全 文 ：山 东 农 业 科 学 2014，46(12):7 ～ 10 Shandong Agricultural Sciences
收稿日期:2014 －07 －24
基金项目:山东省农业良种工程重大课题“林木种质资源收集保护与评价”［鲁农良字(2010)6 号］资助。
作者简介:梁婷婷(1989 －)，女，山东聊城人，硕士研究生，研究方向为园林植物种质资源及遗传育种。E － mail:liangting20092108@
126． com
* 通讯作者:臧德奎(1966 －)，男，山东临沂人，教授，主要从事植物分类和种质资源研究。E － mail:zangdk@ sdau． edu． cn
梨属野生种质资源 SＲAP － PCＲ反应体系优化研究
梁婷婷，马燕，臧德奎*
(山东农业大学林学院，山东 泰安 271018)
摘 要:采用正交直观分析法和新复极差法对影响梨属野生种质资源 SＲAP － PCＲ 反应的 5 种因素
(Mg2 +浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq DNA 聚合酶、模板 DNA)4 个水平进行优化筛选。结果表明，优化后
的梨属 SＲAP － PCＲ反应体系为 25 μL，包括 10 × PCＲ buffer 2． 5 μL，2． 0 mmol /L Mg2 +，200 μmol /L dNTPs，
0． 4 μmol /L引物，1． 5 U Taq酶，60 ng模板 DNA。
关键词:梨属;SＲAP － PCＲ;正交直观分析法;新复极差法
中图分类号:S661． 201 文献标识号:A 文章编号:1001 －4942(2014)12 －0007 －04
Optimization of SＲAP －PCＲ Amplification System for Pyrus Wild Germplasms
Liang Tingting，Ma Yan，Zang Dekui*
(Forestry College，Shandong Agricultural University，Taian 271018，China)
Abstract Taking Pyrus wild germplasms as materials，four levels of five factors influencing SＲAP am-
plification system were optimized using the orthogonal design － direct analysis and Duncan’s new multiple range
tests． The five factors were as the concentrations of Mg2 +，dNTPs，primers，Taq DNA polymerase and tem-
plate DNA． The results showed that the optimized SＲAP reaction system was 25 μL and contained 10 × PCＲ
buffer 2． 5 μL，2． 0 mmol /L Mg2 +，200 μmol /L dNTPs，0． 4 μmol /L primers，1． 5 U Taq DNA polymerase
and 60 ng template DNA．
Key words Pyrus;SＲAP;Orthogonal design － direct analysis;Duncan’s new multiple range tests
目前相关序列扩增多态性(Sequence － related
amplified polymorphism，SＲAP)技术已在多种果
树、蔬菜以及大田作物中得以使用，并以其多态性
丰富、简单、易测序［1］等优点应用于遗传多样性
分析［2］、遗传图谱构建［3］、亲缘关系分析、种质资
源鉴定以及比较基因组学等诸多研究领域。
正交 PCＲ试验是基于统计学原理，研究各影
响因素不同水平间交互作用的一种方法［4］，具有
