全 文 ：浙江农业学报 ActaAgriculturaeZhejiangensis22(6):731 ～ 735, 2010
金枣柿与部分柿属植物亲缘关系的 ISSR分析
徐象华 1 , 陈民管 2 ,李永强 2 ,孙 杰 2 ,陈文荣2 ,郭卫东 2, ＊
(1 丽水市林业科学研究所 ,浙江 丽水 323000;2浙江师范大学 化学与生命科学学院 ,浙江 金华 321004)
收稿日期:2009 -10-26
基金项目:浙江省科技计划项目(2006C32039)
作者简介:徐象华(1966 -),男 ,浙江丽水人 ,硕士 ,高级工程师 ,
从事果树生理与分子生物学研究。 Tel:0578-2185128;E-mail:
lsxu xh@lishui.gov.cn
＊通讯作者 ,郭卫东 , Tel:0579-82282641;E-mail:gwd@zjnu.cn
摘 要:应用 ISSR标记对柿属(Diospyros)17份植物材料的亲缘关系进行分析 , 以明确金枣柿的分类地位。
用君迁子(D.lotusL.)进行预扩增后 , 从 100条引物中筛选出 37条扩增清晰的多态性引物 , 这些引物共扩增
出 997条 DNA条带 , 平均每个引物扩增的 DNA条带数为 26.94条 , 其中多态性 DNA条带 973条 , 占
97.59%。根据 ISSR扩增结果 ,进行聚类分析 ,结果表明:17份柿属材料可明显分为 2个大类群 ,其中金枣柿
的 6份试材为一个大类群 , 与组成另一类群的 3个种形成明显遗传界限。 通过聚类分析 , 结合形态观察 ,认
为金枣柿极有可能是柿属的又一个新种。
关键词:金枣柿;柿属植物;浙江柿;君迁子;柿;亲缘关系;ISSR
中图分类号:S665.2 文献标识码:A 文章编号:1004-1524(2010)06-0731-05
GeneticdiversityanalysisbetweenJinzaopersimmonandgenusofDiospyrosu-
singISSRtechnique
XUXiang-hua1 , CHENMin-guan2 , LIYong-qiang2 , SUNJie2 , CHENWen-rong2 , GUOWei-
dong2, ＊
(1LishuiInstituteofForestry, Lishui323000 , China;2ColegeofChemistryandLifeScience, ZhejiangNormalUniver-
sity, Jinhua321004 , China)
Abstract:Thegeneticdiversitiesof17samplesbelongedtoDiospyroswereanalyzedbyISSRmolecularmarkerstoi-
dentifytheclassificationofJinzaopersimmon.AfterpreviousISSR-PCRofDiospyroslotusL., 997bandswereampli-
fiedwith37 polymorphicprimersscreenedfrom 100 ISSRprimers, andtheaveragenumberofamplifiedbandswas
26.94 perprimer.Amongthesebands, 973 bandswerepolymorphicandthepolymorphismpercentagewas97.59%.
Thedendrogramshowedthatthe17 individualswereclassifiedintotwogroups, amongwhich6oftheJinzaopersim-
monmaterialsmadeupabiggroup, andanothergroupwascomposedof3Diospyrosspecies.Therewasanobvious
geneticboundarybetweenthetwogroups.Theresultsofhierarchicalclusteranalysiscombinedwiththeobservationof
anatomicalcharacteristicsofJinzaopersimmon, indicatedthatitmightbeanewspeciesofDiospyros.
