全 文 ：ITS2 序列作为 DNA条形码在苍耳属中的应用
胡伟毅1，赵晓燕2 (1．连云港出入境检验检疫局，江苏连云港 222042;2．江苏恒瑞医药股份有限公司，江苏连云港 222042)
摘要 ［目的］苍耳(属) ( 非中国种)植物为检疫性有害生物，该试验尝试以 ITS2序列作为 DNA条形码对从国外截获的 7种苍耳属植物
进行物种区分鉴定研究。［方法］试验应用通用引物对其 ITS2基因进行扩增，测序得到 7种苍耳属植物的 ITS2序列，利用 MEGA 5． 1软
件得到的 ITS2序列进行比对和分析，并构建系统树。［结果］共发现变异位点 242 个，其中单突变位点 12个。［结论］ITS2 序列能从基
因位点层面对苍耳属植物进行区分鉴定。
关键词 ITS2序列; DNA条形码;苍耳属
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611( 2013) 20 －08472 －02
The Application of ITS2 Sequence as DNA Barcode in Xanthium
HU Wei-yi et al ( Lianyungang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Lianyungang，Jiangsu 222042)
Abstract ［Objective］All the species in Xanthium ( non-Chinese) are defined as quarantine pests． In this experiment，ITS2 sequence was
used as DNA barcode to distinguish and indentify 7 species in Xanthium． ［Method］Universal primer was used to amplify ITS2 genes which were
then sequenced． The ITS2 sequences were contrasted and analyzed by MEGA 5． 1 software，and the phylogenetic tree was constructed． ［Result］
242 variable sites and 12 singleton sites were discovered． ［Conclusion］The result shows that the species in Xanthium can be distinguished and
indentified by the gene sites of ITS2 sequence．
Key words ITS2 sequence; DNA barcode; Xanthium
基金项目 江苏出入境检验检疫局科技项目( 2012KJ54) 。
作者简介 胡伟毅( 1984 － ) ，男，河北宣化人，硕士，从事港口外来有害
生物截获工作，E-mail: 94087540@ qq． com。
收稿日期 2013-06-30
苍耳属(Xanthium)植物为农田重要杂草，且可黏附于动
物毛皮上，降低毛皮的品质，影响动物的健康，因此，其被加
进 2006年发布的农业部与国家质量监督检验检疫总局共同
制定的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中。
苍耳属植物的形态鉴定方法对检测人员的实验室鉴定经验
有着较高的要求，而且苍耳属的果实在粮谷长期运输中难免
会受到磨损，因此，对于检验检疫工作一线工作人员，有必要
寻求新技术、新方法的支持。植物 DNA 条形码技术是针对
植物基因组中的特定基因进行片段扩增、测序从而发现其碱
基变化规律的技术手段，该技术在动物的 COI基因中应用较
为成熟［1 －2］，但由于 COI 基因在植物种中变化保守，不能做
到很好的区分作用，使得植物 DNA条形码技术的研究重点，
仍在通用基因片段的应用、筛选、搭配上［3］。尽管如此，植物
DNA条形码技术还是在保护濒危物种、药品食品监督、中草
药资源鉴定及生态学调查等诸多领域起到了突破性的作用，
发挥了以前形态学研究所无法产生的效果［4 －5］。ITS2 序列
即核糖体内转录间隔区，是植物 DNA 条形码重点关注的序
列之一［6］。该试验以 2012年连云港口岸截获的 7 种苍耳属
植物为研究对象，探讨其 ITS2 序列变化规律，旨在为今后
DNA条形码技术在苍耳中的应用研究奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料 7 种苍耳属植物:北美苍耳(Xanthium chinese)、
苍耳(Xanthium sibiricum)、刺苍耳(Xanthium spinosum)、西方
苍耳(Xanthium occidentale)、巴西苍耳(Xanthium brasilicum)、
美丽苍耳(Xanthium speciosum)、宾州苍耳(Xanthium pensyl-
vanicum) ，以上外来苍耳均为 2012 年在进口大豆中截获，并
由中国检验检疫科学院鉴定的样本;DNeasy Plant Mini Kit、
2 × Taq master mix、琼脂糖、goldenview I等试剂耗材。
ITS2引物［7］:
ITS2f:5-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3
