全 文 ：中国农业大学学报　2008 , 13(2):25-29
Journal o f China Ag ricultur al Unive rsity
苹果和梨属间杂交及其幼胚挽救研究
孙 亮　冷 平
(中国农业大学 农学与生物技术学院 , 北京 100094)
摘　要　以富士苹果为母本 、` 金二十世纪 梨和京白梨为父本进行属间杂交试验 , 以未授粉正常管理的果实为对
照对授粉果实进行生物学观察 ,并对幼胚进行挽救培养。结果发现 ,以`金二十世纪 梨为父本的杂交果坐果率为
4.83%, 以京白梨为父本的未坐果;杂交果实前期发育快 ,果实大于对照 , 后期发育慢 , 果实小于对照;果形指数前
期小于对照 ,后期大于对照。授粉后 60 d 杂种幼胚先接种在 MS + 6-BA 2.0 mg/ L +GA 3 2.0 mg/ L +蔗糖 50
g/ L+琼脂 7 g/ L 培养基上 , 接种后先置于冰箱中 4℃暗培养 60 d 再置于 25 ℃条件光照培养 ,待子叶转绿膨大或
胚根伸长后 ,转接到 MS + 6-BA 2.0 mg/ L + NAA 0.01 mg/ L +蔗糖30 g/ L +琼脂 7 g/ L 培养基上培养 7 ～
10 d;没有抽生芽点的合子胚转移至 MS + 6-BA 4.0 mg/ L + NAA 0.01 mg/ L +蔗糖30 g/ L +琼脂 7 g/ L 培
养基上 40 ～ 60 d 可以生芽。
关键词　苹果;梨;远缘杂交;胚挽救;果实发育
中图分类号　S 661.1;S 661.2;S 334.3　　　文章编号　1007-4333(2008)02-0025-05　　　文献标志码　A
Apple-pear hybrid and in v itro rescue culture of zyg otic embryo
SUN Liang , LENG Ping
(College of Agronomy and Biotechnology , China Agricultural University , Bei jing 100094 , China)
Abstract　In order to obtain new varieties , apple` Fuji and two cultivars of pear` Jingbaili and`Gold Nijuseiki were
used for intergeneric hybridization.The fruit-set-rate of` Fuji ×` Gold Nijuseiki was 4.83%, but the`Fuji ×` Jingbai-
li produced no fruits.Thesize of `Fuji ×` Gold Nijuseiki fruits was bigger than that of the control 17 days after polli-
nation, but was smaller 24 days after pollination.The trend for the fruit shape of `Fuji ×`Gold Nijuseiki was differ-
ent from that of size.Immature embryos were excised 60 days after polli nation and placed on MS containing 6-BA 2.0
mg/ L+GA3 2.0 mg/ L , 50 g/ L sucrose and 7 g/L agar.These were chilled at 4 oC in the dark for 60 days and then
cultured at 26±1 ℃ under approximately 3000 l x fluorescent illumination for a 16 h photoperiod.Whenembryos germi-
nated , we placed them on MS+6-BA 2.0 mg/ L + NAA 0.01 mg/ L, 30 g/ L sucrose and 7 g/ L agar.The medium,
MS+6-BA 4.0 mg/ L+NAA 0.01 mg/ L, 30 g/ L sucrose and 7 g/L agar , was used for embryos whichdid not germi-
nate in the media above.And within 40 days , the embryos developed shoots.