Keywords:Jinzaopersimmon;Diospyros;D.glaucifoliaMeta;D.LotusL.;D.KakiL.;geneticdiversity;ISSR
金枣柿 ,又称串柿 、柿枣 ,柿树科 (Ebenace-
ae)柿属(Diospyros)植物 ,落叶乔木 ,主产于浙江
省松阳 、缙云等地 ,其果实成熟时金黄色 ,外形酷
似枣子 ,故名金枣柿 。金枣柿无核 ,具有很高的
药用价值 ,其产量少 ,价格奇高 ,是广大农民致富
奔小康较好的开发项目 。由于金枣柿的形态与
其他柿属柿种植物具有较大差异 ,对于金枣柿的
分类地位尚存争议 [ 1, 2] ,一定程度上阻碍了金枣
柿的快速 、有效地开发和利用 。目前国内有关柿
属植物的研究主要是以罗正荣等人为代表的专
家学者 ,他们不仅致力于柿属植物光合特性[ 3] 、
植株再生 [ 4] 、胚胎发育[ 5] 、激素调控和果实成
熟 [ 6]等生理方面的研究;同时构建了多种分子标
记 技 术 , 如 RFLP[ 7] , RAPD[ 8] , AFLP[ 9, 10] ,
SSR[ 11, 12] , ISSR[ 13] , IRAP[ 14] , SRAP[ 15, 16] 等 , 对
中 、日 、美等国家之间的柿属种质资源进行多态
性分析 ,为我国柿属资源的开发利用奠定基础 ,
也为我国各地的地方品种的研究利用提供相关
依据和技术参考。而金枣柿作为浙江省的特有
品种 ,尚未有相关的系统研究 ,且在分类归属问
题上还不明确。为此 ,我们应用 ISSR标记 ,以金
枣柿为主对部分柿属植物进行分析评价 ,以了解
部分柿属植物的遗传多样性 ,判断金枣柿与其他
种质材料之间的差异 ,为进一步开展金枣柿优良
品种筛选和栽培利用等研究奠定基础 。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料由浙江省丽水市林业局采集 ,共 17
个样品 , 其中浙江柿(DiospyrosglaucifoliaMeta)、
君迁子 (DiospyroslotusL.)和柿 (Diospyroskaki
L.)为 3个已确定的种 ,金枣柿为试验的待定种
(表 1)。每个样品分别提取 DNA,用于 ISSR分
析 。
1.2 DNA的提取
参考王文江等 [ 17]的改良 CTAB法提取基因
组 DNA,用紫外分光光度法和琼脂糖电泳法检测
DNA质量 ,稀释至 50 ng/μL, -20℃保存备用 。
1.3 ISSR引物合成
根据加拿大 BritishColumbia大学公布的 IS-
SR引物序列(htp://www.michaelsmith.ubc.ca/
servicesNAPSPrimerSets/)设计 ,由上海生工生物
工程技术服务有限公司合成。
1.4 PCR扩增体系优化
对张青林和罗正荣[ 13]构建的柿属植物的 IS-
SR反应体系进行 PCR扩增体系的验证优化 ,得
到 25 μL反应体系:DNA模板浓度 3.0 ng/μL,引
物浓度 0.4 μmol/L, dNTPs浓度 0.2 mmol/μL,
Taq酶浓度 1 U/25μL, 1 ×Bufer(含 Mg2 +)。
PCR反应在 Bio-RadThermalMyCycler梯度 PCR
仪上进行 ,反应程序为:94℃, 3 min;94℃, 30 s,
表 1 部分柿属植物不同试材的概况及样品编号
Table1 GeneralsituationoftestmaterialsofDiospyrosand
samplecodes
样品编号 试材名称 采集地及单株号 原产地
1 禅寺丸 浙江富阳 日本
2 东阳 1号 浙江富阳 中国
3 野柿 浙江丽水 中国
4 浙江柿 浙江丽水 中国
5 君迁子 浙江丽水 中国
6 西村早生 浙江富阳 日本
7 早次郎 浙江富阳 日本
8 次郎 浙江富阳 日本
9 牛奶柿 浙江丽水 1号 中国
10 牛奶柿 浙江丽水 2号 中国
11 牛奶柿 浙江丽水 3号 中国
12 金枣柿 浙江缙云 2号 中国
13 金枣柿 浙江缙云 5号 中国
14 金枣柿 浙江永康 1号 中国
15 金枣柿 浙江永康 2号 中国
16 金枣柿 浙江松阳 3号 中国
17 金枣柿 浙江松阳 6号 中国
退火温度 (根据不同引物设定), 45 s, 72℃, 1.5
min, 35个循环 ,最后 72℃, 7 min。
对 100个 ISSR引物进行筛选 ,选择扩增条
带清晰 、重复性好 、可获得 4个以上扩增片段的
引物作为候选引物 ,共 37个 ,并对候选引物进行
退火温度的优化 。
1.5 PCR产物的电泳检测
ISSR-PCR扩增产物采用 2%琼脂糖凝胶(西
班牙 Biowest公司)电泳 ,溴化乙锭染色 ,电泳缓
冲液为 1 ×TAE,采用 Bio-RadUniversalHoodⅡ凝
胶成像分析仪进行图像处理 ,保存。
1.6 数据分析
ISSR扩增谱带在相同迁移率位置上按有
