全 文 ：第 32 卷第 1期 河 南 林 业 科 技 Vol. 32 No. 1
2012 年 3 月 Journal of Henan Forestry Science and Technology Mar. 2012
收稿日期：2012-02-15
基金项目：国家林业局“十二五”科技支撑项目（编号：2012BAD01B05）。
作者简介：王念（1978-），女，河南省上蔡县人，工程师，主要从事林木遗传育种研究。





梓树属植物基因组DNA提取及RAPD体系优化


王 念 1，王巧玲 2

（1.河南省林木良种选育与种质资源保护重点实验室，郑州 450008；
2.河南省林业调查规划院，郑州 450045）

摘 要：以楸树幼嫩叶片为材料，进行楸树基因组DNA提取及 RAPD扩增条件优化，试验表明，采用改良
的 2×CTAB 法提取的 DNA 质量较高，适宜于 RAPD 分析。RAPD 反应的优化体系为（25 ul 反应体系）：
17.8 ul ddH2O；0.5 ul dNTP；2.5 ul 10×buffer；1.0 ul 随机引物；2.0 ul Mgcl2；1.0 ul 模版；0.2 ul Taq 酶 。
关键词: 楸树；DNA提取；RAPD

中图分类号：Q 343.1 文献标识码：A 文章编号：1003-2630（2012）01-0001-03

Genomic DNA Extraction and Optimization of RAPD System of
Catalpa Scop

WANG Nian1, WANG Qiao-ling2
（1.Key Laboratory of Forest Germplasm Conservation、Breeding of Improved Variety of
Henan-Province,Zhengzhou 450008, China; 2. Henan Forest Inventory and Planning Institute, Zhengzhou
450045, China)
Abstract: The method of genomic DNA extraction from new leaves and the optimization of RAPD analytic
conditions were studies in Catalpa bungei. The result showed that the high-quality genomic DNA was
obtained by the revised 2×CTAB method. The optimal PCR system for RAPD analysis was as
follows:17.6ul ddH2O;0.5ul dNTP;2.5ul 10×buffer; 1.0ul random Primer;2.0ul Mgcl2;1.0ul template;0.4ul Taq
polymerase in 25ul reaction system.
Key words：Catalpa bungei; Genomic DNA extraction; RAPD

梓树属是紫葳科的关键物种。在梓树属中楸树
最为名贵，是我国传统的优质珍贵用材树种，素有
“木王”之称[1]。随机扩增多态 DNA(Random
Amplified Polymorphic DNA, 简 称 RAPD) 是
J.Wi11iams 和 J.Welsh[2]研究小组于 1990 年同时提
出的一种随机引物扩增、寻找多态 DNA 片段的遗
传标记技术。RAPD以 PCR技术为基础，以基因组
DNA为模板，以单个人工合成的随机多态核苷酸序
列（通常为 10 个碱基对）为引物，在热稳定的DNA
聚合酶作用下，进行 PCR扩增[3]。扩增产物的多态
性反映了基因组片段的多态性。RAPD 技术在物种
亲缘关系、系统发育分子水平的鉴别，以及分子生
物学、分子生态学的研究中能够起到重要的作用。
我们对梓树属植物基因组 DNA 提取及 RAPD 扩增
条件优化进行了初步研究，为梓树属植物分子水平
的深入研究奠定了良好的基础。