Key words　apple;pear;intergeneric hybridization;rescue culture;frui t developmen
收稿日期:2007-10-19
作者简介:孙亮 ,硕士研究生;冷平 ,教授 , 通讯作者 ,主要从事果树生物技术育种研究 , E-mail:Leng.p@263.net
　　我国是世界苹果生产第一大国 ,2005年产量达
到 2 400万 t ,占世界苹果总产量的 35.8%[ 1] 。经
过多年引种实践 ,富士系苹果以其优质 、高产 、耐贮
运等一系列优良特性成为苹果中的主栽品种;但随
着经济发展和人民生活水平的不断提高 ,市场需要
更高品质的果品 。苹果种间杂交难以育出超越现
有富士系的优良品种。苹果 、梨远缘杂交最早于
1952年报道 ,以`丰产 (Fe rtility)梨为母本 ,以不知
名品种和`Craw ley Beauty 苹果为父本 ,授粉前后
喷施 0.04 mg/ L 的 β-萘乙酸 ,得到 16 粒杂交种
子[ 2] 。20世纪 80 年代日本学者用日本梨(Pyrus
serot ina Rehd.var.cul ta Rehd.)与苹果(Malus
×domest ica Borkh.)进行杂交 ,但是杂交种子自
然条件下在萌芽后 6 个月内全部死亡 [ 3] 。近来有
中 国 农 业 大 学 学 报 2008 年 第 13 卷　
学者发现高温培养和辐射诱变可以克服杂交后代
种子凋亡 ,该文献报告说 ,昼间 34℃、夜间 30℃的
高培养温度 ,可以使 80%的日本梨(Pyrus p yri fo-
lia Nakai)和苹果(Malus × domest ica Bo rkh.)杂
交组培苗正常生长到18 d[ 4] ;150 Gy 伽玛射线照射
日本梨(Pyrus py ri folia Nakai)和苹果(Malus ×
domest ica Bo rkh.)杂交组培苗 ,可以得到在 25℃正
常生长的杂种植株[ 5] 。我国学者在生产实践中也
对苹果和梨远缘杂交方法进行了尝试 ,通过嫁接和
胚挽救得到了一些有生活力的杂交后代[ 6-9] 。虽然
苹果 、梨远缘杂交有很多尝试 ,但目前由于培养条
件不适合及杂种凋亡等原因还没有建立起较为适
合的挽救培养体系 。本试验旨在探讨建立苹果 、梨
远缘杂交种质创新技术体系。
1　材料与方法
1.1　试验材料
本试验在北京市昌平区崔村果园进行。选择
树龄 10年 ,生长健壮的富士苹果(Malus domest ica
cv.Red Fuji Spur)为母本 ,以中国农业大学科学园
3年生`金二十世纪 梨(Pyrus py ri folia cv.Gold
Ni juseiki)和京白梨(Pyrus ussuriensis Maxim)为
父本 。于大蕾期(2007-05-08)取得父本`金二十世
纪 梨和京白梨花药 ,阴干后取花粉备用 。
1.2　试验方法
1)授粉。授粉于 2007-05-12在崔村果园进行。
选择树冠中层处于大蕾期生长良好的富士苹果花 ,
去雄后分别点授`金二十世纪 梨和京白梨花粉 ,套
袋并挂牌标记 。共对 700 朵花进行授粉 ,其中以
`金二十世纪 梨为父本的 600朵 ,以京白梨为父本
的 100朵。同时摘除周围没有授粉花蕾 ,授粉后 1
周去袋。
2)杂交幼果生物学观察 。于授粉后 1周开始 ,
每隔 7 ～ 10 d对杂交幼果进行生物学观察 ,以同一
果园中未杂交 ,正常管理的苹果为对照。观察包括
果形 、果皮颜色 、果点 、果柄 ,并统计其坐果率和结
子率 。
