全 文 ：compounds w hich are separated w ith a ODS column.Results:A procedure w as set up that atenolol w as ext ract-
ed w ith ethyl estate from rat hepatic microsome and pre-column derivatized w ith GITC , the diastereomeric
compounds were separated in ODS column with the mobile phase of sodium dihydrogen phosphate buffer -
methanol-acetonitrile (50∶20∶30), the detection w avelength w as 254 nm.The linear range w as 1 ～ 20 μg·
mL-1 (A -atenolol:Y = 840 076.5X +141 742.8 , r =0.999 8;B -atenolol:Y =873 157.2X +
192 187.5 , r=0.999 8).LOD tested w as 110 ng·mL-1 and LOQ was 290 ng·mL-1 (RSD <7%).The
relative recovery at different concentrat ion were ranged from 94% to 105%。The method w as practiced to ob-
serve the concentration variance of atenolol enantiomers in rat hepatic microsome after different incubation times.
Conclusion:A practical determination method of atenolol enantiomers in rat hepatic microsome by pre-column
chiral derivatization RP-HPLC was established.The procedure can be employed to study the enzymat ic behav-
ior of atenolol.
Key words　atenolol , GITC , rat hepatic microsome , HPLC , chiral derivatization
＊　第二军医大学药学院生药教研室
＊＊药学 95队实习学员
葛属植物中 3种异黄酮成分分析
宋洪杰　曾　明＊　胡晋红　王大业＊＊　张汉明＊
(上海长海医院　上海　200433)
摘要　目的:测定 7 种葛属植物根中异黄酮成分的含量。方法:采用高效液相色谱法。色谱柱为 Hypersil ODS2
(150 mm×4.6 mm , 5 μm);检测波长 250 nm;葛根素 、 大豆苷 、 大豆苷元的加样回收率±RSD 分别为 (105.7
±4.6)%, (105.4±6.9)%, (104.5±9.2)%。结果:葛属植物中 3 种异黄酮成分含量差异较大 , 野葛 、 粉葛和
峨嵋葛中含有的葛根素和大豆苷比其它几种葛属植物高 , 野葛中葛根素的含量最高;从液相色谱图中观察到不
同产地野葛的图谱与其它种的葛属植物有明显区别。结论:异黄酮成分可作为评价葛属植物质量的参考依据。
关键词　葛属植物　葛根素　大豆苷　大豆苷元　高效液相色谱
　　葛根作为常用的中药材 , 具有解肌退热 、 生
津 、 透疹 、升阳止泻之功效。现代药理研究表明药
材中含有的异黄酮类成分如葛根素 、大豆苷和大豆
苷元是主要的药理活性成分 , 临床上常用单味药或
复方制剂治疗冠心病 、心肌梗塞和高血压病 。本文
从异黄酮成分含量测定和鉴别的角度考察了葛属植
物中 7个种 , 为葛根的质量评价提供参考。目前报
道的葛根中葛根素 、 大豆苷 、 大豆苷元 3种异黄酮
成分的分析方法有 HPLC 和 HPCE法[ 1 ,2] , 本文采
用反相高效液相色谱法 , 利用二元梯度洗脱 , 一次
进样即同时完成 3种异黄酮成分的含量测定 , 并进
行了定性分析 , 可为评价葛根的质量提供参考依
据。
1　材料与方法
1.1　材料与试药　野葛 Pueraria lobata (Willd.)
Ohwi , 粉葛 P .thomsonii Benth., 峨嵋葛 P.
omeiensis Wang et Tang , 食用葛 P .edulis Pam-
pan., 苦葛 P .peduncuradis (Grah.ex Benth.)
