全 文 ：李属坏死环斑病毒 CP基因在大肠杆菌中的
表达及其抗血清制备*
陈招荣　马云霞　范在丰　李怀方
(中国农业大学植物病理系植物病毒实验室　北京　 100094)
Prokaryotic　expression of the cp gene and antiserum preparation ofP runus necrotic ringspot virus. Chen
Zhaorong, M a Yunxia, Fan Zaifeng, LiHua ifang. (Phy tov irology Lab. P lan t Pa thology Dep.t China Ag ricultu ra l
Un iversity, Be ijing 100094, China)
Abstract　The coat pro tein (CP) gene ofPrunus necrotic ringspot virus (PNRSV)was amp lified by RT-PCR, and
liga ted to the expression vector pET-22b(+). The recomb inant p lasm id pET-WVMVCP was transfo rmed into E.
coli BL21(DE3) and then induced by IPTG. Itw as showed that the CP gene w as high ly expressed by SDS-PAGE
andWestern b lo t analysis. Themo lecularw eight of the recomb inant prote in w as about 29. 0 kDa. Antiserum w ith
high specificity w as produced after the rabbit w as immunized w ith purified recombinant prote in , and the titer w as
dete rm ined to be 1 /1024 by antigen coa ting plate-ELISA(ACP-ELISA). It prov ides the basic condition fo r se ro-
log ica l de tection of PNRSV.
Key words　Prunus necrotic ringspot virus, CP, Prokaryo tic expression, An tiserum , ELISA
摘要　本实验用 RT– PCR的方法获得李属坏死环斑病毒的 cp基因 ,并将其连接到表达载体 pET -
22b(+)上 ,得到重组质粒 pET-PNRSVCP , 转化大肠杆菌 BL21(DE3)后 , 用 IPTG 进行诱导表达 。 SDS-
PAGE和 Weste rn blo t分析结果表明 , cp基因在大肠杆菌中获得了高效表达 ,获得的融合蛋白分子量约为
29. 0 kDa。将该融合蛋白免疫兔子 ,获得 PNRSV特异性抗血清。酶联法(ELISA)测定的效价为 1 /1024。为
用血清学方法检测该病毒提供了基础条件 。
关键词　李属坏死环斑病毒　外壳蛋白　原核表达　抗血清　ELISA
中图分类号:Q789
　　李属坏死环斑病毒 (P runus necrotic ringspot vi-
rus, PNRSV )是一种在世界范围内分布的病毒 ,在
温带地区的李属和蔷薇属植物中的危害最为普遍
[ 1] ,该病毒寄主范围广 ,可以侵染李属的桃 、杏 、李 、
樱桃 、油桃以及观赏植物樱花 ,也可以侵染蔷薇属的
月季 、苹果和啤酒花等 [ 2 ～ 4] 。在李属果树上的一般
症状为植株叶片出现褪绿斑或褐色坏死斑 ,后来枯
斑脱落造成叶穿孔 ,少数叶背出现耳突 ,春季发芽延
迟 、萌发之前花芽和叶芽坏死 、节间处产生溃疡症
状 ,树势减弱 ,产量可降低 30% ～ 57%[ 5] 。
PNRSV也是我国的二类进境检疫性有害生物 ,
在我国北方部分核果类果树种植地区有该病毒病害
发生 ,且感染率较高 ,对北方的果树栽培是一个严重
的威胁[ 6 ～ 8] 。因此对其分布情况及发展规律进行调
查研究势在必行。在果树病毒病检测的方法中 ,免
疫技术特别是酶联免疫吸附分析方法 (ELISA法 )