均衡分散和整齐可比的特点，可以简便、快速地找
到反应体系的最佳组合［5］。正交直观分析法正
是基于 PCＲ正交设计试验的一种结果判断方法，
即根据扩增条带的明亮度、特异性及数量的多少
进行不同的分数判断，分数越高则表明扩增效果
越好。新复极差法(SSＲ)是方差分析的进一步分
析，用于多种因素对某一结果影响的各个因素之
间的显著性分析。
目前基于正交设计法的 SＲAP － PCＲ 技术已
在辣椒、石榴等物种的相关研究中得以应用［6，7］。
本试验采用正交设计法对梨属野生种质资源
SＲAP － PCＲ反应体系进行优化，并通过正交直观
分析法和新复极差法，更直观快速地找到梨属
SＲAP － PCＲ反应体系的最佳组合，以期为梨属野
生种质资源的开发利用与保护提供基础技术支
持。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
供试材料为秋子梨(Pyrus ussuriensis)、褐梨
(Pyrus phaeocarpa)、河北梨(Pyrus hopeiensis)、杜
梨(Pyrus betulaefolia)、崂山梨(Pyrus trilocularis)。
4 月中旬于山东崂山、蒙山等地采集用于提取
DNA的幼叶样品，幼叶采集后硅胶干燥保存。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 试剂和仪器 DNA 扩增采用 Bio － Ｒad
PCＲ仪，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后在北京六
一 WD － 9403CS 型紫外仪上采集图像。试验所
用引物由 TaKaＲa 合成;用于 PCＲ 反应的 Taq
DNA聚合酶、Mg2 +、dNTPs和 Buffer 均购自 TaKa-
Ｒa公司。
1． 2． 2 样品基因组 DNA的提取 梨属样品基因
组 DNA 的提取采用改良的 CTAB 法［8］。基因组
DNA质量的检测采用琼脂糖凝胶电泳法和核酸
蛋白分析仪。
1． 2． 3 PCＲ 反应体系的正交试验 试验采用
L16(4
5)正交表设计，对影响扩增结果的 5 因素进
行 4 水平共 16 个组合的筛选，各体系模板均为秋
子梨样品，所选引物为随机Me5 /Em11(序列见表
3)组合，PCＲ反应体系总体积设为 25 μL，每组合
按其浓度计算加样量，并包含10 × PCＲ buffer 2． 5
μL，不足部分用超纯水补足。试验各因素水平见
表 1，正交试验设计见表 2。
表 1 SＲAP － PCＲ反应体系的因素与水平
水
平
Mg2 +浓度
(mmol /L)
dNTPs浓度
(μmol /L)
引物浓度
(μmol /L)
Taq聚合酶
(U)
模板 DNA
(ng)
1 1． 0 100 0． 1 0． 5 60
2 1． 5 200 0． 2 1． 0 70
3 2． 0 300 0． 3 1． 5 80
4 2． 5 400 0． 4 2． 0 90
PCＲ反应扩增程序:94℃预变性 5 min;94℃
变性 1 min，35℃退火 1 min，72℃延伸1 min，循环
5 次;94℃变性 1 min，50℃退火 1 min，72℃延伸 1
min，循环 30 次;72℃延伸 7 min，4℃保存。扩增
产物用 2%琼脂糖凝胶电泳分离，20 μL 上样，电
压 120 V电泳 90 min，电泳缓冲液为 1 × TAE，经
溴化乙锭(EB)染色后，在紫外仪上采集图像。
PCＲ扩增结果分析参照何正文等［9］的直观
分析法，即对各组合扩增出来的条带分别进行分
数判定，分数等级设为 3、2、1、0 分。判定评分后
再参照王军［7］、刘萌芽［11］等的方法，运用新复极
差法对试验数据进行分析。
表 2 SＲAP － PCＲ反应体系
L16(4
5)正交试验设计
编号
Mg2 +浓度
(mmol /L)
dNTPs浓度
(μmol /L)
引物浓度
(μmol /L)
Taq酶
(U)
模板 DNA
(ng)
1 1． 0 100 0． 1 0． 5 60