坐果率计算公式:
坐果率(授粉后 15 d)=杂交幼果数/授粉花朵
数×100%
幼果平均结子数(授粉后 60 d)=杂交幼果中
正常种子数/总杂交幼果数;
授粉结子率=幼果平均结子数×坐果率 。
3)合子幼胚挽救培养 。于授粉后 30和 60 d取
杂交幼种与对照种子观察 ,选择合适的接种时间。
取种子前用洗涤剂对果实进行全面清洗 ,清洗时除
去果柄 ,挖去果萼 、果柄基部 ,然后流水冲洗 0.5 h ,
再用 75%(体积分数)酒精浸泡消毒 10 min , 30%
(体积分数)的次氯酸钠溶液浸泡消毒 25 min ,超净
台内剥取种子。
外植体的处理分为 2 类:授粉后 30 d所取幼
种采用直接接种 、剥去种皮接种 、完整幼胚接种 3
种处理 , 每个处理接种 1粒 ,2个重复;授粉后 60 d
所取幼种 ,采取完整幼胚接种 、完整幼胚接种后先
放在冰箱中 4℃暗培养 60 d 后再恢复正常培养条
件(温度为(25±2)℃,光周期为 16 h 光照 , 8 h 黑
暗 ,光强为 3 000 lx)、幼胚切去一半子叶接种 ,以上
3个处理每个处理组合接种 1粒 ,3个重复(表 1)。
表 1　富士苹果×` 金二十世纪 梨杂交种子萌发培养方法及效果
Table 1　Different methods and effects of embryo re scue cultur e of `Fuji ×` Gold N ijuseiki
取种时间 培养方式 培养基组合 成苗数/出芽数/种子数 外植体状态
授粉后 30 d 完整幼种 ① 0/ 0/2 10 d后褐化 , 死亡。
剥种皮 ,保留胚乳 ①③④ 0/ 0/2 胚增大 ,子叶转绿 , 后期生长缓慢。
完整幼胚 ①③ 0/ 0/2 生长停滞 ,子叶不转绿。
授粉后 60 d 完整幼胚 ①③④ 1/ 1/3 胚增大 ,子叶转绿 , 后期生长迅速 ,抽生芽 ,能形成植株。
②③④ 0/ 0/3 胚增大 ,子叶转绿 , 未形成芽点。
幼胚切去一半子叶 ①③④ 0/ 1/3 胚增大 ,子叶转绿 , 后期生长缓慢 ,有芽点形成。
②③④ 0/ 0/3 胚增大 ,子叶转绿 , 后期生长缓慢 ,未形成芽点。
完整幼胚置于 4℃暗培养
2 个月后恢复正常条件
①③ 3/ 3/3 胚增大迅速 ,子叶转绿快 , 后期生长迅速 , 能抽生
芽 ,能形成植株。
　　注:培养基 ①MS + 6-BA 2.0 mg/ L +GA3 2.0 mg/ L;②MS + 6-BA 2.0 m g/ L;③MS + 6-BA 2.0 m g/ L + NAA 0.01 mg/ L;
④M S + 6-BA 4.0 mg/ L+NAA 0.01 mg/ L 。
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　第 2 期 孙亮等:苹果和梨属间杂交及其幼胚挽救研究
　　以 MS 为基本培养基 ,分别添加 6-BA 、NAA 、
GA 3 。
萌发培养基:
①MS +6-BA 2.0 mg/L +GA 3 2.0 mg/L ;
②MS +6-BA 2.0 mg/L 。
待子叶转绿 、膨大或胚根伸长后将外植体转移
到继代培养基:
③MS +6-BA 2.0 mg/L +NAA 0.01 mg/L。
对于发育缓慢 ,没有芽点产生的外植体 ,将其
转移到催芽培养基:
④MS +6-BA 4.0 mg/L +NAA 0.01 mg/L
当出现芽点或形成小植株时用③号培养基每
10 ～ 15 d继代 1次。
蔗糖质量浓度在子叶未转绿时为 50 g/ L ,子叶