是病毒鉴定 、分类以及检测的最重要的工具 ,也是应
用最广泛的方法之一。因此本实验利用分子生物学
方法在大肠杆菌中高效表达该病毒的外壳蛋白 ,以
纯化的蛋白免疫大白兔 ,制备专化性抗血清 ,为该病
毒的血清学检测提供了基础条件 。
1　材料与方法
1.1　材料
本实验室保存的 PNRSV毒源;PNRSV抗血清
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* 农业部 948资助课题(植物检疫性有害生物检疫试材及技术 2001 - 249)
通讯作者:lihuaifang@126. com
收稿日期:2005 - 08 - 29
购于 Agd ia公司;原核表达载体 pET-22b( +),大肠
杆菌菌株 DH5α和 BL21(DE3)由本实验室提供;回
收试剂盒购自博大泰克公司;TPTG、NBT、BC IP试剂
购自 Sigma公司 , λDNA /EcoRⅠ +Hind Ⅲ Marker
和工具酶购自大连宝生物公司;标准分子量蛋白购
自上海升正生物技术公司;M-MLV为 Promega公司
产品。引物根据本实验室已测定的 PNRSV的 cp基
因的序列设计 ,由北京赛百盛公司合成 ,上游引物
PNRSV1A(5’ -CCG AAG CTT ATG GTT TGC CGA
ATT TGC AA-3’ 划线处为 Hin dⅢ酶切位点)和下游
引物 PNRSV1B(5’ -TTG CTC GAG GAT CTC AAG
CAG GTC CTC-3’ 划线处为 XhoⅠ酶切位点 )。
1.2　提取植物总 RNA以及病毒 cp基因的扩增
感病樱桃叶片总 RNA的提取用 TRIzo l试剂盒 ,
提取物溶解于 DEPC处理的水中 , - 70℃保存备用 。
以提取的总 RNA为模板 ,用引物 PNRSV1B进行反
转录 , 42℃反应 1h。之后以反转录产物为模板 ,用
宝生物公司的 Ex Taq DNA聚合酶进行 PCR扩增 。
反应条件为:94℃变性 3m in, 94℃ 30 s, 60℃ 30s,
72℃ 50s, 35个循环 , 然后 72℃延伸 10m in。 RT-
PCR扩增 PNRSV cp基因 ,得到约 675bp的片段 ,包
含了 cp基因全长。
1.3　含 cp基因的原核表达载体的构建
PCR产物用 1%的琼脂糖进行电泳 ,与预期大
小相符的条带经 DNA回收试剂盒回收并以 HindⅢ
和 XhoⅠ双酶切 ,质粒 pET-22b(+)同样用 Hind Ⅲ
和 XhoⅠ双酶切。将经酶切处理的 PCR产物及载
体进行连接 ,转化大肠杆菌 DH5α。经 PCR扩增和
酶切筛选出的重组子进行测序以验证阅读框架的正
确性。
1.4　cp基因诱导表达及 SDS-PAGE分析
将读框正确的重组子及 pET-22b (+)转化大
肠杆菌 BL21,挑取单菌落于 3mL LB液体培养基中
(含氨苄青霉素 60μg /mL), 37℃振动培养过夜后 ,
按 1:100稀释到新鲜的 LB液体培养基中 (含氨苄
青霉素 60μg /mL),振荡培养至 OD600达到 0. 4 ～
1.0,加入 IPTG至终浓度为 1mmo l /L,继续于 37℃
培养 6 ～ 8h。离心收集菌体 ,加入 1 /10体积样品缓
冲液 ,震荡悬浮 , 100℃煮沸 5m in,用 12%的胶进行
SDS-PAGE分析 ,浓缩胶电压为 8V /cm ,分离胶为
15V /cm。考马斯亮蓝 R-250染色 1h后 ,室温摇床
上脱色 3h。
1.5　表达产物的W estern blot检测及纯化
表达产物的Western blot分析同 Towb in[ 8]的方
法 ,以实验室保存的 PNRSV的抗体为一抗 ,碱性磷
酸酯酶标记的 A蛋白为二抗 ,最后用 NBT /BC IP显
色。按照 Hage r等[ 9]的方法对凝胶染色后 , 从中切
下目标条带 , 按 1∶1的比例(W /V)加入 PBS缓冲液
(8g N aC l, 0.2g KC l, 1.97g N a2HPO 4 12H2O ,
0.24g KH2 PO4 , 定容至 1L, pH 7.4)于冰浴中研磨 ,
12000g离心 10m in, 取上清 , - 20℃保存。用紫外
分光测定法测定回收蛋白含量 ,测定回收产物在
260nm和 280nm的吸光值 ,根据计算公式算出蛋白
质浓度(mg /m l)=1.45OD280 - 0.74OD260。