1 材料与方法
2 河 南 林 业 科 技 第 32 卷
1.1 材料
试验材料金丝楸（J）、灰楸（H）、梓树（Z）、
美国梓树（M）、豫楸 1号（Y）来自河南省林业科
学研究院试验场。随机引物由大连宝生物生物工程
公司合成，Taq 酶，dNTP，10×PCR Buffer，Mg2+
均购自上海生物工程公司。PCR扩增采用美国伯乐
公司MyCycler PCR 扩增仪器，凝胶成像采用伯乐
Gel Doc XRTM凝胶成像分析系统。
1.2 方法
1.2.1 梓树属基因组DNA提取
采用 2×CTAB 法提取梓树属基因组DNA：①
取幼嫩叶片加液氮研磨成粉末状，转入 1.5 ml 离心
管中；②加入 600 ul 65℃预热的 2×CTAB溶液混
匀并置于 65℃水浴中保温 30～60 min；③取出冷却
后，上下摇匀，加入 600 ul 的氯仿异戊醇（24∶1），
12 000 r/min 离心 10 min，④取上清液于另 1个 1.5
ml 的离心管中；加 600 ul 异丙醇，12 000 r/min 离
心 10 min，倒掉上清液，用 75%的酒精清洗，沉淀
晾干后加 100 ul 无菌水溶解；⑤加 10 ul（10 mg/ml）
的 RNA酶，37℃水浴酶解 1 h，补水至 500 ul；⑥
加 500 ul 的苯酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1），混合
均匀，12 000 r 离心 10 min，抽提纯化 2次；⑦取
上清液，加入等体积的氯仿，混合均匀，12 000 r
离心 10 min；⑧取上清液，加入 1/10 体积 3 mol/L
的乙酸钠和 2.5 倍体积的预冷无水乙醇，-20℃放置
30 min 以上；⑨12 000 r 离心 10 min 后，沉淀即为
提取得到的基因组 DNA，用 70％酒精清洗 3 次，
晾干后加 100 ul TE 或无菌水溶解。
1.2.2 基因组 DNA浓度及质量检测
将原液稀释 50 倍后，用紫外分光光度计测定
DNA 样品在 260 nm 和 280 nm 的吸光度，计算
OD260 nm/OD 280 nm 的值，按 1 OD260=50 ng/μ
l 计算基因组 DNA 原液的浓度，即 50×OD260 ×
稀释倍数。
琼脂糖凝胶电泳检测基因组 DNA 片段的大
小，将DNA样品用无菌水稀释 50 倍，取 5 ul 用
0.8 琼脂糖进行凝胶电泳分析，检测所提取 DNA
片段量。

RAPD 分子标记技术的缺点就是重复性差，试
验过程中容易受到反应体系中其他因素的影响，比
如退火温度、模板DNA质量、扩增参数的设置等。
该研究对影响扩增的主要因素Mg2+的浓度、Taq 聚
合酶的用量、dNTP 的用量进行了优化，建立适宜
梓树属反应的优化体系。
采用 25 ul 反应体系，包括 ddH2O、dNTP、10
×Buffer、引物、模板、Taq 酶，设置镁离子浓度
梯度为 50 umol/L、100 umol/L、150 umol/L、200
umol/L、250 umol/L；dNTP浓度梯度为50 umol/L 、
100 umol/L 、150 umol/L 、200 umol/L、250
umol/L；Taq 酶浓度梯度 0.5 U、1.0 U、1.5 U、2.0
U、2.5 U，通过对比试验找出最佳反应体系，并利
用 42 种不同引物进行优化条件的检验。
1.3 DNA扩增反应程序
根据树种的不同和引物合成的退火温度，程
序设置如下：首先进行预变性 95℃ 5 min，预变性
之后进入循环体系：变性：94℃ 30 s；退火：36
℃ 30 s；延伸：72℃ 45 s，共 45 个循环，最后 72
℃再延伸 10 min，反应结束后 4℃保存。
1.4 电泳检测
实验结束后，取 15 ul 扩增产物用 0.5 倍 TBE
电泳缓冲液，在 1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳，电
压为 100 V。电泳结束，EB染色 20 min 后，在伯
乐凝胶成像仪下观察、拍照。

2 结果分析

2.1 梓树属基因组DNA提取质量及电泳分析
通过分光光度计分析得知提取得到的 DNA 浓
度较高，样品色泽白色透明，OD260nm/ OD280nm为1.73，
接近 1.8，表明 DNA浓度符合 RAPD分析要求。
通过 0.8％琼脂糖凝胶电泳分离检测，溴化乙
锭染色，观察DNA分子的完整性，结果见图 1。基
因组 DNA 在凝胶上表现为一条规则的带，基本无
降解现象，有少量的 RNA，但不影响 RAPD分析。