Benth., 黄毛葛 P.calycina Fanch., 三裂叶葛
P.phaseloides (Roxb.)Benth., 由第二军医大学
生药教研室曾明博士提供并鉴定;葛根素对照品
(纯度为 95.6%)由中国药品生物制品检定所提
供 , 大豆苷 (纯度为 90.1%)、 大豆苷元 (纯度为
92.5%)对照品由中国医学科学院药物所植化室提
供;甲醇 、 乙腈为 HPLC 级 , 无水乙醇 、 磷酸二
氢钾为分析纯。
1.2　仪器　日本岛津液相色谱仪 LC-10AD 泵 ,
SPD-10Avp 二极管阵列检测器 , CLASS-LC10
工作站 , 7725i进样阀配以 20 μL 定量管 , 上海必
能信超声有限公司 SB5200超声震荡器。
·223·　20 (4), 2000 　
DOI :10.16155/j.0254-1793.2000.04.002
1.3　样品溶液的制备　将葛根生药粉碎 , 过 60目
筛 , 50 ℃烘干。称取 10 mg , 置 10 mL 量瓶中 ,
分别用无水乙醇 、甲醇 、 水稀释至刻度 , 超声振荡
60 min , 冷却至室温 , 补足挥发损失的溶剂 , 0.45
μm 微孔滤膜过滤 。经比较 , 无水乙醇提取葛根
素 、 大豆苷及大豆苷元 3种成分含量均最低 , 水提
取葛根素含量显著高于甲醇 , 大豆苷 、 大豆苷元含
量两者无显著差别 , 所以采用水作溶剂进行上述提
取 , 即得样品溶液。
1.4 　色谱条件　Hypersil ODS2 (150 mm ×4.6
mm , 5 μm)色谱柱 , 大连依利特科学仪器有限公
司。检测波长 250 nm 。流动相:0 ～ 10 min , 乙腈
-0.02 mol·L-1磷酸二氢钾 (12∶88), 10 ～ 25
min , 乙腈-0.02 mol·L-1磷酸二氢钾 (25∶75);
流速 1.0 mL·min-1 。保留时间为葛根素 6.9 min ,
大豆苷 13.1 min , 大豆苷元 22.0 min。色谱图见
图 1。
图 1　三维高效液相色谱图
A.对照品　B.野葛
1.葛根素　2.大豆苷　3.大豆苷元
2　结果
2.1 　线性关系考察　精密称取葛根素 、 大豆苷 、
大豆苷元对照品适量 , 分别配制系列浓度溶液 , 葛
根素:1.0 , 2.0 , 4.0 , 8.0 , 16.0 , 32.0 , 64.0 ,
130.0 μg ·mL-1 , 大豆苷:0.325 , 0.65 , 1.25 ,
2.5 , 5.0 , 10.0 , 20.0 μg ·mL-1 , 大豆苷元:
0.0845 , 0.169 , 0.325 , 0.65 , 1.3 , 2.6 , 5.2 ,
10.4 μg·mL -1。进样 10μL , 以峰高对浓度进行回
归 , 葛根素 、大豆苷 、大豆苷元回归方程及相关系
数分别为:
Y =-1 251.39+3 018.04C　r =0.999 8　n=8
Y =-778.15+2 348.95C　r=0.998 9　n=7
Y =-242.81+4 096.03C　r=0.999 9　n=8
2.2 　加样回收率　称取葛根样品 (河北井陉)10
mg , 置 10 mL 量瓶中 , 共 6份 , 其中 3份为空白
样品组 , 3份加入葛根素 、 大豆苷 、大豆苷元对照
品 350.0 μg , 8.0 μg , 10.0 μg 作为加样组 , 按
“1.3” 项下操作制备溶液 , 进样 10 μL , 葛根素 、
大豆苷 、 大豆苷元的加样回收率 ±RSD 分别为
(105.7±4.6)%, (105.4±6.9)%, (104.5±
9.2)%, n =3。
2.3 　精密度和重复性试验　取同一对照品溶液 ,
连续进样 3次 , 葛根素 、大豆苷 、大豆苷元的峰高
的 RSD 分别为 1.8%, 2.3%, 3.6%;取江西南
昌野葛按 “1.3” 项下操作制备 3份样品溶液 , 按
测定条件进样 3次 , 葛根素 、大豆苷 、大豆苷元的
含量的 RSD 分别为 3.6%, 3.1%, 5.9%。
2.4 　样品测定　按 “1.3” 项下操作制备样品溶
液 , 进样 10μL , 计算结果见表 1 , 葛属植物 7个
种的色谱鉴别见图2。由图中可见 , 野葛与其它种
葛属植物的色谱图有明显区别 , 苦葛 、食用葛和三
裂叶葛色谱图相近 , 同时也可以看出各个种都存在
葛根素的色谱峰 , 但含量高低相差悬殊。
表 1　葛属植物异黄酮成分测定结果
(%, n=3)
产地 种属 葛根素 大豆苷 大豆苷元
贵州岑巩 野葛 3.297(2.5) 0.246(1.9) 0.170(3.1)
江西南昌 野葛 1.012(3.6) 0.103(3.1) 0.028(5.9)
安徽金寨 野葛 2.044(1.8) 0.183(2.6) 0.039(3.2)
峨嵋山 野葛 4.875(1.3) 0.911(1.8) 0.099(2.3)
辽宁旅顺 野葛 6.021(2.7) 0.588(3.4) 0.088(2.9)
山东泰安 野葛 1.879(3.6) 0.058(4.5) 0.117(4.3)
天津蓟县 野葛 5.149(1.5) 0.129(2.1) 0.391(2.7)
西安 野葛 2.472(2.0) 0.102(2.7) 0.208(3.2)
河北井陉 野葛 2.885(2.2) 0.123(2.6) 0.128(2.8)
浙江天目山 野葛 2.501(2.4) 0.244(2.3) 0.103(3.0)
云南丽江 粉葛 0.806(1.8) 0.096(2.8) 0.030(3.2)
江西奉新 粉葛 0.537(3.1) 0.057(4.6) 0.039(4.9)
峨嵋山 峨嵋葛 1.126(2.4) 0.084(3.3) 0.055(3.7)
云南巍山 食用葛 0.244(3.7) 0.045(4.8) 0.074(1.8)
