传多样性评价、种质资源鉴定、
遗传图谱构建、QTL 定位及亲缘关系分析等方面的研
究提供较为可靠的技术支持。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验所用的 10 份火焰兰种质（表 1）均取自中国热
收稿日期：2014-06-23
基金项目：教育部热带作物新品种选育工程中心与作物学重
点学科联合资助项目（lhxm-2013-7）；中国热科院热带作物品种
资源研究所基本科研业务费专项重点项目（1630032013035）
作者简介：姚婧（1990-），女，在读硕士生，E-mail:yaoyao.90
06@163.com
通讯作者：唐燕琼（1968-），女，博士，教授，E-mail:tyq68@
126.com
广东农业科学 2014 年第 20期 141
C M Y K
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2014.20.030
来源
新加坡
新加坡
云南
新加坡
新加坡
新加坡
新加坡
新加坡
新加坡
海南
品种名
Renanthera coccinea vietnam
Renanthera isosepala
Renanthera imschootiana
Renanthera monachica
Renanthera della
Renanthera matutina
Renanthera vietnamensis
Renanthera storei
Renanthera elongata
Renanthera coccinea
材料编号
R3
R6
R9
R14
R19
R20
R21
R25
R30
R34
序号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
表 1 SRAP-PCR 体系优化试验材料
引物浓度
（μmol/L）
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Taq DNA
聚合酶（U）
0.6
0.9
1.2
1.5
1.8
dNTP 浓度
（mmol/L）
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
Mg2+浓度
（mmol/L）
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
DNA
（ng）
15
30
45
60
75
水平
1
2
3
4
5
表 2 均匀试验设计因素水平表
因素
引物浓度
（μmol/L）
1.0
0.8
0.8
1.2
0.4
1.0
0.6
0.8
1.0
0.4
1.2
0.8
0.6
1.2
0.6
0.4
0.6
1.0
0.4
1.2
Taq DNA
聚合酶（U）
0.6
1.8
0.9
0.9
1.2
1.8
1.5
0.9
1.2
1.8
0.6
1.2
1.2
1.5
0.6
0.6
1.5
1.8
0.9
1.5
dNTP 浓度
（mmol/L）
0.20
0.15
0.15
0.10
0.10
0.25
0.15
0.25
0.20
0.25
0.25
0.30
0.30
0.15
0.10
0.30
0.20
0.10
0.20
0.30
Mg2+浓度
（mmol/L）
2.0
0.5
1.5
1.0
0.5
1.0
2.0
2.0
2.0
2.5
0.5
2.5
0.5
2.5
2.5
1.5
1.0
1.5
1.0
1.5
DNA
（ng）
15
75
30
60
15
15
45
45
60
60
45
15
60
30
75
30
30
45
75
75
处理
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
表 3 SRAP-PCR 均匀设计 U20(55)
因素
带农业科学院热带作物品种与资源研究所热带兰野生
种质资源圃。 其中 R14 和 R34 用于体系优化，其他种
质均用于体系验证。
SRAP 引物由上海生工生物技术有限公司合成，
PCR 试剂 EasyTaq R DNA Polymerase for PAGE，10 ×
EasyTaq R Buffer for PAGE，2.5 mmol/L dNTPs，6×DNA
