全 文 ：Vol. 32 No. 4
Apr. 2012
第 32卷 第 4期
2012年 4月
中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
Journal of Central South University of Forestry & Technology
收稿日期：2011-09-16
基金项目：林业公益性行业科研专项项目“柿属植物种质资源保护与选育技术研究”(200904041)
作者简介：梁玉琴 (1986—)，女，硕士研究生，研究方向：经济林栽培育种；E-mail：yqliang1986@126.com
通讯作者：李芳东 (1963—)，男，河南太康人，博士后，研究员 , 主要从事经济林育种与栽培的研究；E-mail:lifangdong66@163.com
我国柿属Diospyros L.植物资源丰富，有57种，
6 变种，1 变型 [1]，其中作为果树果树栽培的柿属
植物主要是柿 D.kaki、美洲柿 D.virginiana、君迁
子 D.lotus、油柿 D.oleifera 等，尤其以柿综合经济
开发价值最高 [2]。柿是原产于我国的重要木本粮油
树种之一，资源丰富，分布范围广，品种近千余
种 [3-4]。近年来，随着分子生物学的高速发展，分子
标记和基因工程等生物技术广泛应用于柿属植物种
质资源鉴定和遗传多样性分析等方面 [5-7]，而获得高
质量的 DNA 是柿属植物分子生物学研究的基础。柿
属植物叶片富含单宁、多糖、VC 等物质 [8]，采用常
规 CTAB 法提取的 DNA，质量低杂质多 [9-10]，目前
对柿属植物基因组 DNA 的提取，一般是探索后根
据各自实验条件采用改良 CTAB 法 [11-13]，其操作
繁琐、耗时长、毒害大、效率低，为了快速获得
高质量 DNA，本试验采用改良 CTAB 法和植物基
因组提取试剂盒两种方法提取柿属植物 DNA，比
较两种方法的优劣，以期得到满足柿属植物 SSR-
PCR 扩增要求的 DNA 提取适宜方法，为柿属植物
遗传多样性的 SSR 分析研究奠定基础。
柿属植物基因组 DNA提取方法比较
梁玉琴 1，李芳东 1，傅建敏 1，乌云塔娜 2，吴 硕 1
（1.中国林业科学研究院经济林研究开发中心，河南 郑州 450003；
2.中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室，湖南 长沙 410004）
摘 要：针对柿属植物叶片富含单宁，常规 CTAB 法提取 DNA 质量低等问题，为了获得符合柿属植物 SSR-
PCR 扩增要求的 DNA，分别采用改良 CTAB 法和植物基因组 DNA 提取试剂盒两种方法，提取柿属植物 DNA，
结果显示：两种方法均可得到满足 SSR-PCR 扩增要求的 DNA；试剂盒较改良 CTAB 法提取的 DNA 质量高、杂
质少，DNA 得率略低，但其操作步骤简单，耗时短，毒害小，因其费用较改良 CTAB 法高，各实验室可根据自
身条件选择适宜方法提取柿属植物 DNA。
关键词：柿属植物，DNA 提取，改良 CTAB 法，基因组 DNA 提取试剂盒
中图分类号： S718.46 文献标志码：A 文章编号：1673-923X(2012)04-0170-04
Comparison of two methods to extract DNA from trees of Diospyros L.
LIANG Yu-qin1, LI Fang-dong1, FU Jian-min1, WUYUN Ta-na2, WU Shuo1
(1. Non-timber Forest Research and Development Center of Chinese Academy of Forestry, Zhengzhou 450003 , Henan, China;
2. The Key Lab of Non-wood Forest Product of Forestry Ministry, Central South University of Forestry and Technology, Changsha
410004 , Hunan, China)
Abstract: Tannin is rich in the leaves of Diospyros L. so the quality of DNA extracted by conventional CTAB methord is lower. The
DNA from trees of Diospyros L. was extracted by using modified CTAB method and plant genomic DNA Kit in order to compare
which method is better. The results show that DNA extacted by the two methods also met demands for ssr-pcr amplification. The quality
of DNA obtained by plant genomic DNA Kit was better but the achievement rate of DNA was lower. Moreover, the method of plant
genomic DNA Kit was much easier, needed shorter time, had lower toxicity. DNA of trees of Diospyros L. can be extracted by suitable
method according to the actual conditions of the lab.