1.6　抗血清的制备以及效价的测定
先在实验兔耳静脉取血 2mL制备少量正常血
清 ,作阴性对照 。向纯化产物中加入等体积的福氏
不完全佐剂进行乳化 ,免疫 1只德国大白兔 。分 5
次注射:第 1次肌肉注射结合皮下注射 ,第 2次肌肉
注射结合皮下注射 ,第 3、4次耳静脉注射 (纯化的
蛋白不加佐剂 ),第 5次肌肉注射 ,每次免疫剂量约
为 0.1mg,每隔 5天注射 1次 。最后 1次注射 7天
后静脉少量采血测定效价 ,然后每周耳静脉大量取
血约 20m l,共取 3次 ,制备的抗血清加入 0.02%的
叠氮化钠 , - 20℃保存。将抗血清进行一系列稀释
后 ,以发病樱桃叶片汁液作为抗原包板 , 用 ACP-
ELISA方法测定血清的效价。
2　结果
2.1　提取植物总 RNA及 cp基因的扩增
对所提取的总 RNA进行 RT-PCR,扩增产物经
1%琼脂糖凝胶电泳检测 ,含有 675bp大小的特异性
核苷酸片段符合预期大小。
2.2　含 cp基因原核表达载体的构建与验证
扩增得到的 DNA片段连接到表达载体 pET-
22b(+),得到重组质粒 pET-PNRSVCP。将重组质
粒用 Hin dⅢ 和 XhoⅠ双酶切 ,得到 675bp大小的条
带 ,与 cp基因的大小一致 ,再经序列测定证明 ,以正
确的阅读框架连接到表达载体上 。
2.3　cp基因的诱导表达产物 SDS-PAGE和Western
b lo t分析
将 pET-PNRSVCP转化大肠杆菌 BL21菌株中 ,
并进行 IPTG诱导表达 , SDS-PAGE后 ,考马斯亮蓝
染色结果表明:含 pET-PNRSVCP的菌株特异地产
生了一分子量为 29.0 kDa的条带 ,此条带大小与预
期相符。以购买的 PNRSV抗血清作为一抗进行
Western b lo t分析 ,仅此条带有特异性的显色反应 ,
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而其它条带均无反应 (图 1),证明此条带即为在大
肠杆菌中诱导表达的融合蛋白 。
图 1　表达产物的 SDS-PAGE和 W estern blot分析
M , 蛋白分子量标准;1、 2, IPTG诱导带有表达载体 pET-22b
(+)的大肠杆菌表达蛋白的 SDS-PAGE结果;3、4 IPTG诱导带
有重组质粒 pET-PNRSVCP的大肠杆菌表达蛋白的 SDS-PAGE结
果;5, pET-PNRSVCP表达蛋白的 W es tern b lot分析结果
2.4　表达产物的纯化及定量
将诱导的菌液进行 SDS-PAGE ,按照 H ager等的
方法对凝胶染色后 ,对 29.0kD的条带切胶回收 ,得
到纯度较高的表达产物。测定所纯化的表达产物的
浓度 , 测得 OD260 =0.5117和 OD280 =1.0380 ,计算
得到蛋白含量为 0.274mg /mL。
2.5　抗血清的制备和效价测定
将纯化的蛋白免疫大白兔 ,获得了 PNRSV的特
异性抗血清 ,以感病的樱桃叶片汁液为抗原进行
ACP-ELISA测定 ,结果表明:抗血清稀释 1024倍后
仍能表现明显的阳性反应 ,同时与健康的樱桃叶片
汁液没有明显的血清学反应。
3　讨论
由于许多果树病毒无草本繁殖寄主 ,且树体内
病毒含量非常低 ,因此要提纯病毒并制备高效价的
抗血清非常困难[ 11] 。 PNRSV虽然可以侵染一些草
本植物如黄瓜 、烟草等 [ 3] ,但是由于其病毒粒子很
不稳定 ,在未稀释的植物汁液中其侵染活性只能保
持几分钟的时间 ,接种成功率较低 ,而且病毒粒子不
易提纯 [ 12] 。此外与传统的以提纯的病毒制备抗血
清方法相比 ,本研究所用的方法具有许多优点 ,如:
只需将含有重组质粒的菌株诱导表达即可获得大量
重组蛋白作为抗原 ,而繁殖寄主提纯病毒需要的周
期长;纯化表达的重组蛋白不含寄主植物的任何成
分 ,所制取的抗血清特异性强 ,少量的重组蛋白即可
获得效果较好的抗血清 ,而用提纯的病毒来制取抗
血清则抗原用量较大 ,对一些在寄主体内含量较低
或较难提纯的病毒特别是果树病毒来讲 ,要获得此
数量的病毒是比较困难的 。因此克隆病毒的 cp基
因并使之在大肠杆菌中表达 ,然后提取纯化目标蛋
白制备抗血清对于果树病毒病而言是一种更准确高
效 、快速的途径 。
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