Loading Buffer 购自北京全式金生物技术有限公司 ，
DNA marker购自南京 TaKaRa公司。
1.2 试验方法
1.2.1 基因组 DNA 的提取和检测 以火焰兰嫩叶为
材料 ，参照黄明忠 [9]的改良 CTAB 法略作改进提取
DNA。 将提取的基因组 DNA 溶于 TE 缓冲液中 ，用
Nandodrop 2000 分光光度计和 1%的琼脂糖凝胶电泳
检测 DNA 质量和浓度。 检测后的 DNA 母液贮存于
-20℃冰箱内，稀释为 50 ng/μL 的工作液于 4℃保存备
用。
1.2.2 PCR 反应体系的均匀试验设计 采用 U20(55)
的均匀设计， 对 SRAP-PCR 反应体系的 5 因素（DNA
模板、Mg2+、引物、TaqDNA 聚合酶和 dNTPs）5 水平（表
2）进行初步筛选，共 20 个处理（表 3），2 次重复。 对试
验结果进行分析，初步筛选出特异性强、敏感度高的处
理。 再用 2 份火焰兰种质的 DNA 为模板，以这些筛选
出的处理进行最佳体系筛选，2次重复， 以获得特异性
强、重复性好、稳定性高的体系组合。
1.2.3 PCR 反应条件 根据表 2 制备总体积为 20 μL
的 PCR 体系，DNA为 R34 种质， 每处理体系中还添加
了 2 μL 10 ×PCR buffer， 引 物 组 合 为 Me6
（TGAGTCCAAACCGGTAG）/Em6(GACTGCGTACGAAT
TGCA )。 反应程序为：94℃预变性 5 min，反应前 5个循
环在 94℃ 1 min、35℃ 1 min、72℃ 1 min 条件下运行；
随后的 35个循环退火温度提高到 50℃，最后 72℃延伸
10 min，4℃保存。 扩增反应在 Biometra Tgradient PCR
仪上进行，扩增产物取 6 μL，用 8%非变性聚丙烯酰胺
凝胶电泳，银染法染色。
1.2.4 反应体系稳定性验证 运用优化好的火焰兰
SRAP-PCR 体系，随机选取 Me4（TGAGTCCAAACCGG
ACC）/Em7（GACTGCGTACGAATTATG）和 Me1（TGAGT
CCAAACCGGATA ） / Em5 （GACTGCGTACGAATTAAC ）
等 2 对引物组合， 对 8 份火焰兰种质进行扩增从而检
测体系的稳定性。
2 结果与分析
2.1 DNA电泳检测结果
从 DNA 电泳检测图看，点样孔较干净、条带清晰
整齐，无降解拖尾现象（图 1）。 检测得到所提取 DNA
的 OD260/OD280 值在 1.8~1.97 之间 ， 平均质量浓度为
566.4 ng/μL。 可见所提取的 DNA纯度高，完整性好，可
以用于后续试验。
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C M Y K
M 为 100bp DNA Ladder;1~20 为表 3 对应的 20 个体系组合；
引物：Me6/Em6 组合
图 2 SRAP-PCR 均匀设计体系扩增结果
M 为 DL2000 marker；1~6 为表 1 对应的火焰兰种质 DNA
图 1 部分火焰兰 DNA 电泳检测结果
2.2 PCR体系构建及优化结果分析
火焰兰均匀试验的 20 个处理的 SRAP 扩增效果
如图 2 所示，处理 8、9、11 扩增出的条带均清晰、扩增
条带数较多、特异性较好，但重复性不够好，稳定性不
高； 处理 13、16、17、19、20 所扩增出的条带较为清晰，
重复性好，稳定性高，但是所扩增出的条带数较少，特
异性不够强。 处理 3、6、7、10、18基本没有扩增出条带，
并且 6、10、18号处理的 Taq DNA聚合酶均为 1.8 U，说
明 Taq DNA 聚合酶浓度的过高并不一定有利于 PCR
扩增。 为筛选出特异性强，多态性丰富，重复性好，稳定
性高的最佳反应体系， 有必要对初筛选出的 8 个处理
（8、9、11、13、16、17、19、20）进一步优化。 用 R14 和 R34 种质的 DNA 进行 8 个处理的 PCR
扩增，效果如图 3所示。 其中处理 9扩增出的条带清晰
且较多，重复性也较好，稳定性高。其次为处理 13，扩增
出的条带重复性好，稳定性高，但是条带数量不及处理
9。因此，处理 9为试验最佳反应体系。在处理 9和处理
13 中，DNA 用量均为 60 ng，Taq DNA 聚合酶为 1.2 U，
