全 文 ：第 34 卷第 2 期
2015 年 6 月
武 汉 轻 工 大 学 学 报
Journal of Wuhan Polytechnic University
Vol． 34No． 2
Jun． 2015
文章编号:2095-7386(2015)02-0014-06
DOI:10． 3969 / j． issn． 2095-7386． 2015． 02． 004
珍稀药用植物竹节参 SＲAP-PCＲ
反应体系的构建与优化
宋 佳，张绍鹏，孙 巧，李天佩，曾万勇，陈 平
(武汉轻工大学 生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023 )
摘 要:人参属重要的药用植物竹节参(Panax japonicus C． A． Mey)野生资源已近濒危，开展
其遗传多样性研究对于资源保护和可持续利用具有重要意义。研究构建并优化了竹节参
DNA的 SＲAP-PCＲ扩增体系。以竹节参根茎为材料，对 PCＲ反应体系中的 dNTPs、DNA模板、
引物、Taq DNA聚合酶浓度和复性第二阶段的退火温度等条件进行探索和研究，得到了能稳定
扩增竹节参基因组的最佳反应体系(25μl):DNA 40ng，dNTPs 0． 2 mmol /L，Primer 0． 36μmol /
L，10 × PCＲ Buffer 2． 5 ul，Taq DNA polymerase 2U，退火温度 50℃。进一步检测了随机组合的
24 对引物，进行扩增，得到了 2 对带型清楚、重复性较好的引物 Me1 /Em5 和 Me3 /Em1。以这
2 对引物对 10 个不同产地竹节参 DNA 样品进行 SＲAP-PCＲ 扩增。产物的电泳图谱表明，竹
节参不同产地的 DNA谱带多态性丰富，带型清晰，重复性好。说明建立的该 SＲAP-PCＲ 反应
体系稳定可靠，为利用 SＲAP分子标记技术研究竹节参的植物遗传多样性奠定了工作基础。
关键词:竹节参;SＲAP-PCＲ反应体系;构建;优化
中图分类号:Q 949． 95;TQ 460． 6 文献标识码:A
收稿日期:2015-01-23．
作者简介:宋佳(1989-)，女，硕士研究生，E-mail:1944136718@ qq． com．
通信作者:陈平(1958-)，女，教授，E-mail:chenpingvip24@ 163． com．
基金项目:国家自然科学基金项目(81274023);湖北省教育厅科学研究青年项目(Q20141704)．
Optimization by SＲAP-PCＲ reaction system in rare
medicinal herb Panax japonicus C． A． Mey
SONG Jia，ZHANG Shao-Peng，SUN Qiao，LI Tian-Pei，ZENG Wan-Yong，CHEN Ping
(School of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China)
Abstract:Panax japonicus C． A． Mey，an important medicinal herb，its wild resources are becoming endangered．
Genetic diversity research of P． japonicas is significant for the conservation and sustainable utilization of these re-
sources． In this study，optimum SＲAP-PCＲ reaction system for P． japonicus DNA was constructed for the first
time． The DNA of rhizome in P． japoncius was abstracted as PCＲ template． And，the concentration gradient of
