全 文 ：书云南大学学报(自然科学版)，2015，37(1):129～ 133 DOI:10．7540 / j．ynu．20140392
Journal of Yunnan University
ＲP－HPLC同时测定冷水花属 3种植物中
2种黄酮苷的含量*
甘秀海1，梁志远1，赵 超2，周 欣2
(1．贵州师范学院 化学与生命科学学院，贵州 贵阳 550018;
2．贵州师范大学 天然药物质量控制研究中心，贵州 贵阳 550001)
摘要:建立反相高效液相色谱法同时测定冷水花属湿生冷水花、冷水花、粗齿冷水花植物中木犀草苷和大
波斯菊苷 2种黄酮类化合物含量的方法．采用 Agilent ZOＲBAX SB－C18(250 mm×4．6 mm，5 μm)色谱柱，以乙腈
－0．2%乙酸水溶液为流动相进行洗脱，检测波长 350 nm，流速 0．8 mL·min－1，柱温 25 ℃ ．结果木犀草苷和大波
斯菊苷分别在 2．48～79．36 μg·mL－1、1．68～53．76 μg·mL－1范围内线性关系良好，木犀草苷平均回收率为 98．06
%，ＲSD为 1．11%;大波斯菊苷平均回收率为 99．18%，ＲSD为 0．98 %．所建立的冷水花 HPLC含量测定方法结果
准确可靠，可用于不同品种冷水花植物中木犀草苷和大波斯菊苷的含量测定．
关键词:冷水花;反相高效液相色谱;木犀草苷;大波斯菊苷;含量测定
中图分类号:Ｒ 917 文献标志码:A 文章编号:0258－7971(2015)01－0129－05
冷水花属(Pilea)植物共约 400 多种，中国有
80余种，贵州有近 30 种，是贵州苗族常用药材品
种之一，全草入药，具有利湿，清热，退黄的作用，用
于治疗黄疸，肺结核等［1］．目前关于该属植物化学
成分研究较少，因此，在化学成分不明确的前提下，
建立冷水花高效液相色谱分析方法是鉴别冷水花
真伪及品种的有效手段，但关于冷水花高效液相色
谱方面的研究未见报道．因此，在前期冷水花化学
成分及薄层鉴别研究［2－5］的基础上，利用高效液相
色谱法测定了冷水花属 3 种植物中木犀草苷和大
波菊苷的含量，为冷水花植物的鉴别、资源调查及
药材的质量控制奠定基础．
1 仪器与试药
Aglient1200高效液相色谱，包括 DAD 检测器
和自动进样器、Aglient化学工作站(美国安捷伦科
技有限公司) ;AL204 电子分析天平(瑞士梅特勒
托利多仪器有限公司);DZF－6020 真空干燥箱(杭
州蓝天化验仪器厂) ;DFY－200 高速万能粉碎机
(温岭市林大机械有限公司) ;电热恒温水浴锅(天
津市泰斯特仪器有限公司) ;
木犀草苷和大波斯菊苷对照品，本课题组自
制，纯度均大于 99%(HPLC 归一化法测定) ;冷水
花样品于 2012 年 9 月采自贵州省境内，经贵州师
范学院化学与生命科学学院朱富寿教授鉴定为湿
生冷水花(Pilea aquarum Dunn)、冷水花(Pilea no-
tate C．H．Wright)、粗齿冷水花(Pilea sinofasciata C．
J．Chen)全草．
流动相乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂
均为分析纯．
2 方法与结果
2．1 色谱条件 色谱柱为 Agilent Zorbax SB－C18
(250 mm×4．6 mm，5 μm);流动相:乙腈－0．2%乙
* 收稿日期:2014－08－05
基金项目:贵州省科学技术基金(黔科合 J字［2010］2213号) ;贵州省科技创新人才团队建设项目(黔科合人才团队(2011)4008);贵
州省应用化学特色重点学科(黔教科研发［2012］442号)
作者简介:甘秀海(1976－) ，男，湖南人，副教授，主要从事中药化学成分及质量控制方面的研究．E－mail:gxh200719@ 163．com．
通信作者:周 欣(1962－ )，女，贵州人，博士，教授，主要从事中药化学及中药质量控制方面的研究．E－mail:alice9800@ sina．com．
酸(体积比 18 ∶ 82) ，柱温 30 ℃;体积流量 0．8 mL /
min;检测波长 350 nm;进样量 10 μL．
2．2 溶液的制备
2．2．1 对照品溶液的制备 精密称取 15．5、10．5
mg木犀草苷和大波斯菊苷对照品，置 50 mL 容量
瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀分别得到质量浓度
为 0．31、0．21 mg /mL 的甲醇储备液，置于 4 ℃冰
箱，备用．
2．2．2 样品溶液的制备 分别取阴干后的冷水花
属 3种植物全株，粉碎，过 0．441 mm 筛，取粉末约
1．0 g，精密称定，置 50 mL 磨口三角瓶中加入 80%
甲醇 25 mL，加热回流 2 h，取出，过滤，回收溶剂，
用甲醇溶解并定容至 25 mL，摇匀，作为供试品溶
液．
2．3 线性关系的考察 分别精密量取上述储备液
溶液 0．2、0．4、0．8、1．6、3．2、6．4 mL，置于 25 mL容量
瓶中，加甲醇定容至刻度，得混合对照品溶液，按
“2．1”项下色谱条件精密进样 10 μL 测定峰面积．
以对照品质量浓度(μg·mL－1)为横坐标，峰面积
为纵坐标绘制标准曲线并进行回归计算，得木犀草
苷的回归方程为:Y = 82．741X+11．506，r = 0．999 9，