图 1 楸树基因组总DNA电泳图谱
2.2 RAPD 扩增条件优化结果及参数确定
2.2.1 镁离子和 dNTP 浓度优化及结果
该实验设计了镁离子为 50 um/L、100 um/L、
150 um/L、200 um/L、250 um/L 的浓度梯度，从实
验结果分析，镁离子浓度对扩增产物的影响很明
显：浓度太低时，没有扩增产物出现（图 2中第 1、
第 1期 王 念等：梓树属植物基因组DNA提取及 RAPD体系优化 3
2 泳道），浓度太高时，条带模糊且多态性低（图 2
中的 5泳道）。在浓度为 150 um/L 或 200 um/L 时条
带多且较为清晰。
在扩增反应体系中，dNTP是PCR反应的原料，
在实验过程中会螯合部分镁离子，减少溶液中镁离
子的数量，导致扩增谱带的改变直至产物消失。因
此，镁离子和 dNTP 的浓度要综合考虑，结合实验
结果（见图 2），采用镁离子最终浓度是 200 umol/L，
dNTP 的最佳浓度是 50 umol/L。
图 2 dNTP 和镁离子浓度优化扩增效果
2.2.2 Taq 酶浓度优化及结果
该实验设计 Taq 酶 5 个浓度梯度，分别是 25 ul
体系中 0.5 U、1 U、1.5 U、2 U、2.5 U。由图 3的
电泳图可见，Taq 酶以 1 U 为最好，条带多而且清
晰，浓度减少条带清晰度下降，而浓度增加条带变
粗，背景较模糊。
图 3 Taq 酶浓度优化扩增效果
2.3 RAPD 扩增条件优化参数确定
经过对镁离子、dNTP、Taq 酶的优化，建立如
下 RAPD 优化体系：10×buffer：2.5 ul；Mgcl2：
2.0 ul；dNTP：0.5 ul；Taq 酶：0.2 ul；引物：1.0 ul；
模板：1.0 ul，加双蒸水至 25 ul。
PCR 循环参数设定：95℃预变性 5 min，94℃
变性 30 s、36℃退火 30 s、72℃延伸 45 s，进行 45
个循环，然后 72℃延伸 10 min，最后 4℃保存。
2.4 梓树属基因组 RAPD测定结果
用优化参数和选定的扩增条件对梓树属5种植
物基因组DNA进行扩增，扩增产物用 1.5％琼脂糖
电泳分离，溴化乙锭染色，凝胶成像系统照相，结
果见图 4。由图 4可见，DNA扩增图谱清晰，豫楸
1 号和金丝楸谱带相同，这和豫楸 1 号是从金丝楸
中选育出来的实践结果一致。不同品种之间 DNA
存在明显的多态性，其中 1 500 bp 为 5 个品种所共
有，在不同样本中没有变异，这表明它们是比较保
守的 DNA 片断，其他条带在不同品种和个体中或
有或无，这反映了梓树属品种的遗传多样性，同时
也说明了我们建立的RAPD优化体系适合梓树属植
物遗传多样性分析。
图 4 不同品种在不同引物条件下的RAPD扩增效果

3 结论与讨论

通过对反应体系的优化，建立了梓树属植物的
RAPD-PCR 最佳反应体系，为下一步进行梓树属
植物种质资源的 RAPD分析及其亲缘关系鉴定、遗
传多样性研究提供了可靠的试验依据。
在优化 RAPD扩增条件过程中，应尽可能找出
各种对 RAPD 扩增产生不良影响的高低变数[4]。多
次实验证明，采用梯度设置法是优化 RAPD扩增条
件的简便快速、经济实用方法，它使 RAPD扩增条
件优化过程实现了程序化和数量化，采用该方法、
程序与策略，可以在短时间内获得 RAPD扩增全部
优化参数，节约大量的试剂、DNA样本和实验时间，
应用该方法进行 RAPD 扩增可以获得图谱清晰、稳
定可靠的实验效果。

参考文献：
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[2] Willamas J.G. Kubelik.A.R. Livak,K.J.etc.
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（责任编辑：王文彬）