云南丽江 食用葛 — — 0.052(3.4)
峨嵋山 苦葛 0.158(2.6) 0.036(3.5) 0.053(4.8)
云南巍山 苦葛 — — 0.042(3.3)
云南永胜 黄毛葛 0.140(3.9) — 0.030(4.0)
广州 三裂叶葛 0.373(2.4) — 0.090(3.6)
注:—表示未测出 , 括号内数据为 RSD (%)
·224·　 药物分析杂志　
图 2　7种葛属植物的液相鉴别图
a.野葛　b.粉葛　c.峨嵋葛　d.苦葛
e.食用葛　f.三裂叶葛　g.黄毛葛
1.葛根素　2.大豆苷　3.大豆苷元
3　讨论
3.1 　液相条件考察　作者考察色谱条件时发现葛
根素 、大豆苷 、 大豆苷元 3种异黄酮成分的保留时
间在流动相pH 3 ～ 7范围内保持恒定 , 但它们对流
动相极性的变化敏感 , 随乙腈比例增加 , 保留时间
均提前 , 尤其是葛根素和大豆苷 , 当乙腈比例由
12%变为 12.5%时 , 2 者的保留时间均提前约 1
min ,当乙腈比例达到30%时 ,葛根样品中的组分
已无法分开 , 为了保证待测组分短时间内出峰且无
干扰 , 经过反复考察确定了本文的梯度洗脱条件进
行定量 、 定性 , 比文献 [ 3] 报道的分别测定异黄
酮的方法大大缩短了时间。
3.2 　葛属植物测定结果探讨　作者测定了葛属植
物的 7个种 , 从表 1可见 , 3种异黄酮成分的含量
差异较大 , 中国药典收载了野葛和粉葛作为药用 ,
从本研究的结果可见野葛中 3种成分的含量明显高
于其它种葛属植物 , 粉葛的含量明显低于野葛 , 以
异黄酮作为药理活性成分 , 在食用葛 、苦葛 、 黄毛
葛和三裂叶葛中含量甚低 , 也证明其药用价值较
低 。本实验中发现不同产地的同种葛色谱图较相似
(因篇幅关系未一一列出), 说明同种葛之间的化学
组成差异小 。值得一提的是峨嵋葛 , 色谱图介于野
葛和粉葛之间 , 3种异黄酮成分的含量接近于药用
的野葛和粉葛 , 故其可考虑作为药用 , 但需要进一
步的研究。
参考文献
1 　 Yoshimi K , Munehiko M , Yasuyuki U , et a l.Analysis of
isoflavones in Puerariae radix by high-performance liquid chro-
matography w ith amperometric detection.J Ch romatogr , 1985 ,
347:438
2 　Wang Chinyu , Huang Hisya , Kuo Kuanglung , et al.Analysis
of Puerar iae radix and it s medicinal preparat ions by capi llary elec-
t rophoresis.J Chromatogr A , 1998, 802:225
3 　楼之岑 , 秦波.常用中药材品种整理和质量研究 (北方编).
第 1册.北京:北京医科大学 中国协和医科大学联合出版
社 , 1995.418
(本文于 1999年 7月 13日收到)
Determination and Chromatographic Identif ication of
3 Isoflavones of Pueraria Plants
Song Hongjie , Zeng Ming , Hu Jinhong , Wang Daye and Zhang Hanming
(Depar tment of Clin ical Pharmacology , Shanghai Changhai Hospital , Shanghai　200433)
Abstract　Objective:To determine the content of isoflavones in seven species of genus Pueraria roots.
Method:RP -HPLC method w as used.The separation w as performed on Hypersil ODS2 (150 mm ×4.6
mm , 5 μm) column , the w aveleng th for detection w as 250 nm.The recoveries for puerarin , daidzin and
daidzein w ere as follow s:(105.7±4.6)%, (105.4±6.9)%, (104.5±9.2)%.Results:The contents of
three kinds of isoflavones in seven species of Pueraria plants were dif ferent.The contents of puerarin and
daidzin in Pueraria lobata , P .thomsonii and P.omeiensis were higher than those of o ther Pueraria plants.
The content of puerarin in Pueraria lobata was highest compared with other species.The chromatograms of
·225·　20 (4), 2000 　
Pueraria lobata from dif ferent dist ricts w ere different from o ther species.Conclusion:The isof lavone compo-
nents may be adopted as reference for evaluating the quality of genus Pueraria roots.