dNTPs，primer，DNA and Taq polymerase and Tmwere assessed respectively to optimize SＲAP-PCＲ reaction sys-
tem． An optimal and stable SＲAP-PCＲ system for P． japonicus(Total of 25 μl)was as follows:DNA 40 ng，dNTPs
0． 2 mmol /L，primer 0． 36 umol /L，10 × PCＲ Buffer 2． 5 μl，Taq polymerase 2U，Tm 50． Then，24 random prim-
ers were chosen for further test． 2 couple of primers，Me1 /Em5 and Me3 /Em1，which can get clear and repeatable
bands，were obtained after PCＲ． Finally，10 different P． japonicus DNA samples were used to test this method u-
2 期 宋佳，张绍鹏，孙巧，等:珍稀药用植物竹节参 SＲAP-PCＲ反应体系的构建与优化
sing these 2 primers，which showed that rich polymorphism among P． japoncius plants from different area． Thus，
this stable and suitable SＲAP-PCＲ system can be used as an important method of molecular markers analysis for
Panax plants genetic diversity studying．
Key words:Panax japonicus;SＲAP -PCＲ ;construction;optimization
1 引言
近年来，AFLP、ＲAPD、ISSＲ 等分子标记技术逐
渐应用到药用植物的研究领域，已成为目前中药资
源系统研究的重要手段和方法，在人参属植物如三
七［1］、人参［2-3］、西洋参［4-5］的遗传多样性研究方面
目前已经取得了重要的研究进展。由 Li 和 Qui-
ros［6］开发的一种新型分子标记技术———标记序列
相关扩增多态性(sequence-related amplified polymor-
phism，SＲAP)因其具有简单、高效、多态性丰富、重
复性好、高共显性、易测序且不需预知物种基因序列
信息等优点，已逐步被国内外学者应用于苹果［7］、
马铃薯［8］、油菜［9］等果蔬的遗传多样性分析、遗传
图谱构建［10］、种质资源鉴定评价［11］，重要性状基因
标记［12］等研究。该标记根据基因启动子、内含子中
AT含量丰富及外显子中 GC 含量丰富的特点设计
引物，对基因开放读码框(OＲFs)进行 PCＲ扩增，因
不同个体间启动子、内含子与间隔区的长度不同而
产生多态性，被认为是研究群体遗传变异最好的标
记之一［13］，目前 SＲAP标记在竹节参的研究中尚未
见有相关报道。构建竹节参基因组 DNA 的 SＲAP-
PCＲ的优化反应体系，为竹节参遗传图谱的构建、
遗传多样性分析研究奠定基础。
竹节参(Panax japonicas C． A． Mey)为五加科人
参属多年生草本植物，以干燥根茎入药［14］。其又称
竹节人参、竹根七、竹节三七、白三七、大叶三七、北
三七，主产于湖北、四川、云南、贵州等地，有止血生
肌、散瘀止痛、舒筋活络、滋补强壮等功效［15］。它兼
具我国北药人参和南药三七的功用，被民间誉为
“草药之王”，为我国珍稀中药材资源［16］。野生竹节
参资源目前已处于濒危状态，经过多年的研究，在竹
节参的植物分类［17］、化学成分研究［18-20］、临床应用
研究等方面取得了一定的进展［21-23］。在其药用植
物的生长发育、遗传多样性评估、品种鉴定及植物系
统分类等方面的研究目前尚处于起步阶段，本课题
