全 文 ：　2009 , 35(4):29-33 P lant Protection
研 究 报 告
Research Reports
收稿日期:　2008-11-07　　　修订日期:　2009-03-09基金项目:　国家自然科学基金项目(30270892)＊通讯作者 E-mail:limf9@pvchina.org
李属坏死环斑病毒怀柔分离物CP基因的克隆、
原核表达及其抗血清制备
李明福1＊ , 　陈洪俊1 , 　陈定虎2 , 　邱德义2 , 　杨雷亮2 , 　赵世恒1
(1.中国检验检疫科学院 , 北京　100029;　2.广东中山出入境检验检疫局技术中心 , 528400)
摘要　本研究通过 RT-PCR技术获得了包含李属坏死环斑病毒怀柔分离物 CP蛋白基因的 DNA 片段 , 构建了针对
pET29a载体的两种表达质粒;转化大肠杆菌 BL21(DE3),并经 IPTG诱导表达了带不同融合肽段的 PNRSV1(25 ku)
和 PNRSV2(29 ku)融合蛋白。经过 Ni-N TA亲和柱与 SDS-PAGE 分离纯化 , 获得大量表达融合蛋白 , 并免疫家兔
制备了融合表达蛋白的特异性抗体。间接 ELISA 测定其效价分别为 8×103 和 3.2×104 。
关键词　李属坏死环斑病毒;　外壳蛋白;　原核表达;　蛋白纯化;　抗体
中图分类号:　S 436.629　　文献标识码:　A　　DOI:　10.3969/ j.issn.0529-1542.2009.04.006
Cloning of the CP gene , prokaryotic expression and antiserum preparation of
Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV-Hr)
Li M ing fu1 , 　Chen Hong jun1 , 　Chen Dinghu2 , 　Qiu Deyi2 , 　Yang Leiliang 2 , 　Zhao Shiheng1
(1.Chinese Academy o f Inspection and Quarantine , Beij ing　100029 , China;
2.I nspection Technical Center o f Zhongshan Entry-Ex it I nspection &
Quarantine B ureau , Guangdong　528400 , China)
Abstract　The Prunus necrotic ringspot virus(PNRSV-H r)coat pr otein(CP)gene w as amplified by RT-PCR w ith
the primer s o f PNRSV CP gene and then the CP gene w as inser ted into tw o different sites of the prokary otic expres-
sion vector pET29a and transformed into E.coli BL21(DE3).The results o f SDS-PAGE show ed tha t PNRSV CP
gene was expressed effectively when induced with IPTG , as a 25 ku PNRSV-6His (PNRS V1)fusion protein or a
29 ku S-tag-PNRSV-6His (PNRSV2)fusion pro tein.The antisera of high specificity wa s obtained when the r abbits
we re immunized with the purified recombinant pro teins and the titers of the tw o antisera w ere determined to be 8×
103 and 3.2×104 by indirect ELISA , respectiv ely.
Key words　Prunus necrotic ringspot virus;　coat protein;　prokaryotic expression;　protein purification;　antiserum
　　李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot
virus , PNRSV)是我国进境检疫性有害生物 ,国内
已有局部发生[ 1-3] 。该病毒可以侵染李属植物如
桃 、油桃 、樱桃 、李 、杏 、樱花以及其他属的植物如月
季 、苹果和啤酒花果等[ 4-6] ,一般可造成 30%～ 70%
产量损失 。酶联免疫吸附分析方法(ELISA)是检测
该病毒的常规方法 ,但是由于该病毒稳定性差 、难以
提纯 ,致使一直难以制备其大量高效价的抗血清 ,严
重影响了我国对该病毒的检疫检测和监测 ,而利用
原核生物表达系统来生成该病毒的外壳蛋白 ,进而
再制备它的抗血清是一条行之有效的途径 。本文在