转绿后为 30 g/ L ,琼脂为 7 g/L ,光强为 3 000 lx ,
温度为(25±2)℃,光周期为 16 h光照 ,8 h 黑暗 。
2　结果与分析
2.1　授粉后幼果及其幼种的生物学特性
1)坐果率。以`金二十世纪 梨花粉授粉 600
朵富士苹果花 , 得到杂交幼果 29 个 , 坐果率为
4.83%。以京白梨为父本的杂交组合坐果率为 0。
2)杂交幼种类型 、形态及结子率。富士苹果×
`金二十世纪梨杂交组合所得杂交幼果中 ,共有幼
种240粒。其中发育正常的 21粒 ,败育 15粒 ,不发
育 204粒。幼果平均结子数为 0.72 粒 ,最终结子
率为 3.48%。
在每个杂交幼果中都发现有不发育种子与败
育的幼种 ,平均每个果实 7.5粒 。不发育种子大小
在 1.5 ～ 2.0 mm ,呈红褐色 ,质地坚硬。从授粉后
30 d起在杂交幼果中发现有中途败育的种子(共 3
粒),中途败育幼种比正常幼种略小 ,中间凹陷 ,胚
退化 ,只残留少量胚乳。中途败育幼种在授粉 60 d
后较多。发育正常的杂交幼种与对照幼种形态上
没有明显区别。
3)杂交幼果的生长发育 。观察发现 ,杂交幼果
在发育过程中 ,果皮颜色 、果点 、果柄与对照果实没
有明显差异;而果实大小 、果形指数则与对照果实
有明显差异 。
从图 1可以看出 ,授粉后 17 d杂交幼果比对照
果大;而随着果实的生长 ,对照果生长速度逐渐加
快 ,在授粉后 30 d时 ,对照果已经明显大于杂交幼
果 ,并且随着果实生长时间的延长差异变大 。授粉
后 70 d ,对照果比杂交幼果平均纵径大 4.5 mm ,平
均横径大 7.8 mm ;杂交幼果和对照果的果形指数
随着时间的延长而降低 ,授粉后 17 d ,对照果果形
指数大于杂交幼果;但授粉后 24 d ,对照果的果形
指数迅速降低 ,低于杂交幼果 ,并随时间延长继续
降低 。杂交幼果果形指数从授粉后 17 ～ 45 d持续
降低 ,但在授粉 45 d后 ,基本没有变化 。
图 1　杂交幼果生长发育动态及果形指数变化
Fig.1　Changes in f ruit site and shape o f hybrid fruits
　
2.2　杂交幼胚挽救培养
1)培养时期选择。在对杂交幼果与对照果进
行生物学特性观察时发现 ,授粉后 30 d左右的幼种
胚乳较多 ,胚较小且幼嫩 ,分离胚在操作上困难 ,而
且培养时不易生长 。授粉后 60 d 左右的幼种胚乳
较少 ,胚较大且硬实 ,取胚操作方便 ,而且培养时生
长状态较好;同时 ,发现较多中途败育幼种 。所以
挽救培养时期选择在授粉后 60 d左右 。
2)培养方式筛选 。授粉后 30 d ,完整接种处理
的幼种全部褐化;剥去种皮 ,保留胚乳接种的幼胚
生长变大 ,但是后期生长缓慢 ,子叶不变绿;完整幼
胚接种 ,胚生长几乎停止 ,子叶不变绿 。授粉后 60
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中 国 农 业 大 学 学 报 2008 年 第 13 卷　
d ,完整幼胚接种处理子叶转绿变肥大 ,有 1 粒种子
抽生芽 ,形成小植株;而幼胚切去一半子叶处理表
现不如完整幼胚接种 ,虽然子叶转绿 、变大 ,但生长
缓慢 ,没有抽生芽 。综上 ,选取授粉后 60 d 左右发
育较为成熟的幼种以完整幼胚方式接种 。
3)培养基及培养条件筛选。培养时发现(表
1),正常培养条件下幼胚在①、②2种培养基中都可
以生长 ,子叶转绿变厚;但培养基 ①成芽情况和胚
根生长情况好于 ②。子叶转绿后在培养基③中可
