全 文 ：收稿日期:2005-06-06 接受日期:2005-11-10
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30270925)。
作者简介:郭大龙,男,在读博士生。Tel:027-87282677,E-mail:guodalong@webmail.hzau.edu.cn
) 通讯作者。Authorforcorespondence.Tel:027-87282677,E-mail:luozhr@mail.hzau.edu.cn
部分柿属植物SRAP-PCR反应体系的优化
郭大龙,罗正荣 *
(华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室,武汉 430070)
摘 要:SRAP技术是一种多态性和信息量丰富的新的分子标记技术,其技术简便、快速,不需预知序列信息,近年
来在植物遗传多样性分析、种质鉴定、遗传连锁图的构建以及比较基因组学研究等方面得到广泛应用。为了建立柿
属植物SRAP技术体系,对影响SRAP-PCR的Mg2+、dNTPs、Taq聚合酶、引物浓度等因素进行了优化。确定优化的反
应体系为:模板 DNA30ng,Bufer1×,Mg2+2.5mmol/mL,dNTPs0.2mmol/L,Taq酶 1u,引物 0.3μmol/L,反应总体积 25
μL。该体系在柿属植物6种1类型共29个基因型中获得较好的扩增结果,可望在柿属植物起源和进化研究中应用。
关键词:柿属植物;SRAP-PCR;优化
中图分类号:S666.3 文献标识码:A 文章编号:1009-9980(2006)01-138-04
OptimizationofSRAP-PCRinsomeDiospyrosspp.
GUODa-long,LUOZheng-rong*
(KeyLaboratoryForHorticulturalPlantBiology,MOE,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan,Hubei430070China)
Abstract:SRAPisanewmolecularmarkerwhichcouldprovidehighpolymorphismandplentifulinformation.Itissimple
andhasnotthespecie-specificcharacter.Ithadbeenwidelyusedforgeneticdiversity,comparinggenomeanalysisandmap
construction,andsoon.TheconcentrationsofMg2+,dNTPs,TaqDNAolymerase,primerswhichafecttheSRAP-PCRre-
actionswereoptimizedinordertoestablishtheSRAPmolecularmarkersysteminDiospyrosspp.Theoptimumsystemwasas
folows:templateDNA30ng,Bufer1×,Mg2+2.5mmol/mL,dNTPs0.2mmol/L,TaqDNApolymerase1u,primer0.3
μmol/L.Thetotalvolumeofreactionwas25μL.Amplicationswerecariyedouton29Diospyrosspp.genotypesusingthis
optimumsystem.Theresultsshowedthatthesystemwassteadyandreliableandwouldbehelpfultostudyoriginandevolu-
tionofDiospyrosspp.
KeyWords:Diospyrosspp.;SRAP-PCR;Optimization
SRAP[1](Sequence-relatedamplifiedpolymor-
phism,序列相关扩增多态性)标记与已有的分子
标记技术相比有很多优点。Budak等[2]以野牛草
[Buchloedactyloides(Nut.)Englem.]为材料比较了
RAPD,SSR,ISSR和 SRAP4种分子标记技术,发现
SRAP有最丰富的多态性和最强的区分能力;Feriol
等[3]在南瓜(CucurbitapepoL.)中从 SRAP中获得
的信息比AFLP的与形态标记和进化历史更吻合。
Riaz等[4]发现SRAP标记在桃和油桃品种鉴定中比
SSR标记更有效。Ruiz等[5]发现,番茄SSR分析检测
不出,而品种内的变异SRAP可以检测出。
SRAP技术简便、快速,不需预知物种的序列信
息,近年来在植物遗传多样性分析[3]、种质鉴定[4]、遗
传连锁图的构建[6]、基因连锁标记的寻找与基因定
位[1]和比较基因组学研究[7]等方面得到广泛应用。
为建立柿属植物 SRAP技术,本文对 SRAP-
PCR反应体系的各影响因素进行了优化,以期为柿
属植物分子进化和系统发育研究提供技术支持。
1 材料和方法
1.1 材料
采自华中农业大学果树标本园柿圃。优化反应
体系时所用材料为柿(DiospyroskakiThunb.)和君迁
子(D.lotusL.)。柿用罗田甜柿和前川次郎2个品种,