组在前期竹节参转录组测序研究的基础上，利用单
因素分析法［24］首次构建并优化了竹节参 SＲAP-
PCＲ反应体系。以竹节参(Panax japonicus C． A．
Mey)为材料，对 PCＲ 反应体系中的 dNTPs、DNA 模
板、引物、Taq DNA聚合酶浓度和复性第二阶段的退
火温度等条件进行梯度实验，构建并优化了竹节参
SＲAP-PCＲ 反应体系，为进一步开展竹节参的遗传
多样性、种质资源研究和遗传连锁图构建等系统研
究提供技术基础。
2 材料与方法
2． 1 材料
供试材料为竹节参(Panax japonicas C． A． Mey)
的根茎，不同产地竹节参的材料见表 1。
表 1 竹节参样品
编号 产地 编号 产地
1 湖北恩施华中药用植物园 6 云南丽江
2 湖北宣恩 7 贵州玉舍
3 湖南八大山公 8 四川洪雅高庙
4 广西融水 9 贵州雷公山
5 湖北七姊妹山 10 四川龙池
2． 2 主要试剂
Taq DNA聚合酶、dNTP Mixture、10 × PCＲ Buff-
er、DL10000 DNA Marker(武汉生物工程技术服务有
限公司)，SＲAP标记引物来自 Li 和 Quiros［6］(所选
引物序列见表 2，由上海桑尼生物科技有限公司合
成，稀释 10umol /L 备用)，琼脂糖(Biosharp)，CTAB
(Amresco)，无水乙醇、氯仿(国药集团化学试剂有
限公司)等。
表 2 SＲAP引物序列
引物 正向引物序列(5’-3’)引物 反向引物序列(5’-3’)
Me1 TGAGTCCAAACCGGATA Em1 GACTGCGTACGAATTAAT
Me2 TGAGTCCAAACCGGAGC Em2 GACTGCGTACGAATTTGC
Me3 TGAGTCCAAACCGGATT Em3 GACTGCGTACGAATTGAC
Me4 TGAGTCCAAACCGGAGC Em4 GACTGCGTACGAATTAAT
Me5 TGAGTCCAAACCGGTCC Em5 GACTGCGTACGAATTCAA
Me6 TGAGTCCAAACCGGACC Em6 GACTGCGTACGAATTGCA
Me7 TGAGTCCAAACCGGAAG Em7 GACTGCGTACGAATTCTG
Me8 TGAGTCCAAACCGGTAA Em8 GACTGCGTACGAATTCGA
Me9 TGAGTCCAAACCGGTGC Em9 GACTGCGTACGAATTCAG
Me10 TGAGTCCAAACCGGTCA Em10 GACTGCGTACGAATTCCA
2． 3 竹节参基因组 DNA的提取与检测
切取一小块(0． 2 g)竹节参样品的最嫩部位，采
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武 汉 轻 工 大 学 学 报 2015 年
用改良的 CTAB法［25］提取各样品基因组 DNA。用液
氮将样品研磨至粉末，放入到加有 CTAB提取缓冲液
(100 mmol /L Tris-HCl pH 8． 0，1． 4 mol /L NaCl，
20 mmol /L EDTA pH 8． 0，2% CTAB，1%PVP K-40，
1%β-巯基乙醇)中，65℃水浴 1h，每 10min 轻轻摇晃
一次，加入氯仿 400ul，混匀后静置 2-3min，15℃，12
000r /min 离心 10min，轻轻吸取上清液 400ul，加入等
体积的异戊醇:氯仿(1:24)，4℃，12 000r /min 离心
10min，轻轻吸取上清液 450ul，加入 2． 5 倍体积的无
水乙醇，4℃，12 000r /min 离心 20min，弃上清，得到
DNA沉淀物。经室温干燥后，加入 30ul ddH2O 充分
溶解。利用紫外分光光度计(PE Lambda25)和 1%的
琼脂糖凝胶检测其浓度和质量。
2． 4 SＲAP-PCＲ反应体系优化
基础扩增反应体系(25 μl):模板 l μl (50 ng /
μl)，10 × Buffer 2． 5 μl，dNTP Mixture (10 mmol /L)