(1)、无(0)记录 ,模糊不清的条带不计 ,得到 0 -
1 Excel统计表 。利用 SPSS12.0软件导入 0 -1
统计表计算样品遗传相似系数和遗传距离 ,并按
UPGMA法(非加权配对算术平均法)对所有样品
进行聚类分析 ,构建亲缘关系图 。
2 结果与分析
2.1 ISSR扩增产物多态性
·732· 浙江农业学报 第 22卷 第 6期(2010年 11月)
用筛选得到的引物分别对各个样品进行 IS-
SR扩增 ,获得了清晰的扩增条带 ,而且多态性丰
富(图 1), 37条引物共检测得到了 997个位点 ,
其中 973个为多态性位点 ,约占 97.59%,扩增产
物条带大小主要集中于 200 ～ 2 000 bp。其中 ,以
引物 UBC885扩增出条带最多 ,共检测到 44个位
点 ,多态性比率 100%, 另外 UBC810, UBC812,
UBC816, UBC818, UBC828, UBC840, UBC843,
UBC853, UBC855, UBC856, UBC857, UBC858,
UBC859, UBC860, UBC866 , UBC867 , UBC881 ,
M.LambdaDNA×EcoRI+HindIIMarker;1～ 17.同表 1中所列编号为 1～ 17样品
图 1 ISSR引物 UBC818对部分 17样品的扩增结果
Fig.1 ThePCRresultsof17samplesofDiospyrosbyusingISSRprimerUBC818
UBC885, UBC889和 UBC891等 20个引物多态性
比率均高达 100%,其他不同引物的扩增结果多
态性位点比例也大多在 90%以上 ,多态性较高
(表 2)。
图 2 17个样品水平聚类树状图
Fig.2 Dendrogramof17samplesofDiospyros
2.2 17个柿属样品的聚类分析
运用 SPSS12.0软件按照 Pearsoncorelations
intervalmeasure和 Between-groupslinkagesmeth-
od[ 18]的步骤 ,构建 17个样品聚类分析图(图 2)。
从 17个样品的树状聚类图可以看出 ,当遗传距
离(rescaleddistanceclustercombine)为 25时 , 17
个样品聚为两类 ,金枣柿的 6个样品(Num12 ～
Num17)聚为一类 ,其他样品聚成一类;当遗传距
离为 20时 , 17个样品可聚为 3类 ,也可以看出金
枣柿 6个样品与其他样品有明显的聚类界限。
当然还可以看到不同地区的金枣柿(如 Num12
与 Num16)也有一定的差异;同一地区的不同单
株间(如 Num12和 Num13)同样存在差异 ,但明
显小于地区差异;同时 ,也可以清楚看出除金枣
柿以外的样品可聚为一个类群 ,浙江柿和君迁子
也可分别成类 ,其他样品聚成一类。说明金枣柿
在分子水平上与其他柿属植物有较大的差异 ,这
与形态上的差异具有一定的统一性 。因此 ,我们
认为金枣柿是独立于柿这个种的 。
3 讨论
我国是柿属植物的原产中心之一 ,也是柿
·733·徐象华等:金枣柿与部分柿属植物亲缘关系的 ISSR分析
表 2 三十七种不同的 ISSR引物及扩增结果
Table2 Theamplificationresultsof37 ISSRprimersonDi-
ospyros
引物 引物序列
(5′-3′)
退火温
度 /℃
扩增总
带数
多态性
带数
多态性位点
百分率 /%
UBC807 (AG)8T 51.0 16 15 93.75
UBC810 (GA)8T 48.6 28 28 100.00
UBC811 (GA)8C 54.9 23 22 95.65
UBC812 (GA)8A 55.0 35 35 100.00
UBC813 (CT)8T 48.6 25 24 96.00
UBC814 (CT)8A 45.7 15 14 93.33
UBC816 (CA)8T 52.9 18 18 100.00
UBC818 (CA)8G 50.7 34 34 100.00
UBC821 (GT)8T 46.9 27 26 96.30
UBC828 (TG)8A 46.9 31 31 100.00
UBC836 (AG)8YA 48.0 21 20 95.24
UBC840 (GA)8YT 51.7 30 30 100.00
UBC843 (CT)8RA 48.7 26 26 100.00
UBC845 (CT)8RG 50.0 20 19 95.00
UBC846 (CA)8RT 48.0 26 25 96.15
UBC848 (CA)8RG 56.1 29 27 93.10
UBC853 (TC)8RT 49.9 33 33 100.00
UBC855 (AC)8YT 56.0 43 43 100.00
UBC856 (AC)8YA 48.0 31 31 100.00
UBC857 (AC)8YG 50.0 31 31 100.00
