全 文 ：2 0 0 3 年 9 月
第 2 0 卷第 3 期
阜阳师范学院学报 ( 自然科学版 )
Jo u r n a l o f F u ya n g T e a e h e r s C o ll e g e ( N a t u r a l Sc i
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葛属植物基因组 D N A 的提取和纯化
唐俊 ` 江 昌俊 “
(l 阜阳师范学院生物系 ,阜阳 , 2 3 6 0 3 2 2 农业部茶叶生物技术 , 点开放实验室 ,合肥 , 2 3 0 0 3 6 )
摘要 : 采用 SD S 裂解法提取了葛属植物成熟叶片的基因组D N A ,并利用凝胶纯化试剂盒进行了纯化 。 结果表明 ,该纯化方
法有效 , 所获得的 D N A 可用于 P C R 反应 。
关键词 : 葛属 O N A 提取 纯化
分类号 : Q 5 2 3 文献标识码 : A 文章编号 : 1 0 0 4一 4 3 2 9 ( 2 0 0 3 ) 0 3一 7 4一 0 4
材料和方法
.1 1 样品来源
葛属植物的成熟叶片采自安徽 、 陕西 、 广东等地 。
1
.
2 墓因组 D N A 的提取
l) 称取去除主脉的葛鲜叶 3 克于研钵中 , 加入 1一 2 % P V P P 和少许石英砂研磨至粉末状 。
2) 将粉末转移到离心管中 ,加 ZOm l提取缓冲液和 2 0 0川p一琉基乙醇 , 振动混匀 , 60 ℃ 水浴保温 30 一 60 分钟 ,并不时摇动 。
3 ) S 0 0 0
r p m 离心 5 分钟 。
4) 仔细吸取上清液移至另一离心管中 ,加入等体积的苯粉 /抓仿 /异戊醇溶液 ,颠倒混匀 ,室温下静置 5一 10 分钟 ,使水相
和有机相分层 。
5 ) s o o or p m 离心 5 分钟 , 小心吸取上清至另一离心管中 , 加等体积的氯仿 /异戊醇 /乙醇溶液混匀 ,室温下静置 5~ 10 分钟 ,
使水相和有机相分层 。
6 ) s o o o r p m 离心 5 分钟 ,小心吸取上清至另一离心管 , 加等体积异丙醇 ,混匀 , 室温下放置片刻即出现絮状 D N A 沉淀 ,并
于 一 2 0 ` C冰箱中放置 30 分钟 。
7 ) 3 0 0 o r p m 离心 5 分钟 , 去尽上清 ,再加入 l m lT E 缓冲液 D N A 沉淀 。
8 )待 D N A 完全溶解后 , 加 2产IR n a s e A , 3 7 ’ C水浴 1 5 分钟 ,除去 R N A 。
9) 然后加 l / 10 体积 3m ol I/ , na A c 和 2 倍体积冰无水乙醇 ,混匀 , 一 20 ℃冰箱中放置 30 分钟左右 , 使 D N A 形成絮状沉淀 。
1 0) 用玻棒捞出 D N A 沉淀 , 70 % 乙醇漂洗 , 再在干净吸水纸上吸干 。
] l) 将 D N 八 重新溶于 0 . s m lT E 中 , 于 4℃冰箱保存备用 。
1
.
3 墓因组 D N A 浓度的检测
基因组 D N A 浓度通过紫外分光光度计进行检测 ,测定 D N A 样品在 2 6 0n m 的光密度值 , 按下列公式进行计算 : D N A 浓度
= ( ) D 2 6 o x o
.
5 5 只稀释倍数 (单位 : u g / 扛 l ) 。
1
.
4 墓因组 D N A 纯度 、 浓度和分子 l 大小的鉴定
将 D N A 样品和合适的分子量标记同时在 0 . 7%的琼脂糖凝胶 (含 。 . s u g / m l 澳化乙锭 )上进行电泳 , 在紫外灯下进行观
察 . 与标准分子量比较估测基因组 D N A 片段的分子量大小 。 D N A 纯度的鉴定是通过紫外分光光度计进行 。 分别测定 D N A 样
品在波长为 26 o n m 、 z s o n m 处的光密度值 , 计算O D 。`。 /O D 28。值 。 D N A 浓度按下列公式进行计算 : DN A 浓度 = O D Z`。 x o . o s 只稀
释倍数 (单位 : u g / z, I ) 。
1
.
5 基因组 D N A 的纯化
使用上海生工生产的 U N IQ 一 5 柱式 D N A 纯化试剂盒进行纯化 , 主要步骤如下 :
收稿日期 : 2 0 0 3一 0 5一 21
第 1 作者简介 :唐俊 ( 1 9 7 5 一 ) ,男 ,安徽桐城人 ,阜阳师范学院 ,讲师 ,硕士 ,研究方向 :分子生物学 。
DOI : 10. 14096 /j . cnki . cn34 -1069 /n. 2003. 03. 009
第 3期 唐俊等 :葛属植物基因组 D N A 的提取和纯化
1) 在紫外灯照射下用干净的手术刀切割下含所要回收的 D N A琼脂块 ,放入 1 . 5m l 的离心管中。判定D N A 片段位置时 ,要
尽可能使用长波长 U V ,在 U V 下照射的时间要尽可能短。
2) 按每 10 m0 g 琼脂粮胶加入 40 如 IiB dn i gn B u fe r , 里于 50 ~ 60 ℃水溶中 10 分钟 ,使胶彻底融化 . 加热融胶时 ,每 2 分钟混
匀一次 .