前人研究的基础上[ 7] ,对相关技术进行了改进 ,终于
制备出满足该病毒常规检测需求的抗体 ,可望在口
岸检疫和健康种苗生产中推广应用 。
1　材料与方法
1.1　材料
PNRSV 感病材料系中国检验检疫科学研究院
2009
动植物研究所采自于怀柔[ 3] ;原核表达载体 pET29a
由英国 Univer si ty o f East A ng lia 的 Dr.Vincent
Elli s惠赠;大肠杆菌菌株 DH5α和 BL21(DE3)由中
山检验检疫局技术中心植物病毒实验室提供;Trizol
试剂 、Taq酶 、M-MLV反转录酶 , T4 连接酶及其他
一些生化试剂等购自广州普博生物技术公司;限制
性内切酶 N deI , BamHI 和 Hind Ⅲ 购自大连宝生
物公司;IPTG 购自 Sigma 公司;Ni-NTA 以及纯化
用柱体购自 Invit rog en公司 。
扩增引物根据 GenBank中已经发表的 PN RSV
CP 基因序列而设计[ 8] ,上游引物序列 PNRSV-F1:
5′-GG CATA TGG T TTGCCGAA TT TG-3′(画线处
为 NdeI 酶切位点), PNRSV-F2:5′-GT GGA TCC
ATGGT TTGCCGAA TT TG-3′(画线处为 BamHI
酶切位 点), 下 游序 列 为 PNRSV-R1:5′-GG
AAGCTT GATCTCAAGCAGG TC-3′(画线处为
Hind Ⅲ酶切位点),引物由北京奥科生物公司合成 。
1.2　方法
1.2.1　总 RNA提取
根据广州普博生物技术公司提供的方法:称取
0.1 g 感病寄主植物组织于干热灭菌的研钵中 ,液氮
研磨至粉末 , 迅速转移至 1.5 mL 离心管中 , 按
T rizol试剂盒提取 。提取物以适量无 RNA 酶的水
溶解 RNA ,可直接用于 RT-PCR扩增 。
1.2.2　RT-PCR扩增目的基因
以上一步提取的总 RNA 为模板 ,利用 M-MLV
反转录酶在 Oligo(dT)15 引物的引导下 ,合成第 1
链 cDNA ,然后分别用引物 PNRSV-F1/PN RSV-R1
和 PNRSV-F2/PNRSV-R1 扩增 PNRSVCP 基因 ,
得到包含 CP 基因全长的 cDNA片段。
1.2.3　PCR产物的克隆和测序鉴定
PCR产物经纯化回收后 ,与 pGEM-T-vector 连
接而成 CP/ T-vecto r ,连接产物转化大肠杆菌 DH5α
感受态细胞。Co lony PCR 鉴定重组子后 ,提取质
粒 ,经酶切鉴定为阳性的重组质粒送宝生物工程(大
连)有限公司测序。
1.2.4　PNRSV CP 基因原核表达载体的构建
以 PN RSV CP/ T-vector 为模板 ,应用 CP 基因
上游引物 PN RSV-F2和下游引物 PN RSV-R1进行
PCR扩增 。PCR产物纯化后以 BamH1 和 Hind Ⅲ
双酶切 ,质粒载体 pET29a同样用 BamH1 和 Hind
Ⅲ双酶切 ,两者产物经纯化后连接 ,然后转化大肠杆
菌 DH5α。经转化子菌落 PCR 和质粒酶切筛选的
阳性重组子 pET29a-PN RSV2 进行 DNA 测序 ,验
证阅读框的正确性。
上述构建的表达产物将是在 PN RSV CP 蛋
白的 C-末端融合了 6×His tag , N-末端融合了 S-
蛋白 tag.针对于 pET29a 的结构特点 ,本研究中
同样设计了引入 N deI 酶切位点的 PNRSV 上游
引物 PN RSV-F1 。以 PN RSV-F1 和 下游 引物
PN RSV-R1为引物对进行 PCR扩增 , PCR产物与
pET 29a 均以 NdeI 和 HindⅢ双酶切 ,同样的原理
与方法以获得正确表达的 pET29a-PNRSV1 重组
质粒 。
1.2.5　CP 基因诱导表达及 SDS-PAG E分析
将阅读框正确的重组子质粒 pET29a-PNRSV2
和 pET29a-PN RSV1 分别转化大肠杆菌 BL21
(DE3), 挑取单菌落接种于 3 mL LB的液体培养基
中(含卡那霉素 40μg/mL), 37 ℃200 r/min振动培
养过夜后 ,按 1∶100稀释到新鲜的 LB 培养基中 ,振
动培养至 A600达到 0.5 ～ 1.0 ,加 IPTG 至终浓度
1 mmol/L ,继续于 37 ℃培养 ,分别于不同的时间段
取样 ,离心收集菌体。加适量 TE 溶液(pH8.0),振
荡悬浮 , 再加入等体积的 2 ×SDS 上样缓冲液 ,
100 ℃煮沸 3 min , 13.5%的 SDS-PAGE 电泳分析
PNRSV CP 基因的蛋白表达情况。电泳结束后的
聚丙烯酰胺凝胶用考马斯亮蓝 R-250染色 1 h ,室温
摇床脱色 3 h。
1.2.6　表达产物的纯化
根据预表达结果 ,选取高效表达菌株 ,以 IPTG
诱导大量表达 ,并离心收集菌体 。菌体可于-20 ℃
保存。称取适量菌体 ,以 20 mmo l/L 磷酸缓冲液
(pH8.0)悬浮 ,加入蛋白酶抑制剂 cocktail set Ⅲ和
溶菌酶(10 mg/mL ,至终浓度 1 mg/mL), 冰上置