Key words: Diospyros L.; DNA extraction; modified CTAB methord; plant genomic DNA Kit
DOI:10.14067/j.cnki.1673-923x.2012.04.021
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1 试验材料
柿属植物8种（或变种），共22份材料（见表1），
其中包括君迁子 2 个类型，柿品种 4 个类型（完
全甜柿 4 个、不完全甜柿 2 个、不完全涩柿 2 个、
完全涩柿 5 个）。于 6 月下旬采摘当年生已展开
的成熟嫩叶，液氮保存带回实验室，置于 -70℃保
存备用。
迅速转移至步骤（1）的离心管中，样品 65℃水浴
裂解 2 h，期间振荡混匀 3 ～ 5 次；
(3) 取出离心管冷却，室温 12 000 rpm 离心 12
min；
(4) 将上清液（约 700 μL）转入新的 1.5 mL 离
心管中，加入 700 μL 氯仿∶异戊醇 (24 ∶ 1)，轻轻
颠倒混匀 10 min，4℃下 12 000 rpm 离心 10 min；
(5)重复步骤（4）2～ 3次，直至无白色沉淀层；
(6) 将上清液转入另一 1.5 mL 离心管中，加入
700 μL 预冷的异丙醇，轻轻混匀至出现透明絮状
DNA 沉淀，4℃ 10 000 rpm 离心 6 min，弃上清液；
(7) 加入 1 000 μL 预冷的 75％乙醇，洗涤沉淀
2 次，每次 10 000 rpm 离心 6 min，弃乙醇，室温
风干至乙醇完全挥发；
(8) 加入 500 μLM NaCl，充分溶解 DNA 后 ,
加入 2 μLRNase（10 mg/mL），37℃水浴 1 h;
(9) 加入 1 mL 无水乙醇，混匀后 -20℃沉淀
DNA15 h；
(10)4℃ 8 000 rpm 离心 10 min，弃上清液，
75％乙醇洗涤 DNA 2 次，每次 8 000 rpm 离心 6
min，弃乙醇，室温风干至乙醇完全挥发；
(11) 加 200 μL TE 缓冲液溶解 DNA，置于
-20℃保存备用。
2.1.2 植物基因组 DNA提取试剂盒
植物基因组 DNA 提取试剂盒购自天根生化科
技（北京）有限公司，按试剂盒说明书步骤，提
取柿属植物基因组 DNA 后，置于 -20℃保存备用。
2.2 DNA 检测
2.2.1 琼脂凝胶电泳
取 DNA 样品 3 μL 与 1 μL 6×Loading buffer
混匀后上样，2% 琼脂糖凝胶（含荧光染料 EB）
电 泳 检 测 DNA 质 量，100 bp Marker 3 μL，
1×TAE 电泳缓冲液，120 V 电泳 45 min，电泳结
束后，Bio-Rad 凝胶成像系统下观察照相，浓度未
达到要求的样品重新提取 DNA。
2.2.2 SSR—PCR扩增
利用柿属植物 SSR 引物 ssrDK16[14] 对 1 ～ 6
号样品共 12 份 DNA 样品进行 PCR 扩增，PCR 反
应试剂采用 2×Taq Mix（未加染料），购自天根
生化科技（北京）有限公司，引物由南京金斯瑞
神武科技有限公司合成。
PCR 反 应 体 系 为：DNA 模 板 2 μL（ 约 40
表 1 供试柿属植物试验材料
Table 1 The samples of Diospyros L. for the experiment
编号 样品名称 类型 简称
1 君迁子 种 D.lotus
2 浙江野柿 柿变种 D.kaki var. silvestris
3 浙江柿 种 D.glaucifolia
4 无核君迁子 种 D.lotus
5 湖南乌柿 种 D.cathayensis
6 油柿 种 D.oleifera
7 美洲柿 种 D.virginiana
8 云南野毛柿 种 未知
9 阳丰 完全甜柿 PCNA
10 早秋 完全甜柿 PCNA
11 罗田甜柿 完全甜柿 PCNA
12 甜宝盖 完全甜柿 PCNA
13 麻城秋焰 完全甜柿 PCNA
14 藤八 不完全甜柿 PCA
15 禅寺丸 不完全甜柿 PCA
16 平核无 不完全涩柿 PVA
17 大平核 不完全涩柿 PVA
18 南京铜盆 完全涩柿 PVNA
19 橘蜜柿 完全涩柿 PVNA
20 大磨盘 完全涩柿 PVNA
21 博爱八月黄 完全涩柿 PVNA
22 三原烧柿 完全涩柿 PVNA
2 试验方法
2.1 DNA 提取
采用改良 CTAB 法和植物基因组 DNA 提取试
剂盒两种方法，分别提取柿属植物 DNA。
2.1.1 改良 CTAB法
(l)1.5 mL 离心管中加入 800 μL CTAB DNA 提
取缓冲液 (100 mM Tris-HCl(pH 8.0)，1.4M NaCl，