0． 3 μl，正反引物各 5 μl (1． 5 μmol /L)，Taq酶 0． 4
μl (5 U /μl)，剩余用 ddH2 O 补足。采用单因素分
析法，设定 dNTPs、DNA 模板、引物、Taq DNA 聚合
酶浓度和复性第二阶段的退火温度 5 个参数。在反
应体系中其他成分不变的情况下，将每个参数设置
5 个梯度(表 3)。
2． 5 SＲAP-PCＲ扩增体系
SＲAP-PCＲ反应采用复性变温法，扩增反应程
序如下:预变性 94 ℃5 min;前 5 个循环变性 94 ℃1
min，退火 35 ℃ 1 min，延伸 72℃ 1． 5 min;后 35 个
循环变性 94℃ 1 min，退火 50 ℃［6］，1 min，延伸 72
℃ 1． 5 min;最后延伸 72 ℃ 5 min。
2． 6 SＲAP-PCＲ引物的筛选
以 1 号竹节参 DNA为模板，进行 SＲAP-PCＲ反
应引物的筛选。正反引物各 10 个，随机组合挑选
24 对，进行 PCＲ 扩增，产物用 1%琼脂糖凝胶电泳
检测(表 3)。
表 3 竹节参 SＲAP-PCＲ反应体系参数
水平
参数
Taq酶
/U
dNTP
/mmol·L －1
引物
/umol·L －1
模板
/ng
退火温度
/℃
1 1． 0 0． 1 0． 12 5 46
2 2． 0 0． 2 0． 24 10 48
3 3． 0 0． 4 0． 36 20 50
4 4． 0 0． 6 0． 48 40 52
5 5． 0 0． 8 0． 60 80 54
3 结果与分析
3． 1 引物筛选结果
将正向引物和反向引物随机组合成引物对，采
用 SＲAP-PCＲ初始反应程序进行引物筛选，扩增结
果见图 1。实验结果表明 4 号(Me1 /Em3)，7 号
(Me1 /Em5)，12 号(Me3 /Em1)，13 号(Me8 /Em1)，
20 号(Me7 /Em8)，23 号(Me7 /Em10)这 6 对引物能
扩增出清楚、重复性较好的带型。经过多次重复试
验后，最终确定选用 Me1 /Em5 作为固定引物进行各
因素优化实验。
图 1 24 对引物 SＲAP-PCＲ扩增结果
3． 2 SＲAP-PCＲ优化结果
3． 2． 1 dNTPs浓度对 SＲAP-PCＲ扩增的影响
dNTPs 是合成 DNA 链的原料，其浓度是影响
PCＲ反应的决定性因素之一。图 2 中结果表明，当
dNTPs浓度为 0． 1—0． 8 mmol /L 时，都能扩增出条
带，但浓度为 0． 8 mmol /L时，扩增产物的谱带较弱;
浓度为在 0． 6 mmol /L 时，扩增产物谱带不太稳定。
故 dNTPs浓度在 0． 1—0． 4 mmol /L时效果最好。
图 2 不同 dNTPs浓度 SＲAP-PCＲ扩增结果
3． 2． 2 引物浓度对 SＲAP-PCＲ扩增的影响
引物浓度过高会导致非特异性扩增和引物二聚
体的形成，过低则 PCＲ 产量受到影响。由图 3 可
知，当引物浓度为 0． 12 umol /L时，扩增产物电泳条
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2 期 宋佳，张绍鹏，孙巧，等:珍稀药用植物竹节参 SＲAP-PCＲ反应体系的构建与优化
图 3 不同引物浓度 SＲAP-PCＲ扩增结果
带不清晰;随着引物浓度的增加，扩增条带逐渐清
晰，在 0． 24—0． 60 umol /L 时，谱带清晰且稳定，确
定竹节参 SＲAP扩增最优引物浓度为 0． 36umol /L。
3． 2． 3 DNA模板量对 SＲAP-PCＲ扩增的影响
高质量的模板也是 PCＲ 扩增的关键因素。由
图 4 可知，当模板 DNA用量为 5 或 10 ng时，扩增的
谱带较暗;而为 20 或 40 ng 时，扩增的谱带主带最
清晰;当模板 DNA 用量为 20—80 ng 时，条带稳定
且亮度基本保持不变，说明 SＲAP 对竹节参模板
DNA 浓度适应范围比较广，本试验确定竹节参
SＲAP扩增模板 DNA浓度为 40 ng。
图 4 不同 DNA模板浓度 SＲAP-PCＲ扩增结果