2 1． 0 200 0． 2 1． 0 70
3 1． 0 300 0． 3 1． 5 80
4 1． 0 400 0． 4 2． 0 90
5 1． 5 100 0． 2 1． 5 90
6 1． 5 200 0． 1 2． 0 80
7 1． 5 300 0． 4 0． 5 70
8 1． 5 400 0． 3 1． 0 60
9 2． 0 100 0． 3 2． 0 70
10 2． 0 200 0． 4 1． 5 60
11 2． 0 300 0． 1 1． 0 90
12 2． 0 400 0． 2 0． 5 80
13 2． 5 100 0． 4 1． 0 80
14 2． 5 200 0． 3 0． 5 90
15 2． 5 300 0． 2 2． 0 60
16 2． 5 400 0． 1 1． 5 70
1． 2． 4 体系稳定性检测 随机选用 6对引物组合
对褐梨、杜梨、河北梨、崂山梨 4 个野生种进行 PCＲ
扩增，经电泳观察结果。所用引物序列见表 3。
表 3 试验所用引物
正向引物 引物序列(5 － 3) 反向引物 引物序列(5 － 3)
Me1 TGAGTCCAAACCGGATA Em10 GACTGCGTACGAATTCAA
Me2 TGAGTCCAAACCGGAGC Em11 GACTGCGTACGAATTGAC
Me5 TGAGTCCAAACCGGTAA Em13 GACTGCGTACGAATTGCC
Me6 TGAGTCCAAACCGGTCA Em16 GACTGCGTACGAATTTCA
Em18 GACTGCGTACGAATTCAT
2 结果与分析
2． 1 基因组 DNA电泳检测
由图 1 可知，梨属样品基因组 DNA电泳检测
1 ～ 3:秋子梨;4 ～ 6:河北梨;7 ～ 9:崂山梨
图 1 部分梨属样品基因组 DNA检测结果
8 山 东 农 业 科 学 第 46 卷
结果良好，条带清晰明亮。核酸蛋白分析仪检测
结果显示，A260 /A280值皆在 1． 80 至 2． 00 之间，说
明该梨属样品基因组 DNA 提取纯度和浓度都较
高，符合 PCＲ试验的要求。
M:DL2000;1 ～ 16:试验编号同表 2，两次重复。
图 2 梨属 SＲAP － PCＲ正交设计的扩增结果
2． 2 SＲAP － PCＲ反应体系优化结果
试验中正交体系的 PCＲ 产物电泳结果见图
2。通过新复极差法［10］对图 2 中的 16 个组合(各
2 次重复)的扩增结果进行分析，最终得到各因素
不同浓度水平的总分值、平均分值和极差值，极差
分析结果见表 4。
2． 2． 1 Mg2 +浓度优化分析 Mg2 +是 DNA 聚合
酶的激活剂。适宜浓度一般在 0． 5 ～ 2． 5 mmol /L
之间。本试验中，Mg2 +浓度为 1． 5 mmol /L 时，平
均分值最低为 8． 75 分;为 2． 0 mmol /L时，平均分
值最高为 12． 25 分。说明梨属 SＲAP － PCＲ 反应
中 Mg2 +的适宜浓度为 2． 0 mmol /L。
2． 2． 2 dNTPs浓度优化分析 由表 4 可以看出，
dNTPs浓度为 100 μmol /L 时，反应产量低，平均
分值也低至 7． 50 分;浓度为 200 μmol /L时，平均
分值达最高值 12． 25 分。说明梨属 SＲAP － PCＲ
反应的适宜 dNTPs浓度为 200 μmol /L。
2． 2． 3 引物浓度优化分析 引物浓度为 0． 1
μmol /L时，产量及平均分值都最低，为 8． 25 分;
随引物浓度增加至 0． 4 μmol /L时，平均分值达最
高 12． 75 分。说明梨属 SＲAP － PCＲ 反应的引物
适宜浓度为 0． 4 μmol /L。
2． 2． 4 Taq DNA 聚合酶浓度优化分析 Taq
DNA聚合酶为 2． 0 U时，平均分值最低，7． 50 分;
为 1． 5 U 时，平均分值最高，11． 75;说明 1． 5 U
Taq DNA聚合酶浓度为梨属 SＲAP － PCＲ 反应的
适宜浓度。