ITS2r:5-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3
1． 2 方法
1． 2． 1 DNA的提取。采用 DNeasy Plant Mini Kit试剂盒法
提取 DNA，按照说明书逐步操作，可得到 200 μl DNA 样品，
－20 ℃冰箱保存。
1． 2． 2 PCR 反应。PCR 体系使用中美泰和公司 2 × Taq
master mix进行扩增，反应采用 25 μl体系，包含:DNA模板 3
μl，引物 1 1 μl，引物 2 1 μl，2 × Taq master mix 12． 5 μl，
ddH2O 7． 5 μl。PCR扩增条件为:95 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，52
℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35个循环;72 ℃ 10 min，4 ℃ 保存。
1． 2． 3 琼脂糖凝胶制备与电泳检测。称取1． 5 g regular aga-
rose G-10于锥形瓶中，加入 100 ml ddH2O，2 ml 50 × TAE
buffer，高火微波 4 min，将锥形瓶置于 75 ℃水浴中 5 min，加
入 10 μl goldenview I，摇匀，静置 10 min，倒于凝胶模具中，放
置 30 min后使用。取 PCR 产物 4 μl 点样电泳，100 V 下电
泳，45 min后，将凝胶放入凝胶成像系统拍照，得到电泳结果
图谱。
1． 2． 4 测序、拼接及序列分析。将 PCR产物送往中美泰和
生物技术(北京)有限公司进行双向测序，将测序结果用 Co-
denCode Aligner软件进行剪切和拼接，得到完整序列。登陆
NCBI，对拼接后的序列进行 BLAST检测，证明 7种苍耳属植
物的 ITS2 序列扩增及测序是否成功。利用 MEGA5． 1 软
件［8］对 7 种苍耳属植物 ITS2 序列进行 ClustalW校对，并用
MEGA5． 1对校对后的序列进行分子进化遗传分析。
2 结果与分析
2． 1 电泳及 BLAST检测 从图 1 可看出，7 种苍耳属植物
的 ITS2序列扩增条带单一清晰，无特异性条带及拖尾现象，
责任编辑 朱琼琼 责任校对 卢瑶安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2013，41(20):8472 － 8473，8504
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2013.20.089
与 Marker对比可知，该扩增产物大小接近 450 bp，与预期大
小一致。登陆 NCBI，将拼接后的序列进行 BLAST检测，证明
7种苍耳属植物的 ITS2序列扩增及测序成功。
2． 2 碱基构成分析 从表 1可看出，苍耳属植物 ITS2序列中
T、C、A、G碱基的变化范围分别为 2． 6%、2． 3%、3． 1%、2． 8%。
其中，宾州苍耳和刺苍耳 T碱基含量最高，为23． 7%，北美苍耳
最低，为 21． 1%;北美苍耳 C碱基含量最高，为 29． 0%，宾州苍
耳及刺苍耳最低，为 26． 7%;北美苍耳 A 碱基含量最高，为
23． 2%，苍耳最低，为 20． 1%;苍耳及西方苍耳 G 碱基含量最
高，为 29． 5%，北美苍耳最低，为 26． 7%。
2． 3 基因位点分析 由 MEGA5． 1 测算得出苍耳属植物
ITS2序列共有 445 个位点，其中保守位点有 201 个，变异位
点 242个，单突变位点共有 12个(表 2)。
注:M． DNA Marker;1．宾州苍耳;2．西方苍耳;3．巴西苍耳;4．美
丽苍耳;5．苍耳;6．刺苍耳;7．北美苍耳;8．空白对照。
图 1 ITS2基因扩增结果
表 1 苍耳属植物 ITS2序列碱基构成
中文名 拉丁名
碱基构成∥%
T C A G
碱基总数
bp
宾州苍耳 Xanthium pensylvanicum 23． 7 26． 7 20． 6 29． 0 427． 0
美丽苍耳 Xanthium speciosum 21． 4 28． 5 23． 1 27． 1 425． 0
巴西苍耳 Xanthium brasilicum 23． 4 26． 9 20． 4 29． 3 427． 0
西方苍耳 Xanthium occidentale 23． 2 26． 9 20． 4 29． 5 427． 0
刺苍耳 Xanthium spinosum 23． 7 26． 7 20． 4 29． 3 427． 0
苍耳 Xanthium sibiricum 22． 5 27． 9 20． 1 29． 5 427． 0
北美苍耳 Xanthium chinese 21． 1 29． 0 23． 2 26． 7 427． 0
平均 22． 7 27． 5 21． 2 28． 6 426． 7
表 2 苍耳属植物 ITS2序列单突变位点表
中文名 拉丁名
位点位置
1 6 39 117 179 194 237 249 259 260 285 302
宾州苍耳 Xanthium pensylvanicum C G T T C A T A G T C G
美丽苍耳 Xanthium speciosum G － C T C A T － － － C G
巴西苍耳 Xanthium brasilicum C G C T C A T A G T C G
西方苍耳 Xanthium occidentale C G C T C A T A G T C G