大波斯菊苷的回归方程为:Y = 49．31X－ 7．54，r =
0．999 8．结果表明木犀草苷、大波斯菊苷分别在
2．48～79．36 μg·mL－1、1．68 ～ 53．76 μg·mL－1范围
内峰面积与样品浓度具有良好的线性关系．
2．4 精密度实验 精密吸取混合对照品溶液 10
μL，在“2．1”项色谱条件下，重复进样 6 次，计算木
犀草苷、大波斯菊苷峰面积的 ＲSD 分别为 0．9%、
1．2%．
2．5 重复性实验 精密称取同一批湿生冷水花样
品 6份，按“2．2． 2”项下方法制备供试品溶液，按
“2．1”项下色谱条件测定，结果木犀草苷、大波斯菊
苷峰面积的 ＲSD 分别为 1．1%、1．5%，表明此方法
重复性良好．
2．6 稳定性实验 精密量取供试品溶液 10 μL，在
“2．1”项色谱条件下分别于 0、1、2、4、6、12、24 h 进
行测定．供试品中木犀草苷、大波斯菊苷峰面积的
ＲSD为 0．8%、1．0%，，表明样品溶液在 24 h 内稳
定．
2．7 加样回收率实验 精密称定 6 份已知木犀草
苷含量为 0．608 mg·g－1和大波斯菊苷含量为 0．415
mg·g－1的湿生冷水花样品约 1．0 g，分别精密加入
0．31 mg·mL－1木犀草苷和 0．21 mg·mL－1大波斯
菊苷对照品储备液各 2 mL，按“2．2．2”项下方法制
备样品溶液，按“2．1”项下色谱条件测定，计算回收
率，结果木犀草苷平均回收率为 98．06 %，ＲSD 为
1．11%;大波斯菊苷平均回收率为 99．18 %，ＲSD为
0．98%．见表 1．
表 1 木犀草苷和大波斯菊苷加样回收率测定结果(n=6)
Tab．1 Ｒecovery determination of luteoloside and cosmosiin(n= 6)
成分 m样 /g m初 /mg m加 /mg m测 /mg 回收率 /% 平均回收率 /% ＲSD /%
(木犀草苷)
(luteoloside)
1．0020 0．6092 0．6200 1．2156 97．81
98．06 1．11
0．9895 0．6016 0．6200 1．2065 97．56
0．9956 0．6053 0．6200 1．2089 97．35
1．0251 0．6232 0．6200 1．2437 100．08
0．9912 0．6026 0．6200 1．2042 97．03
1．0025 0．6095 0．6200 1．2203 98．52
大波斯菊苷
(cosmosiin)
1．0020 0．4158 0．4200 0．8253 97．50
99．18 0．98
0．9895 0．4106 0．4200 0．8251 98．69
0．9956 0．4132 0．4200 0．8295 99．12
1．0251 0．4254 0．4200 0．8456 100．05
0．9912 0．4113 0．4200 0．8310 99．93
1．0025 0．4160 0．4200 0．8352 99．81
031 云南大学学报(自然科学版) http:/ /www．yndxxb．ynu．edu．cn 第 37卷
2．8 样品测定 分别精密称取冷水花属 3 种植物
各 3批样品(过 0．441 mm筛)1．0 g．按“2．2．2”项下
方法制备样品溶液，按“2．1”项下色谱条件测定，对
照品及冷水花属 3 种植物样品色谱图见图 1．冷水
花属 3种植物样品中木犀草苷和大波斯菊苷含量
测定结果见表 2．
图 1 2种黄酮苷混合对照品(A:1:木犀草苷;2:大波斯菊苷)和冷水花属 3 种植物样品(B:湿生冷水花;C:冷水花;
D:粗齿冷水花)高效液相色谱图
Fig．1 HPLC chromatograms of chemical reference substances(A:1 is luteoloside，2 is cosmosiin )and samples(B is Pilea
aquarum，C is Pilea notate，D is Pilea sinofasciata)
表 2 冷水花属 3种植物样品中的木犀草苷和大波斯
菊苷的含量(n=3)
Tab． 2 The content ofluteoloside and cosmosiin in three
kinds of Pilea(n= 3) w /(mg·g－1)
成分
Pilea
aquarum
Pilea
notata
Pilea
sinofasciata
luteoloside 0．618 0．204 0．295
cosmosiin 0．328 0．106 0．043
3 讨 论
3．1 指标成分的选择 冷水花为荨麻科植物，具
有杀菌、抗炎、镇痛的药理作用［6－7］．木犀草苷具有
降低动脉粥样硬化和胆固醇的作用，同时能增强毛
细血管通透性作用［8］;大波斯菊苷的苷元芹菜素
具有抗炎症、抗肿瘤、降血压、抗菌抗病毒等作
用［9］．本课题组前期发现冷水花中含有木犀草苷和
大波斯菊苷，并具有较好的抗菌活性(另文报道)．
本研究发现冷水花属 3 种植物中均含有木犀草苷
和大波斯菊苷，且含量较大，因此有望作为冷水花
药材质量控制的指标性成分．
3．2 提取方法的选择 木犀草苷和大波斯菊苷为
黄酮苷类化合物，在醇中的溶解性较好．因此，在提
取方法的研究中分别考察了用不同浓度的乙醇、甲