3) 将 U NI Q一 5柱放入 Zml 的收集管中 ,将融化的胶液转移到 U N I Q一 5柱中 ,室温放置 2 分钟。 室温 80 0r p m 离心 1 分钟。
4) 取下 U NI Q一 5柱 ,倒掉收集管中的废液 ,将 U N IQ 一 5 柱放同一个收集管中 ,加入 50 呵 W a s h oS lu it on , 室温 80 0r pm
离心 1分钟 。
5) 重复步骤 4 。
6) 取下 U N IQ 一 5 柱 ,倒掉收集管中的废液 ,将 U N IQ 一 5 柱放入同一个收集管中 ,让离心管盖开着 ,室温高速离心
( 1 2000rP m ) 1 分钟 。
7) 将U N IQ一 5 柱放入一根新的 1 . s m l离心管中 ,在柱子膜中央加 30 川lE ut io n uB f er 到 U NI Q一 5 柱中 ,室温或 37 ℃放置
2分钟。 提高洗脱温度有利于提高 D N A 的洗脱效率。
8) 12 0 rP m 高速离心 1分钟 ,离心管中的液体即为回收的 D N A 片段 。
1
.
6 D N A 的 R A P D 扩增
扩增反应在BH P X 22 o P e R E x p r e s , T h e r m a x yC l e r ( HYB A功 L IM IET n , u K )中进行 ,其反应体积为 5 0产1. 其主要成分为 :
20 gn 模板 D N A , 。 . 2拌m ol / L 随机引物 , l x aT qD N A 聚合酶反应缓冲液 , 2 . SU aT q 聚合酶 , 2~ oI L/ M邪12 , 。
.
2
~
ol / L
dN T P
, 扩增程序为 : 94 ℃预变性 18 0秒 ,然后进入 40 个循环 ,每循环 94 ℃变性 60 秒 , 38 ℃退火 90 秒 , 72 ℃延伸 120 秒 ; 40 个循
环结束后延仲 10 分钟 ,最后 4℃保存 . 扩增产物在 1. 8%的琼脂粮凝胶 (含 E B) 上 , 电压为 4 v c/ m 的情况下电泳 1 . 5 小时 . 扩增
引物为 S a n g o n 公司的 5 1 3 0 7 (A G e C e C e A A G ) .
2 结果
葛叶基因组 D N A 的提取
按照文中方法所提取的葛藤基因组 D N A 经 。 . 7%琼脂糖凝胶电泳观察 ,主带明显 ,分子量大于 lZ k b 。 (如图 )
M 1 2
2 12 2 6 b l
7 4 2 l b P
5 8 0 4
5 6 4 3
4 8 7 8冲
图 1 葛膝攀因组 D N A 的电泳图谱
M 为入压co R I M a r ke r 泳道 1 , 2 分别对应为材料 1和 2 的基因组 D N A
D N A 纯度鉴定
用萦外分光光度计测定所提取的D N A 的 O zD 。和 0 玖 , 值 ,计算O D 二s o/ O D幼。值 ,均为 1 . 8~ 1. 9 ,纯度较好。
D N A 的 R A PD 扩增
将不同产地和品种的葛叶所提取的 D N A 作为棋板进行 R A PD 反应 。 结果表明 (图幻 ,这些 D N A 能扩增出清晰的谱带 。
1`,曰.2.2
2
.
3
阜阳师范学院学报 (自然科学版 ) 第 20 卷
图 2 引物 5 13 0 7 扩增的R AP D图谱
M 为标准分子量 , 1~ 13 分别为不同产地和品种的葛叶
3 讨论
3
.
1 基因组 D N A 的提取
在分子遗传学或基因工程中使用较多的植物 ,如小麦 、 玉米 、 大豆 、 水稻等细胞内基因组 D N A 的提取已有许多成熟的方
案 ,而对于象银杉 、 葛藤 、 升麻类植物的总 D N A 提取仍需不断摸索条件 。 银衫的针叶内含有较高含量的多酚类化合物 ,葛藤叶
中含较多糖类和多酚类 ,升麻类物质则含大量的多元醉 。这些次生物质易与核酸形成复合物 ,所提取的D N A 是枯稠的胶状物 ,
难以溶解并产生不同程度的褐变 ,所以提取基因组 D N A 时 ,加入不溶性聚乙烯毗咯烷酮 (P V p )P ,并在提取缓冲液中加入日一
琉基乙醉 ,以抑制多酚的氧化 。 另外 , 由于本实验受客观条件的影响 ,葛叶较老 ,给 D N A 的提取造成了一定的难度 。 所以 ,在条
件许可的情况下 ,提取植物的基因组 D N A 时应尽可能使用比较鲜嫩的材料 。
本实验所提取的基因组 D N A ,主带明显 ,且分子量大于 21 k b ,适合于 R A P D 分析。 刘春林等闭指出 ,模板降解程度不大 (绝
大部分分子量大于 1k0 b) 不会影响扩增结果 ,若模板严重降解 (大部分分子量小于 l o k b) 便影响扩增 ,为了避免 D N A 严重降
解 ,在提取时应尽量避免剧烈或不恰当的操作 ,以便获得大分子惫的模板 D N A 。 为此 ,在基因组 D N A 提取方法上又作了相应
改进 ,即待鲜叶研磨之后才加入提取缓冲液 , 因为提取缓冲液中含 SDS ,它能迅速破坏细胞 ,使 D N A 从胞内释放出来 ,若在此
时进行研磨很容易使 D N A 断裂 .