UBC858 (TG)8RT 54.1 22 22 100.00
UBC859 (TG)8RC 60.0 41 41 100.00
UBC860 (TG)8RA 51.7 22 22 100.00
UBC861 (ACC)6 61.1 16 14 87.50
UBC862 (AGC)6 56.9 14 11 78.57
UBC864 (ATG)6 52.1 20 19 95.00
UBC865 (CCG)6 69.0 21 19 90.48
UBC866 (CTC)6 58.7 24 24 100.00
UBC867 (GGC)6 77.0 29 29 100.00
UBC878 (GGAT)4 55.0 25 24 96.00
UBC880 (GGAGA)3 46.1 22 20 90.91
UBC881 (GGGTG)3 55.1 37 37 100.00
UBC885 BHB(GA)7 49.9 44 44 100.00
UBC887 DVD(TC)7 49.3 32 31 96.88
UBC888 BDB(CA)7 56.3 19 17 89.47
UBC889 DBD(AC)7 46.4 34 34 100.00
UBC891 HVH(TG)7 51.7 33 33 100.00
(D.kakiL.)的原产地 ,柿属植物种质资源丰富 ,
柿树栽培历史悠久 , 栽培面积和产量世界第
一 [ 19] 。本文 17个柿属试材中 ,除浙江柿 、君迁子
和金枣柿外 ,其余均属柿种 ,其中浙江柿 [ 20] 、君迁
子和柿种为 3个已确定的种 ,而金枣柿为试验的
待定种。全世界柿属(Diospyros)植物近 190种 ,
包括柿(D.kakiL.)、君迁子(D.lotusL.)、油柿
(D.oleiferaCheng)、美洲柿(D.virginianaL.)、
老鸦柿(D.rhombifoliaHerosl)等 ,主要分布在热
带和亚热带 。对于部分柿属植物的分类 ,国内外
学者意见不一 ,如金枣柿 ,主要因为传统分类方
法是依据外部特征观察 ,而外部形态受环境的影
响较大 。后有学者试通过对染色体数目研究来
消除这些分类上的分歧 ,如杨勇等 [ 1]在柿属植物
及柿品种染色体数目的研究中发现:柿属种的染
色体以 15为基数 ,浙江柿 、君迁子和柿种 59个
品种中 ,浙江柿 、君迁子及金枣柿含 2组染色体
(2n=30),而柿种中除引自日本的 平`核无 品种
含 9组染色体(2n=9x=135)外 ,其余品种均具
有 6组染色体(2n=6x=90)。但因金枣柿是浙
江的一个栽培种 ,与新种一般都是野生起源不
符 ,杨勇等 [ 1] 认为金枣柿作为一个新种证据不
足 ,将其作为柿的二倍体变种 ,并指出有关金枣
柿的分类地位问题还需利用 DNA分子标记技术
作进一步的研究和确认 。随后 ,罗正荣等一批专
家学者在柿属亲缘关系的研究中完成了 RFLP,
RAPD, AFLP, SSR, ISSR, IRAP, SRAP等多种分子
标记技术的体系构建 ,侧重于研究国外与国内及
国内不同地区种间的亲缘关系 。研究过程中也
用到了金枣柿 ,但对其分类地位也没有明确定
义 ,只是偏向于将金枣柿做为一个新种来处
理 [ 2, 7, 13, 14, 16] 。
本研究通过 ISSR分子标记方法和聚类分析
对 17个柿属植物样品的遗传多样性进行了探
讨 。研究结果表明 ,试材可明显分为 2个大类
群 ,其中金枣柿的 6份试材为一个大类群 ,与组
成另一类群的 3个柿属种形成明显遗传界限 ,鉴
于金枣柿与本文中其他柿属植物的种间差异 ,结
合外部形态的不同 ,如叶面极富光泽 ,叶片正反
面均光滑无毛 ,叶脉极为明显 ,枝条棕黑色 ,光滑
无皮孔等 ,以及金枣柿与柿种染色体组数的差
异 ,但若要确立其新种的地位 ,还需要大量的试
材及其他有力佐证。同时 ,本研究中所用的其他
11种柿属植物又可以分成浙江柿 、君迁子和柿 3
个亚类 ,这也验证了李根有等[ 20]提出浙江柿是一
个物种的看法。在树状图中也不难看出 ,不同采
集地的样品有区域性的差异 ,同一采集地的样品
·734· 浙江农业学报 第 22卷 第 6期(2010年 11月)
又有个体上的差异 ,且个体差异较区域差异小 ,
但 禅`寺丸 和 东`阳 1号 与野柿来自不同地区 ,
个体差异却较小 ,这可能与其原产地和移栽地的
环境变化有关 ,这也说明基因的变化与环境的改
变有着密切的关系。
本文应用 ISSR标记对不同种源的部分柿属
植物进行 DNA分子水平的分析评价 ,聚类结果
与传统分类结果基本相似 , 表明该技术能在分子
水平上对传统柿属分类进行必要补充 。并初步
了解不同种源的部分柿属植物的遗传多样性 ,为
明确金枣柿又是一新种提供参考。
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(责任编辑 张 韵)
·735·徐象华等:金枣柿与部分柿属植物亲缘关系的 ISSR分析