君迁子只用1个单株。验证优化条件时所用材料见
表1。
1.2 DNA提取与分离
按罗正荣等[8]的方法提取基因组 DNA,紫外分
光光度法和琼脂糖凝胶电泳法检测DNA质量。稀释
至所需浓度后,-20℃保存。
1.3 SRAP-PCR扩增
引物选择参考 Li等[1],Feriol等[3]和 Riaz等[4]的
果 树 学 报 2006,23(1):138~141
JournalofFruitScience
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2006.01.034
表2 SRAP所用引物序列
Table2TheprimersequencesusedinSRAPanalysis
编号Code 正向引物Forwardprimers 编号Code 反向引物Reverseprimers
Me1
Me2
Me3
Me4
Me5
Me6
Me7
Me8
5′-TGAGTCCAAACCGGATA-3′
5′-TGAGTCCAAACCGGAGC-3′
5′-TGAGTCCAAACCGGAAT-3′
5′-TGAGTCCAAACCGGACC-3′
5′-TGAGTCCAAACCGGAAG-3′
5′-TGAGTCCAAACCGGTAA-3′
5′-TGAGTCCAAACCGGTCC-3′
5′-TGAGTCCAAACCGGTGC-3′
Em1
Em2
Em3
Em4
Em5
Em6
Em7
Em8
Em9
5′-GACTGCGTACGAATTAAT-3′
5′-GACTGCGTACGAATTTGC-3′
5′-GACTGCGTACGAATTGAC-3′
5′-GACTGCGTACGAATTTGA-3′
5′-GACTGCGTACGAATTAAC-3′
5′-GACTGCGTACGAATTGCA-3′
5′-GACTGCGTACGAATTGAG-3′
5′-GACTGCGTACGAATTGCC-3′
5′-GACTGCGTACGAATTTCA-3′
编号
Number
样品
Genotype
学名
Scientificname
倍性
Polidylevel
脱涩类型
Losstypeofastringency
原产地
Source
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
富有 Fuyuu
松本早生 Matsumoto-wase
上西早生 Uenishi-wase
次朗 Jirou
前川次朗 Maekawa-Jirou
花御所 Hana-gosho
骏河 Suruga
晚御所 Oku-gosho
华柿一号 HuashiNo.1
西村早生 Nishimura-wase
新秋 Shinsyuu
阳丰 Youhou
湘西甜柿 Xiangxitianshi
雄株6MaletypeNo.6
罗田甜柿 Luotiantianshi
鄂柿一号 EshiNo.1
宝盖甜柿 Baogaitianshi
小宝盖柿 Xiaobaogaishi
四方甜柿 Sifangtianshi
小果甜柿 Xiaoguotianshi
郧阳冻柿 Yunyangdongshi
磨盘柿 Mopanshi
铜盆柿 Tongpenshi
君迁子 Dateplum
浙江柿 Chekiangpersimmon
油柿 Oilypersimmon
金枣柿 Jinzaoshi
老鸦柿 Diamondleafpersimmon
美洲柿 Commonpersimmon
DiospyroskakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.lotusL.
D.glaucifoliaMetc.
D.oleiferaCheng.
D.spp.
D.rhombifoliaHerosl.
D.virginianaL.
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=2x=30
2n=2x=30
2n=2x=30
2n=2x=30
2n=4x=60
2n=4x=60
PCNA
PCNA
PCNA
PCNA
PCNA
PCNA
PCNA
PCNA
PVNA
PVNA
PCNA
PCNA
PCNA
-
PCNA
PCNA
PCNA
PCNA
PCNA
PCNA
PCA
PCA
PCA
-
-
-
-
-
-
Japan
Japan
Japan
Japan
Japan
Japan
Japan
Japan
Japan
Japan
Japan
Japan
Japan
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
USA
表1 试验所用材料及编号
Table1The29Diospyrosspp.genotypesusedintheexperiment
注:金枣柿分类地位不详。PCNA完全甜柿,PCA完全涩柿,PVNA不完全甜柿,PVA不完全涩柿。
Note:ThetaxonomicstatusofJinzaoshiisunclear.PCNAPolination-constantnonastringent,PCAPolination-constantastringent,PVNAPolination-
variantnonastringent,PVAPolination-variantastringent.