针对葛叶的特点 ,采取上述措施后 ,所提取的 D N A 质量虽有一定程度的提高 ,但仍不能满足 R廿D 扩增反应体系对模板
D N A 的要求 ,故不得不进一步采取纯化策略 . 最理想的纯化办法是用氛化艳梯度离心纯化 (de UaP or at , 19 83) ,但此法昂贵费
时 ,儒要超速离心设备且需大量植物材料 。 我们也试过另外多种提取植物基因组 D N A 的方法和柱层析纯化 ,但效果不佳。 最
终通过琼脂糖凝胶电泳实现了纯化 ,这是因为电泳过程本身就起到分子筛的作用 , D N A 中的一些多糖、 多酚类物质和盐类 、 小
分子等杂质通过电泳得以分开 。
3
.
2 甚因组 D N A 的定 t
文中所列的 D N A 浓度计算公式仅适用于纯度较高的样品 ,而当含有高浓度的多糖及其它成分 ,需要通过比较 E B 荧光强
度进行定量 。 因为某些杂质成分在波长 26 o n j n 处也可能有较大的紫外吸收峰 。
参考文献
1 李德葆等 . 基因工程操作技术伽〕. 上海 :上海科学技术出版社 , P 54 一 5
2 d e ll a p o r t : S L , Wo o d J e t a l
.
A p l a n t D N A m iin p r e p ar at fo n Ve
r s i o n I U〕. lP an t M o l B iof R e l , 1 9 5 3 , 1 : 1 9~ 21 .
3 W il li
a m s J G K
,
K u b o l ie A R
, e t a l
.
D N A p Ol y m o印hi sm a m p l if ie d by ar b i t r a r y p r im e r s a r e u s e fu l g e n e t ie 二 a r k e r 〔J〕.
N u e l e i e 人e id s R e s , 199 0 , 1 8 ( 2 2 ) : 6 53 1e 653 5
第 3 期 唐俊等 :葛属植物基因组 D N A 的提取和纯化 37
4 W
e
li
s hJ
,
M e C ll la n d M
.
F in g e r p r : n t in g g e n o m
e s u s in g p C R w i t h
a r
b i t
r a r y p r im e r s [ J」. N u e le i e A e i d s R e s , 1 9 9 0 , 1 8
( 2 4 )
:
7 2 1 3 ~ 7 2 1 8
5 陈亮 , 高其康等 . 茶树 R A P D 反应系统和扩增程序优化〔J〕. 茶叶科学 , 19 8 , 1 8 ( 1 ) : 16 一 20
6 刘春林 ,官春云等 . 植物 R A P D 标记的可靠性研究仁J〕. 生物技术通报 , 1 9 9 9 , 2 : 31 一 34
E x t r a e t i o n a n d P u r i f i e a t i o n o f P u e r a r i a D C g e n o m i e D N A
T a n g J u n ’ Jia n g C h a n g j u n Z
( 1 B io l o g y D e p a r tm e n t o f F u y a g T e a e h e r s C o lle g e
,
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,
2 3 6 0 3 2 )
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:
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.
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.
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用 P P 二 3处理人参果对其生长发育有明显 的调节作用 , 可以矮化植株 , 促进生长健壮 ,营养生长与生殖生长协调 , 提早座
果 ,提高产量 , 最适宜的处理浓度为 1 50P pm 左右 。 浓度过大抑制生长发育 , 出现药害 。 浓度过小调节作用不明显 。
主要参考文献
l 田备 . 营养保健型果蔬一人参果〔J〕. 上海蔬菜 , 1 9 8 ( 3 ) : 3 2
2 陆瑞菊等. 人参果的脱毒与快速繁殖〔J〕. 中国农学通报 , 20 01 ( 2 ) : 4 一 7
3 蔡等 . 人参果茎尖培养仁J〕. 上海农学院学报 , 1 9 9 , 1 7 ( 3 ) : 23 3一 2 36
4 潘瑞炽等 . 植物生理学〔M 〕. 北京 :高等教育出版社 , 1 9 9 9
5 邵莉媚 . 花卉化学促控技术仁M 」. 北京 : 金盾出版社 , 1 9 9 3
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