醇作为提取溶剂采用超声、加热回流提取，结果发
现甲醇的提取率要高于乙醇，且加热回流的提取率
高于超声的提取率．故最后采用加热回流的提取方
法，分别考察了体积分数为 50%、60%、70%、80%、
90%的甲醇溶液为提取溶剂，结果发现 80%的甲醇
溶液提取所得色谱峰分离效果较好，且峰面积最
大．所以供试品以 80%的甲醇溶液加热回流提取．
3．3 色谱条件的优化 参考文献［10］的色谱条件
方法，利用 Dikma Diamonsil C18 柱，考察了甲醇－
0．2%磷酸(体积比 45 ∶ 55)流动相对色谱峰的影
响，结果发现冷水花和粗齿冷水花中的木犀草苷色
谱峰与杂质峰未能很好地分离且峰型对称性差．之
后分别考察了不同色谱柱的分离效果，发现 Agi-
lent ZOＲBAX SB－C18(250 mm×4．6 mm，5 μm)色
谱柱对样品的分离效果最好．另外以乙腈－0．2%乙
酸代替甲醇－0．2%磷酸为流动相，流速为 0．8 mL·
131第 1期 甘秀海等:ＲP－HPLC同时测定冷水花属 3种植物中 2种黄酮苷的含量
min－1，柱温 25 ℃时能够得到分离度较好的色谱
图;检测波长在 350 nm 下吸收峰最大．因此，确定
了最佳的色谱条件为采用 Agilent ZOＲBAX SB－C18
(250 mm×4．6 mm，5 μm)色谱柱，以乙腈－0．2%乙
酸水为流动相进行洗脱，检测波长 350 nm，流速
0．8 mL·min－1，柱温 25 ℃ ．
3．4 冷水花属 3种植物中 2 种黄酮苷含量的差异
由图 1及表 2可知，在湿生冷水花、冷水花、粗齿
冷水花 3种冷水花属植物中湿生冷水花中木犀草
苷和大波斯菊苷的含量均最大，两者的总含量分别
为冷水花和粗齿冷水花的近 3 倍．木犀草苷含量由
高到低的顺序为湿生冷水花＞粗齿冷水花＞冷水
花，大波斯菊苷含量由高到低的顺序为湿生冷水花
＞冷水花＞粗齿冷水花．由测定结果可推测湿生冷水
花的药理作用更优于冷水花和粗齿冷水花，外加湿
生冷水花的资源较后两者丰富，因此可考虑用湿生
冷水花代替冷水花应用于治疗黄疸、肺结核等疾
病，进而深层次开发湿生冷水花乃至冷水花属植物
的药用价值．
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231 云南大学学报(自然科学版) http:/ /www．yndxxb．ynu．edu．cn 第 37卷
HPLC simultaneous determination of two flavonoids in three kinds of Pilea
GAN Xiu-hai1，LIANG Zhi-yuan1，ZHAO Chao2，ZHOU Xin2
(1．The School of Chemistry and Life Science，Guizhou Normal College，Guiyang 550018，China;
2．The Ｒesearch Center for Quality Control of Natural Medicine，Guizhou Normal University，Guiyang 550001，China)
Abstract:To establish an ＲP－HPLC method for simultaneous determination of luteoloside and cosmosiin in
three kinds of Pilea，including Pilea aquarum Dunn，Pilea notate C．H．Wright and Pilea sinofasciata C．J．Chen．Ag-
ilent ZOＲBAX SB－C18(250 mm×4．6 mm，5 μm)column were used to analyze with acetonitrile－0．2% acetic
acid aqueous solution as mobile phases．The detective wavelength was at 350 nm．Flow rate was 0．8 mL /min．The
column temperature was 25 ℃ ．The standard curve of luteoloside and cosmosiin was linear in the range of 2．48—
79．36 μg·mL－1 and 1．68—53．76 μg·mL－1 respectively．The average recovery of luteoloside was 98．06%，ＲSD
was 1．11%，the average recovery of cosmosiin was 99．18%，ＲSD was 0．98%．The method is precise，reliable and
suitable for simultaneous determination of luteoloside and cosmosiin in three kinds of Pilea．
Key words:Pilea;ＲP－HPLC;luteoloside;cosmosiin;content detemination
331第 1期 甘秀海等:ＲP－HPLC同时测定冷水花属 3种植物中 2种黄酮苷的含量