方法。所选引物序列如表2所示。PCR扩增在PTC-
100PCR仪上进行。扩增程序:前5个循环为94℃变
性1min,35℃复性1min,72℃延伸1min30s,后30
个循环仅将复性温度升为 50℃。最后 72℃延伸
8min。反应体积25μL,将Mg2+、dNTPs、Taq聚合酶、
引物浓度等设置不同的浓度梯度 (详见结果与分析
部分),用Me6和Em2引物组合进行PCR扩增以确
定最佳反应体系。
1.4 SRAP-PCR产物检测
取1/5上样缓冲液(1份10×TBE电泳缓冲液,9
份去离子甲酰胺,加溴酚蓝至0.5%)与PCR产物混
合后在含有EB(0.5μg/mL)的1.8%琼脂糖凝胶上电
泳,在SYNGENE凝胶成像系统上观察和记录。
2 结果与分析
2.1Mg2+浓度
由图 1可见,当 Mg2+浓度在 1.5mmol/L时罗
田甜柿中无扩增产物;2.0mmol/L时谱带较弱;2.5
和3.0mmol/L时在供试3个基因型中扩增谱带均清
晰且稳定。Mg2+是Taq酶的激活剂,浓度太高时易产生
1期 郭大龙等:部分柿属植物SRAP-PCR反应体系的优化 139
果 树 学 报 23卷

图1 SRAP-PCR的Mg2+浓度梯度实验
M:DL2000marker;1,2,3分别代表罗田甜柿、前川次郎、君迁子(下
同);Mg2+浓度:a.1.5;b.2.0;c.2.5;d.3.0mmol/L
Fig.1ThetestofseriesofMg2+concentrations
intheSRAP-PCR
M:DL2000marker;1,2,3reprentedforLuotiantianshi,Maekawa-
Jirou,Dateplum,thesameasbelow;TheconcentrationsofMg2+:
a.1.5;b.2.0;c.2.5;d.3.0mmol/L
图2 SRAP-PCR的dNTPs浓度梯度实验
dNTPs浓度:a,0.1;b,0.2;c,0.3;d,0.4mmol/L
Fig.2ThetestofseriesofdNTPsconcentrations
intheSRAP-PCR
TheconcentrationofdNTPs:a,0.1;b,0.2;c,0.3;d,0.4mmol/L
图3 SRAP-PCR的Taq酶浓度梯度实验
Taq酶浓度:a,0.5;b,1.0;c,1.5;d,2.0u
Fig.3ThetestofseriesofTaqDNApolymerase
concentrationsintheSRAP-PCR
TheconcentrationofTaqpolymerase:a,0.5;b,1.0;c,1.5;d,2.0u
图4 SRAP-PCR的引物浓度梯度实验
引物浓度:a,0.2;b,0.3;c,0.4;d,0.5μmol/L
Fig.4Thetestofseriesofprimerconcentration
intheSRAP-PCR
Theconcentrationofprimer:a,0.2;b,0.3;c,0.4;d,0.5μmol/L
Ma1a2a3b1b2b3c1c2c3d1d2d3bp
2000
1000
250
100

Ma1a2a3b1b2b3c1c2c3d1d2d3
bp
2000
1000
500
250

Ma1a2a3b1b2b3c1c2c3d1d2d3bp
2000
1000
500
250

非特异性扩增,所以Mg2+浓度确定为2.5mmol/mL。
2.2 dNTPs浓度
图 2结果显示,不同 dNTPs浓度(0.1,0.2,0.3
和0.4mmol/L)扩增结果差异很大。在0.1mmol/L时
罗田甜柿和君迁子扩增产物谱带很弱,0.2mmol/L
和0.3mmol/L时扩增效果较好,在0.3mmol/L时谱
带更为清晰,但0.4mmol/L时谱带反而变弱。dNTPs
是PCR扩增反应的原料,必须达到一定浓度才能满
足要求,但过高也会与Taq酶竞争Mg2+,对扩增不
利。所以dNTPs浓度确定为0.2mmol/L。
2.3 Taq酶浓度
从图3可以看出,Taq酶在0.5u时罗田甜柿无
扩增产物,在1,1.5,2.0u时均有扩增产物,1u和
1.5u的扩增结果相似,但酶量较大时,易出现非特
异性扩增。所以从经济稳定考虑,确定Taq酶适宜用
量为1u/20μL。
2.4 引物浓度
由图4可见,在试验中引物浓度为0.3,0.4,0.5
μmol/L时均有扩增产物。0.2μmol/L时,扩增产物电
泳谱带均较模糊,在0.3和0.4μmol/L时谱带清晰
稳定。考虑到引物量过大易形成引物二聚体,所以确
定引物浓度为0.3μmol/L。
2.5 SRAP-PCR反应体系的确立
以上述所确定的条件,用引物 Me3和 Em3组
合在供试柿属植物29个基因型中扩增(图5)。由图
5可见扩增谱带清晰,且由此1对引物即可区分所
有供试材料。
综合考虑以上各种因素,从结果稳定性和经济
性出发,确立柿属植物SRAP-PCR最佳反应体系:
模板 DNA30ng,Bufer1×,Mg2+2.5mmol/mL,dNTPs
0.2mmol/L,Taq酶1u,引物0.3μmol/L,反应总体积
为25μL。
3 讨 论
SRAP是 2001年由美国加州大学戴维斯分校
Ma1a2a3b1b2b3c1c2c3d1d2d3bp
2000
1000
500
250
140
1期

图5 在供试29个柿属植物基因型中Me3和Em3引物组合的SRAP扩增谱带
试材编号见表1
Fig.5TheprofileofSRAPamplificationusingMe3andEm3primercombinationinthe29Diospyrosspp.genotypes
Thecodenumberareshowedintable1
bp
2000
1000
250
蔬菜系 Li等[1]发展的一种基于 PCR技术新的分子