刺苍耳 Xanthium spinosum C G C T C A T A G T C G
苍耳 Xanthium sibiricum C G C C G G T G T G T A
北美苍耳 Xanthium chinese C C C T C A C － － － C G
注:“－”代表该位点碱基缺失。
2． 4 遗传距离分析 利用 MEGA5． 1 软件，采用 Tamura-Nei
模型计算遗传距离(表 3) ，结果可看出，苍耳属植物 ITS2 序
列的遗传距离最高值为 3． 577 7，为宾州苍耳与北美苍耳间
的遗传距离，最小值为 0． 002 4，为巴西苍耳与西方苍耳间的
距离。
表 3 苍耳属植物 ITS2序列遗传距离
中文名 编号 1 2 3 4 5 6 7
宾州苍耳 1 3． 566 8 0． 004 7 0． 007 1 0． 007 1 0． 056 5 3． 577 7
美丽苍耳 2 3． 566 8 3． 316 3 3． 393 2 3． 579 5 3． 342 6 0． 004 7
巴西苍耳 3 0． 004 7 3． 316 3 0． 002 4 0． 007 1 0． 050 8 3． 327 4
西方苍耳 4 0． 007 1 3． 393 2 0． 002 4 0． 009 5 0． 053 5 3． 397 7
刺苍耳 5 0． 007 1 3． 579 5 0． 007 1 0． 009 5 0． 053 6 3． 588 7
苍耳 6 0． 056 5 3． 342 6 0． 050 8 0． 053 5 0． 053 6 3． 356 2
北美苍耳 7 3． 577 7 0． 004 7 3． 327 4 3． 397 7 3． 588 7 3． 356 2
( 下转第 8504页)
374841 卷 20 期 胡伟毅等 ITS2 序列作为 DNA条形码在苍耳属中的应用
3 结论与讨论
黄淮海夏大豆区品种熟期存在由北向南推迟的趋势，同
一熟期组纬度跨幅较大，相邻熟期组品种区域无明显界限，
这是全国大豆熟期组地理分布的共同特征。而美国大豆熟
期组南北地理分布的规律性十分明显，同一熟期组纬度跨幅
小，相邻熟期组地带间基本没有重叠，这种差异的形成是因
为美国大豆生产以春播秋收的一年一熟制为主［5］。豫东地
区地处黄淮海中部，具有独特的地理区位优势，通过对豫东
地区大豆品种熟期组的划分，在遗传育种与研究成果方面有
益于与国内、外开展合作、交流，同一熟期组品种可分布在不
同的大豆区中，即表示不同大豆区相同熟期组分布地域间的
相互引种易于成功［6］。该试验中，由大豆产业技术体系研发
中心提供的美国生育期组相近的 13个标准对照品种熟期区
分很明显，无熟期交叉重叠现象。而参试的 43 个品种(系)
在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ 4个熟期组中都有相对应的品种，从地理区位
上看，出现了很明显的熟期重叠现象，但大部分品种(系)处
于Ⅳ、Ⅴ 2个熟期组，说明适合豫东地区种植的大豆品种Ⅳ、
Ⅴ熟期组占有主导地位。当然这种现象也有可能是春播相
对较晚，导致生育期组间最大生育期与最小生育期相互
交叉［7］。
同时，通过对参试品种(系)生育日数、株高和主茎节数
的分析，均随着熟期组的变化而变化，说明大豆品种对不同
生态区域的反应比较敏感，利用生育期组划分成果可成功引
进品种。由于豫东地区 7 月上旬普降大暴雨，田间湿度较
大，部分品种出现徒长现象，这也可能导致部分品种株高的
增加。熟期组和株高、主茎节数之间的关系具有规律性，对
确定其相关指标还有待于今后进一步的试验和研究。
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(1):
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
18 －20．
( 上接第 8473页)
2． 5 系统进化发育树 利用 MEGA5． 1软件，采用 Maximum
Likelihood方法构建系统发育树，由图 2 可看出，美丽苍耳、
北美苍耳被分为一支;苍耳被分为一支;巴西苍耳、西方苍
耳、刺苍耳、宾州苍耳被分为一支;对其进行 bootstrap 检验，
其分组支持率为 100%，说明这 3 支苍耳属植物在系统进化
发育中是相互独立的。巴西苍耳、西方苍耳与刺苍耳、宾州
苍耳又被进一步分为 2 支，对其进行 bootstrap 检验，其分组
支持率为 85%，具有较高的支持度。这 2个分支又被划分为
不同级别的分支，但其 bootstrap检验支持率最高仅为 45%及
56%，说明这 4种苍耳属植物，从植物 ITS2 序列进化层面来
说，在苍耳属系统进化发育中独立性相对较弱。
图 2 苍耳属植物 ITS2序列系统发育树
3 讨论
该试验将 DNA条形码鉴定手段应用到来自世界各地的
苍耳属植物中，从结果来看，ITS2 序列能从基因位点层面对
苍耳属植物进行区分，但也存在有以下不足:ITS2 序列对巴
西苍耳、西方苍耳、刺苍耳及宾州苍耳这一系统发育支系的
继续分化未提供较高的支持值。在植物 DNA条形码的研究
中，matK、trnH-psbA、rbcL、ITS等基因序列也是研究工作的重
点，对 ITS2序列可起到补充作用［9 －10］。未来在苍耳属 DNA
条形码的研究中，将 ITS2 序列与其他条形码序列做适当的
结合应会得到更好的效果。
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