而 Mg2+、dNTP和引物浓度处于不同的水平。 表明 DNA
浓度和 Taq DNA 聚合酶可能为影响 SRAP-PCR 的关
键因子， 当 DNA 用量为 60 ng、Taq DNA 聚合酶为 1.2
U 时体系扩增效果好， 特异谱带多态性高， 背景干扰
低，主带清晰、副带明显，重复性好，稳定性高。
M 为 100bp DNA Ladder；8、9、11、13、16、17、19、20 为表 3 对应的处理，
a、b 分别为 R14、R34 种质 DNA；引物对：Me6/Em
图 3 SRAP-PCR 反应体系复筛试验扩增结果
2.3 PCR反应体系的验证
应用筛选出的最佳体系（20 μL）：DNA 60 ng、Mg2+
2.0 mmol/L、 引物 1.0 μmol/L、TaqDNA 聚合酶 1.2 U、
dNTPs 0.20 mmol/L， 随机筛选过的引物组合 Me4/Em7
和 Me1/Em5， 对 8 份种质进行 SRAP 扩增。 扩增结果
（图 4）显示条带清晰、特异性强、多态性好、稳定性高，
表明所建立的反应体系适合火焰兰 SRAP 标记的分子
遗传学研究。
3 讨论
SRAP 是一种基于 PCR 的标记， 它独特的引物设
计使其可检测基因的可阅读框（ORF）区域，是一种无
需任何序列信息即可直接进行 PCR扩增的分子标记技
术[3]，目前广泛应用于多种植物的分子生物学研究。 刘
雅辉等[10]采用 SRAP分子标记对 26 份棉花耐盐相关种
质进行遗传多样性研究，李朋飞等[11]用 SRAP 标记对西
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M 为 100bp DNA Ladder；R3、R6、R9、R13、R20、R21、R22、
为表 1 对应的火焰兰种质
图 4 优化的 SRAP-PCR 反应体系对验证材料的扩增结果
瓜种质资源进行评价。
SRAP-PCR 体系中的 DNA 模板、Mg2+、 引物、Taq
DNA 聚合酶和 dNTPs 等 5 个因子之间相互作用共同
影响着 PCR过程。 引物与模板结合后在 Taq酶作用下
进行延伸，Taq DNA 聚合酶用量过大会造成浪费，并且
会导致非特异性带产生；用量过小会影响扩增效率，降
低扩增产物的产量[12]。 Mg2+是 Taq 酶的激活剂，其浓度
不仅影响酶的活性，而且还会影响模板与 PCR 产物的
解链稳定性、引物与模板的结合效率、产物的特异性和
引物二聚体的形成等 [13]。 dNTPs 作为 PCR 中 Taq DNA
聚合酶提供底物，使得产物得以延伸，其浓度直接影响
PCR 产物形成 [14]。 因此对 5 个因子进行筛选从而获得
最佳 SRAP-PCR 体系具有重大意义。
均匀设计是由中国科学院应用数学所方开泰教授
和王元院士于 1978 年提出的一种试验设计方法，其主
要的优点是针对多因素多水平试验用最少的试验得到
最充分系统信息[15-17]。李颖等[18]通过苍耳 SRAP-PCR 体
系优化正交试验设计和均匀试验设计方案比较发现，2
种设计均可用于 SRAP 体系优化但均匀设计优化的体
系扩增效果更理想更可靠。
本研究采用均匀试验设计， 避免了单因子试验无
法考虑因子间互作的不足以及正交试验设计试验次数
繁多的缺点，并发现 DNA浓度和 Taq DNA聚合酶可能
为影响 SRAP-PCR 的关键因子。当火焰兰 DNA模板用
量为 60 ng、Taq DNA 聚合酶为 1.2U 时的体系扩增效
果好，与王志勇等 [19]构建狗牙根 SRAP-PCR 体系时发
现 Taq DNA聚合酶为关键因子的结论相同。 本研究首
次建立并验证了火焰兰 SRAP-PCR 反应体系 （20 μL）
为：模板 DNA 60ng、Mg2+ 2.0 mmol/L、引物 1.0 μmol/L、
TaqDNA 聚合酶 1.2 U、dNTPs 0.20 mmol/L。 这将为
SRAP 分子标记技术在火焰兰的遗传多样性、 种质鉴
定、遗传图谱构建等方面的研究奠定了基础。
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（责任编辑 崔建勋）
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