2． 2． 5 模板用量优化分析 模板 DNA 用量为
80 ng时，平均分值最低为 8． 60 分，可能影响 PCＲ
反应的特异性;当模板 DNA 用量下降到 60 ng
时，平均得分增至最高值 12． 50 分。说明梨属
SＲAP － PCＲ反应的模板适宜用量为 60 ng。
综上分析后得到的最佳反应组合为 Mg2 +浓
度为 2． 0 mmol /L，dNTPs 浓度为 200 μmol /L，引
物浓度为 0． 4 μmol /L，Taq 聚合酶为 1． 5 U，模板
DNA用量为 60 ng。此组合即为体系中第 10 个
处理，由图 2 可知，该组合扩增结果清晰，条带明
亮、无重叠，适于进行 SＲAP － PCＲ试验。
参照刘萌芽等［11］的方法，分析了本试验中各
因素对 SＲAP － PCＲ 反应的影响程度。由表 4 可
知，dNTPs浓度的极差值最大，平均分高达 4． 75，表
明 dNTPs对梨属 SＲAP －PCＲ反应的影响最为显著;
次之为引物浓度;影响程度居中的因素为 Taq DNA
聚合酶;Mg2 +浓度和模板 DNA的影响程度最小。
表 4 各因素正交试验结果
水
平
Mg2 +浓度
总分 平均分
dNTPs浓度
总分 平均分
引物浓度
总分 平均分
Taq聚合酶
总分 平均分
模板 DNA
总分 平均分
1 37 9． 25 30 7． 50 33 8． 25 44 11． 00 50 12． 50
2 35 8． 75 49 12． 25 46 11． 50 45 11． 25 37 9． 25
3 49 12． 25 39 9． 75 36 9． 00 47 11． 75 43 8． 60
4 45 11． 25 48 12． 00 51 12． 75 30 7． 50 36 9． 00
极差 14 3． 50 19 4． 75 18 4． 50 17 4． 25 14 3． 50
2． 3 最优体系的稳定性检测
采用优化筛选后的 SＲAP － PCＲ 反应体系结
合随机抽取的 6 对引物组合(Me1 /Em16，Me1 /
Em18，Me2/Em10，Me5/Em10，Me6/Em10，Me6/
Em13)对褐梨、杜梨、河北梨、崂山梨 4 个野生种
进行扩增，结果显示，除第四对引物外，4 个梨品
种基因组均能扩增出数量不等的条带(图 3)，表
明该最优体系可满足相关试验的要求，有望为进
一步的研究提供基础。
9第 12 期 梁婷婷，等:梨属野生种质资源 SＲAP － PCＲ反应体系优化研究
1 ～ 4 分别代表野生褐梨、杜梨、河北梨、崂山梨;
A ～ F分别代表 Me1 /Em16，Me1 /Em18，Me2 /Em10，
Me5 /Em10，Me6 /Em10，Me6 /Em13
图 3 SＲAP优化体系的稳定性检测
3 结论与讨论
目前在梨属 SＲAP 的相关研究中，张妤艳
等［12］对其影响因素进行过筛选，但缺乏对模板
DNA浓度的分析;仅董星光等［1］利用正交优化试
验研究过梨 SＲAP － PCＲ 反应的最适体系。由于
PCＲ扩增的各种不确定性，体系中任何一项细微
差异都可能直接影响试验结果，所以随着野生种
质资源关注度的提高，有必要对梨属野生种质资
源 SＲAP － PCＲ 体系再优化，以确保资源开发研
究的顺利进行。
本研究采用正交直观分析法和新复极差法对
梨属野生种质资源 SＲAP － PCＲ 反应体系进行了
优化。最终得出反应的最优组合为:25 μL 的总
反应体系中含 10 × PCＲ Buffer 2． 5 μL，Mg2 + 2． 0
mmol /L，dNTPs 200 μmol /L，引物 0． 4 μmol /L，
Taq 酶 1． 5 U，模板 DNA 60 ng。利用该体系结合
随机抽取的 6 对引物组合对 4 份野生梨属材料进
行稳定性验证，扩增结果稳定。因此本研究获得
的梨属野生种质资源 SＲAP － PCＲ 优化体系，可
以为今后梨属野生资源的进一步研究提供一定的
应用基础。
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