Key words　Pueraria , puerarin , daidzin , daidzein , HPLC
高效液相色谱法同时检测人血清中
全反式及 13-顺式维甲酸浓度
余自成　姚　帅＊　郁人海
(上海第二医科大学瑞金医院临床药理研究室　上海　200025)
摘要　目的:建立高效液相色谱方法同时检测人血清中全反式及 13 -顺式维甲酸浓度。方法:色谱柱:
μBondapak C18 (3.9 mm×300 mm), 流动相:甲醇-醋酸铵缓冲液 (85∶15), 流速:0.8 mL·min-1 , 紫外检测
波长:340 nm , 柱温:22 ℃, 血清样品经乙醚 2 次提取 , 按内标法定量 , 内标物选用对二甲氨基苯甲醛。结果:
全反式及 13-顺式维甲酸的线性范围分别在 0.8 ～ 1 120 μg·L-1和 0.82 ～ 1 312 μg·L-1 , 最低检测浓度均为 0.6
μg·L-1 。全反式维甲酸测定的平均回收率为 98.86%～ 105.2%, 日内 、 日间精密度 RSD 为 0.84%～ 5.5%, 13
-顺式维甲酸测定的平均回收率为 101.6%～ 101.8%, 日内 、 日间精密度 RSD 为 1.4%～ 5.7%。 结论:本方
法灵敏 、 准确 , 样品处理简便易行 , 适用于全反式维甲酸的临床药动学研究。
关键词　全反式维甲酸　13-顺式维甲酸　血药浓度　高效液相色谱法
＊　上海中医药大学 1999届实习生
　　全反式维甲酸 (All-Trans -Retinoic Acid ,
ATRA)是维生素 A的天然氧化代谢产物 , 在体内
经可逆代谢而成 13 -顺式维甲酸 (13 -cRA)。
ATRA是目前治疗急性早幼白血病 (APL)最有效
的药物 , 多数患者用药后病情获得缓解[ 1～ 3] , 但
在持续用药过程中很快出现耐药 , 复发几乎普遍发
生 , 其原因可能是 AT RA 对参与其代谢的酶活性
具有自身诱导作用 , 持续用药导致血药浓度逐步降
低[ 4] 。本文建立了一种灵敏 、 准确的 HPLC 法 ,
可同时检测人血清中 AT RA 及 13-cRA 浓度 , 此
方法可用于 ATRA临床药动学及体内 ATRA与 13
-cRA间的相互转化关系的研究 。
1　仪器与试药
Waters高效液相色谱仪 , 包括 510型恒流泵 ,
486型可调波长 UV 检测器 , PCM , TCM , Mil-
lennium 2010色谱管理系统 。XW-80A旋涡混合
器 (上海医科大学仪器厂), 800 型离心沉淀器
(上海手术器械十厂)。
ATRA及 13-cRA 对照品 (上海第六制药厂
提供 , 含量为 99.68%);对二甲氨基苯甲醛
(DMAB , 上海试剂三厂);甲醇为色谱纯 , 乙醚 、
醋酸铵 , 冰醋酸均为分析纯 。醋酸铵缓冲液配制:
取醋酸铵 33.3 g , 加水 100 mL 溶解 , 加冰醋酸
2.3 mL 混合 , 摇匀 , 即得 。
2　色谱条件
色谱柱:μBondapak C18 (10 μm , 3.9 mm ×
300 mm);流动相:甲醇 -醋酸铵缓冲液 (85∶
15);流速:0.8 mL·min-1;紫外检测波长:340
nm;柱温:22 ℃;检测灵敏度:0.002 AUFS 。
3　样品处理方法
取血清样品 1 mL , 加入内标 DMAB 100 ng ,
用乙醚 10 mL分 2次提取 , 每次 5 mL , 旋涡振荡
提取 0.5 min , 1 500 r·min-1离心 5 min , 合并乙
醚提取液至尖底试管中 , 在 40 ℃水浴中用纯 N2
吹干 , 用乙醚 0.5 mL 淋洗管壁 , 再用纯 N2 吹干 ,
将残渣用甲醇 40μL溶解 , 取 20 μL 进样 。
4　结果
4.1 　色谱行为　在上述色谱条件下 , ATRA与 13
-cRA 、 内标物及血清内源物质能够实现较好分
离 , 色谱图见图 1 , ATRA 、 13-cRA及内标物保
留时间分别为 8.43 , 7.65 , 4.58 min。
4.2 　标准曲线　取空白血清 1 mL , 分别加入
ATRA及 (13-cRA)标准甲醇溶液适量精密配成
浓度为 0.8 (0.82), 4 (4.1), 16 (16.4), 80
·226·　 药物分析杂志