3． 2． 4 Taq酶对 SＲAP-PCＲ扩增的影响
Taq酶的用量对 PCＲ扩增效率有着显著影响。若
浓度过低，扩增产物量降低;浓度过高，非特异性扩增
几率增大。由图 5可知，Taq DNA聚合酶为 1． 0 U时，
扩增的条带较少;用量为3． 0—5． 0 U时，条带清楚但易
产生非特异性条带;综合考虑，本试验确定竹节参
SＲAP扩增的 Taq DNA聚合酶适宜用量为 2． 0 U。
图 5 不同 Taq酶浓度 SＲAP-PCＲ扩增结果
3． 2． 5 退火温度对 SＲAP-PCＲ扩增的影响
退火温度对 PCＲ 扩增结果有着至关重要的影
响。退火温度过低，会导致反应结果中出现大量非
特异性结合条带;退火温度过高，虽然特异性会好一
些，但是扩增效率会降低，所以对退火温度的筛选是
很有必要的。如图 6 所示，本实验确定当退火温度
为 50℃时较为适宜，产物有较清晰条带。
图 6 不同退火温度 SＲAP-PCＲ扩增结果
3． 3 竹节参 SＲAP-PCＲ 反应体系的确立和稳定性
检测
考虑到试验结果的稳定性和降低试验成本等因
素，我们最终确定竹节参 SＲAP 标记最优扩增反应
体系(25 μl):DNA模板 1 μl (40 ng /μl)，10 × Buff-
er 2． 5 μl，dNTP Mixture 0． 4 μl (10 mmol /L)，引物 6
μl (1． 5 μmol /L)，Taq 酶 0． 4 μl (5 U /μl)，退火温
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度 50℃，剩余用 ddH2O补足。
利用上述最优扩增反应体系，选取引物组合
Me1 /Em5 和 Me3 /EmL 对 10 个不同产地竹节参样
品进行扩增，以检测该 SＲAP-PCＲ 反应体系的稳定
性。结果显示，所选引物可在 10 个不同产地竹节参
样品上扩增出清晰稳定、重复性好的条带(图 7 和
图 8)。
图 7 引物 Me1 /Em5 对 10 个不同产地
竹节参样品 SＲAP-PCＲ扩增结果
图 8 引物 Me3 /Em1 对 10 个不同产地竹节参
样品 SＲAP-PCＲ扩增结果
4 讨论
SＲAP分子标记是在总结现有分子标记优缺点
基础上开发出的一种新型的 DNA分子标记技术，其
扩增条带比 ＲAPD、ISSＲ 分子标记更稳定，适用于不
同植物的各种研究，目前已在数十种植物中应用，但
在药用植物的生长发育、遗传多样性评估、品种鉴定
及植物系统分类等方面的研究尚处于起步阶段，本
研究首次构建并优化了竹节参的 SＲAP-PCＲ反应体
系。但是受反应条件及物种差异的影响，不同物种
间 SＲAP最佳反应体系差别很大。因此，应用 SＲAP
标记之前，应该对反应条件进行优化，从而保证反应
体系的重复性和稳定性。
目前国内外尚未见有关竹节参 SＲAP-PCＲ反应
体系构建的相关研究。在竹节参植物遗传多样性的
研究方面，我们构建了针对竹节参基因组 DNA 的
SＲAP-PCＲ 反应体系，对 dNTPs、DNA 模板、引物、
Taq DNA聚合酶浓度和复性第二阶段的退火温度等
条件进行探索和研究。结果发现，这 5 个参数对
SＲAP-PCＲ 扩增结果有不同程度的影响，其中模板
浓度对扩增结果影响较小，这与对枸杞［26］、香
蕉［27］、马铃薯［8］的研究结果相一致;相比较而言，
dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶浓度和复性温度对扩
增结果影响比较大，这与辣椒［28］在这方面研究结果
相一致。所构建优化并最终确定了竹节参 SＲAP-
PCＲ扩增的最佳反应体系(25μl):DNA 40ng，dNTPs
0． 2 mmol /L，Primer 0． 36μmol /L，10 × PCＲ Buffer 2．
5 ul，Taq DNA polymerase 2U，退火温度 50 ℃，这为
SＲAP分子标记在竹节参遗传多样性的研究中提供
了一定的技术支持。
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