20 mM EDTA(pH 8.0)，30 μL β- 巯基乙醇，混匀置
于 65℃水浴预热；
(2)取 0.3 g叶片，加入液氮充分研磨至粉末状，
梁玉琴，等：柿属植物基因组 DNA提取方法比较172 第 4 期
ng），2×Taq Mix 10 μL，Primer 各 1 μL (10 μmol)，
加 ddH2O 至终体积 20 μL；循环体系为：94℃预变
性 2 min；94℃变性 45 s，55℃退火 1 min，72℃
延伸 75 s，共 35 个循环；72℃总延伸 5 min[15]；
4℃保存扩增产物。
2.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳
6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物，
上样前在PCR产物中加入10 μL溴酚蓝上样缓冲液，
混匀后取 3 μL 上样，120 V 电压下电泳 3.5 h。
电泳结束后，清水冲洗玻璃板两面，使凝胶
冷却，然后剥下凝胶置于 1×Du Red 荧光染色液
中染色 45 min，Bio-Red 凝胶成像系统观察、照相。
3 结果与分析
3.1 DNA 电泳检测结果
图 1 和图 2 中 Marker 分子量标准为 500 bp 的
条带，DNA 浓度为 50 ng，其余条带约 25 ng。琼
脂糖凝胶电泳结果显示：两种方法提取的 DNA，
条带均清晰整齐、DNA 完整无杂带；试剂盒提取
的 DNA 只有少量点样孔内有杂质，改良 CTAB 法
提取的 DNA 点样孔内有杂质且存在拖尾现象，说
明试剂盒提取的 DNA 纯度较高于改良 CTAB 法；
试剂盒提取的 DNA 少量样品（如 1、2、6、9、
12）浓度极低，不能满足实验要求，需重新提取
DNA，DNA 得率为 72.3%，改良 CTAB 法提取的
DNA 浓度均在 50 ng 以上，DNA 得率 100%，说
明改良 CTAB 法提取 DNA 得率高于试剂盒。图
3 为使用 Quantity One 4.62 软件比较所提样品的
DNA 浓度，最左边的几个波峰代表样品 1、2、6、
9、12 的 DNA 浓度，然后依次为 100 bp Marker 的
11条带的浓度结果显示5个样品的DNA浓度极低，
与图 1 电泳结果相符。
3.2 SSR-PCR 扩增结果检测
由图 4 可以看出：以两种方法提取的 DNA 样
品为模板进行 SSR-PCR 扩增，产物条带清晰，大
小在 100 ～ 200 bp，说明两种方法提取的 DNA 完
全满足柿属植物 SSR-PCR 扩增需要。
图 1 试剂盒提取柿属植物 DNA
Fig.1 DNA extracted by plant genomic DNA Kit
图 4 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
Fig.4 The result of PAGE
图 3 试剂盒提取 DNA 样品浓度比较
Fig.3 Concentration of DNA extracted by plant
genomic DNA Kit
图 2 改良 CTAB 法提取柿属植物 DNA
Fig.2 DNA extracted by modified CTAB method
4a. 试剂盒
4b. 改良 CTAB 法
4 讨 论
CTAB 法作为 DNA 提取的经典方法，广泛
应用于植物基因组 DNA 提取，具有稳定性好、得
率高、费用低等优点，但其操作步骤繁琐耗时，
所用药品中的异丙醇、PVP 等对人体毒性很大，
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未经改良的 CTAB 法提取的 DNA 质量较低，需根
据不同植物特点进行探索后才能使用。相比较下，
随着价格的逐步下调，植物基因组 DNA 提取试剂
盒因其操作简单，效率高，毒害少，提取 DNA 质
量高等优点，越来越受到大家的认可与青睐。
本试验选取的试验材料具有较高的代表性，
涵盖柿属植物不同的种及柿树所有 4 个类型的品
种，试验结果显示：改良 CTAB 法和植物基因
组 DNA 提取试剂盒两种方法，得到的柿属植物
DNA，均满足柿属植物 SSR-PCR 扩增要求，能够
进行基于 SSR 标记的柿属植物遗传多样性分析试
验，各实验室可根据实际条件，经费支出，人员
配给等具体情况，选择适合的方法进行柿属植物
基因组 DNA 的提取。此外，采用本试验中的改良
CTAB 法能够获得高浓度的 DNA，如需进行基因
组测序、Southern blot 等深入的分子生物学实验，
仍需进一步优化去除样品中的蛋白质等杂质。
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[本文编校：吴 彬 ]