标记。使用1个17碱基的正向引物和1个18碱基
的反向引物。正向引物的核心序列为14个碱基,核
心序列后为CCGG序列,反向引物在核心序列后为
AATT,正反向引物3都有3个选择性碱基。正向引
物中的CCGG序列瞄准ORF区的外显子;反向引物
中AATT序列瞄准启动子和内含子。在不同个体中
外显子、内含子和间隔子间长度变化较大,使用这2
个引物进行PCR扩增可产生丰富的多态性。
目前在SRAP-PCR中使用2种扩增程序。第1
种由Li等[1]提出,为让2个引物与DNA模板部分配
对,最初5个循环的退火温度设为35℃。后30个循
环的退火温度升高为 50℃。当退火温度一直设为
35℃时,扩增结果的重复性很差。第 2种是 Budak
等[9]所使用的程序:94℃变性1min;47℃退火1min;
72℃延伸1min(35个循环);72℃,5min。前者因为
后30个循环中所用退火温度比后者高,扩增结果更
稳定。本试验中采用第1种程序,获得了较理想的实
验结果。
作者发现反向引物序列对 SRAP-PCR扩增结
果的影响更大。在现有引物扩增结果不理想时,也可
自行设计SRAP引物,即在已有引物序列的基础上,
正反向引物3的3个选择性碱基可自行变化,但正
反向引物组合不应形成发夹结构或者二聚体。此外,
作者还发现模板 DNA浓度对扩增结果影响不大。
SRAP一般用PAGE电泳检测PCR产物,本试验与
Feriol等[10]同样用琼脂糖凝胶电泳检测,发现亦能
获得较丰富的多态性。本试验优化的SRAP-PCR体
系在柿属植物 6种 1类型共 29个基因型中均获得
清晰稳定的扩增结果。因此,SRAP可望在柿属植物
起源和进化研究中得到广泛应用。
参考文献 References:
[1]LIG,QuirosCF.Sequence-relatedamplifiedpolymorphism(SRAP),
anewmarkersystembasedonasimplePCRreaction:itsapplication
tomappingandgenetagginginBrassica[J].TheorApplGenet,2001,
103:455～461.
[2] BudakH,ShearmanRC,ParmaksizI,etal.Comparativeanalysis
ofseededandvegetativebiotypebufalograssesbasedonphuloge-
neticrelationshipusingISSRs,SSRs,RAPDs,andSRAPs[J].Theor
ApplGenet,2004,109:280～288.
[3]FeriolM,PicoB,NuezF.Geneticdiversityofagermplasmcolec-
tionofCucurbitapepousingSRAPandAFLPmarkers[J].TheorAppl
Genet,2003,107:271～282.
[4]RiazA,PoterD,StephenM.Genotypingofpeachandnectarine
cultivarswithSSRandSRAPmolecularmarkers[J].JAmerSocHort
Sci,2004,129:204～211.
[5]RuizJJ,GarciaMS,PicóB,etal.Geneticvariabilityandrelation-
shipofcloselyrelatedSpanishtraditionalcultivarsoftomatoasde-
tectedbySRAPandSSRmarkers[J].JAmerSocHortSci,2005,130:
88～95.
[6]LINZX,ZHANGXL,NIEYC,etal(林忠旭,张献龙,聂以春,
等).ConstructionofageneticlinkagemapforcotonbasedonSRAP
[J].ChineseSciBul(科学通报),2003,48:2063～2068.(inChinese)
[7]LiG,GaoM,YangB,etal.Geneforgenealignmentbetweenthe
BrassicaandArabidopsisgenomesbydirecttranscriptomemapping
[J].TheorApplGenet,2003,107:168～180.
[8]LUOZR,LIFF,CAILH(罗正荣,李发芳,蔡礼鸿).Molecular
SystematicsofChinaNativeNonastringentPersimmonBasedon
RandomAmplifiedPolymorphicDNA.[J].ActaHortSinica(园艺学
报),1999,26(5):297～301.(inChinese)
[9]BudakH,ShearmanRC,GaussoinRE,etal.Applicationofse-
quence-relatedamplifiedpolymorphismmarkersforcharacterization
ofTurfgrassspecies[J].HortScience,2004,39:955～958.
[10]FeriolM,PicoB,NuezF.Geneticdiversityofsomeaccessionsof
CucurbitamaximafromSpainusingRAPDandSBAPmarkers[J].
GenetResCropEvol,2003,50:227～238.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 91011121314151617181920212223242526272829
郭大龙等:部分柿属植物SRAP-PCR反应体系的优化 141