以抽生芽 ,并形成小植株 。没有抽生芽的幼种或幼
胚在培养基④中培养 40 ～ 60 d 可以产生芽点。完
整幼胚接种于①后放于 4℃暗培养 2个月再恢复正
常培养条件 , 幼胚迅速萌发转绿 、抽生芽 、形成植
株。试验中同时发现 ,不同幼胚个体间差异很大 ,
有些在①、②培养基中 7 ～ 10 d转绿 、子叶膨大;有
些 20 ～ 30 d转绿 、子叶膨大;而且后期生长速度也
存在着差异。因此 ,用培养基 ①进行前期培养 ,完
整幼胚接种 ,先于 4℃暗培养 2个月再恢复正常培
养条件;当子叶转绿膨大后转入培养基③生芽 、壮
苗;对于在培养基③发育缓慢的幼种 ,接种至培养
基④或 6-BA 含量更高的培养基中诱导生芽;每 10
～ 15 d用培养基③继代一次。
3　讨　论
1)苹果 、梨属间杂交试验中 ,国外学者以往研
究多以梨为母本 ,苹果为父本[ 2-5] ,结果发现杂交后
代缺乏生活力。具体表现为:种子需要特殊处理
(伽马射线照射), 生长需要特殊培养条件(如高
温),杂交幼苗中途凋亡。我国已报道的多数苹果 、
梨属间远缘杂交[ 6-9] 及本试验都以苹果为母本 、梨
为父本 ,结果发现杂交后代生活力较强 ,种子不经
特殊处理接种于合适培养基即可在 25℃正常生长。
这说明苹果 、梨属间杂交 ,以苹果为母本 ,杂种的生
活力更高 。在其他种类果树远缘杂交试验中也有
类似现象发生 ,核果类远缘杂交过程中发现以自交
亲和性强 、自然坐果率高及丰产性强的树种或品种
为杂交母本 ,容易克服远缘杂交的不亲和性[ 10] 。这
种现象被认为是由植物合子胚形成过程中父母本
对其贡献不同造成的 ,一般认为母本对于后代的影
响更大 ,而其确切原因尚无报道 ,在今后的远缘杂
交试验中值得注意与研究 。
2)种子不单是营养物质的运输中心 ,也是果实
中激素产生的中心 。苹果果实发育尤其在幼果期
对种子有着较强依赖性[ 11] 。以往研究将这种依赖
性归因于种子在发育过程中产生的促进生长类激
素(IAA 、GA 3 、Zt等)对周围组织刺激 ,而一般认为
种子在败育发生时促生长类激素水平会下降 ,抑制
生长类激素如 ABA 含量会生高 ,最终影响果实发
育[ 12-13] ;但是也有因杂交种子生长过快导致发育不
协调进而产生败育的报道[ 14] 。本试验在早期(授粉
后 30 d)及中期(授粉后 60 d)杂交幼果中都发现有
大量不发育与中途败育种子;但与此相矛盾的是 ,
在对幼果发育观察中发现 ,在授粉后 17 d杂交幼果
大于对照 ,授粉 24 d后杂交幼果小于对照 。由此推
测 ,杂交幼种早期可能发育较为正常 ,甚至发育速
度较快 ,但是随着发育进程中一些阻碍发育因素的
产生 ,最终导致种子败育。本试验发现的不发育种
子有可能是早期败育种子 ,但根据以往研究也有可
能是不发育的胚珠[ 14] 。关于杂交幼种败育成因及
对幼果发育影响有待于进一步研究 。
3)许多果树幼胚挽救都要打破幼胚的休眠状
态。已报道的处理方法包括低温处理 、培养基中添
加GA 3 和切去幼胚子叶等方式[ 15] 。本试验发现苹
果和梨属间杂交幼种的休眠状态较对照更难被打
破。切去幼胚子叶对打破休眠没有影响;而培养基
中添加GA 3 可以打破杂交幼种休眠 ,但是这种处理
的幼种前期反应较为迟缓。通过添加 GA 3 和低温
处理的种子前期子叶转绿迅速 、萌发整齐 。这说明
低温处理对于打破杂交幼胚休眠不是必需的 ,但是
低温对提高萌发整齐度及促进幼苗前期生长有一
定作用。
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