30 min。加等体积的 8 mo l/L 尿素磷酸缓冲液
(pH8.0),振荡混匀 2 min;于 4 ℃,10 000 r/min离
心 10 min ,上清液以 0.45 μm 过滤器抽滤后上样
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35 卷第 4 期 李明福等:李属坏死环斑病毒怀柔分离物 CP 基因的克隆 、原核表达及其抗血清制备
Ni-N TA预装柱 ,参考 Invit rogen 公司提供的蛋白
质纯化方法纯化 。
经 SDS-PAGE 和考马斯亮蓝染色分析 ,将含有
洗脱纯化蛋白的收集液以含尿素浓度梯度递减的
50 mmo l/L Tris缓冲液(pH7.4)透析去除尿素 ,并
以紫外分光光度计测定法测定回收蛋白的含量。
1.2.7　抗血清的制备以及效价测定
本试验以从 Ni-NTA 亲和柱纯化得到的较高浓
度和纯度的 CP 蛋白 ,上样 SDS-PAG 凝胶 ,割胶回
收的蛋白条带分别免疫大白兔 。割胶条带用生理盐
水适当稀释后 ,加入等体积福氏不完全佐剂乳化。
免疫大白兔采用肌肉注射结合皮下注射的方式 ,第
一次免疫之后 ,分别于第 21天 、第 42 天和第 70 天
加强免疫 3次。最后一次注射免疫后 7 d 开始少量
静脉采血测定效价 ,根据效价情况分次大量取血 ,制
备的抗血清加入 0.02%的叠氮化钠 , -20 ℃保存 。
抗血清效价的测定:首先用生理盐水分别稀释
抗血清 1 000 、4 000 、8 000 、16 000 、32 000倍 ,抗原
为感染 PN RSV -Hr 的植物样品 1 mg ,加 ELISA
包被缓冲液 1 mL ,制备出测定抗原 ,用健康无感染
PN RSV 的同种植物作为阴性对照 ,用包被缓冲液
为空白对照 ,每个处理做 2 个重复 ,然后用 ELISA
法测定抗血清的效价 。
2　结果
2.1　植物总 RNA提取以及含 CP基因片段的克隆
以带病叶片总 RNA 为模板 ,经 RT-PCR扩增 ,
琼脂糖凝胶电泳检测 ,得到长度约 700 bp 的目的片
段。扩增产物纯化后克隆到 T-vecto r 载体上 。经
过蓝白斑筛选和酶切鉴定 ,得到含有目的片段的阳
性重组子。对所获得的其中 2个阳性克隆进行序列
测定 ,确定了扩增产物的核苷酸序列 , 其中包含
681 bp的 PN RSV CP 序列 ,与 GenBank 报道的 CP
序列一致(U57046)。
2.2　含 CP基因原核表达载体的构建与测序验证
应用特异性引物 F1 和 R1 所获得的 CP 基因
PCR产物经纯化双酶切后 ,连接到同样用 N deI 和
Hind Ⅲ双酶切的质粒 pET29a 载体上 ,重组质粒标
记为 pET29a-PN RSV1 。经 Colony PCR扩增 ,阳性
克隆可以得到 694 bp大小的预期条带(图 1a),抽提
质粒经 N deI 和 Hind Ⅲ双酶切证明得到的阳性重
组子正确。
应用引物对 PN RSV-F2 和 PNRSV-R1 进行
PCR 扩增 , PCR 产物和质粒载体 pET29a 都以
BamHI 和 Hind Ⅲ 双酶切 , 重 组质粒标 记为
pET29a-PN RSV2。同样的方法 , co lony PCR 与质
粒双酶切鉴定阳性重组子(图 1b , c)。
图 1　菌落 PCR和酶切鉴定重组质粒 pET29a/
PNRSV2 和 pET29a/PNRSV1
序列测定最终验证阅读框架正确的重组质粒
pET29a-PN RSV1和 pET29a-PN RSV2 用以 CP 基
因的诱导表达和纯化 。
2.3　CP基因的诱导表达产物 SDS-PAGE分析
将测序正确的重组质粒 pET29a-PN RSV1 或
pET29a-PN RSV2转化大肠杆菌 BL21(DE3)菌株
中 ,并进行 IPTG 诱导表达 , SDS-PAGE 后 ,考马斯
亮蓝染色结果表明:转化 pET29a-PNRSV1 的菌株
经 IPTG 诱导 ,特异性地产生 1条分子量约为25 ku
的蛋白条带;而转化 pET29a-PNRSV2 的菌株经
IPTG诱导后 , 则特异性地产生 1 条分子量约为
29 ku的蛋白条带。蛋白条带的大小与预期相符。
分别挑取的各自 4个独立菌落培养液经 IPTG
诱导后 ,都能产生 PN RSV蛋白的特异性表达;在诱
导 30 min后即有明显的诱导表达条带出现 ,独立菌
落之间的蛋白表达水平略有差别 ,但在 60 ～ 90 min
后达到很高的水平(图 2)。
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图 2　PNRSV CP基因在原核表达系统中
诱导并高效表达的 SDS-PAGE分析
2.4　表达产物的纯化
大量诱导的菌液经离心回收后 ,在变性条件下
以自行装柱的 Ni-N TA 纯化回收表达产物。变性条
件下可以保证包涵体中的 CP 蛋白得到最大限度的
回收 。洗脱收集液经 SDS-PAGE 分析(图 3),结果
表明大多数的特异性表达 CP 蛋白得到纯化 , 而
且纯度较高 。将含CP蛋白纯度较高的洗脱液汇总 ,
并以尿素浓度梯度递减的 50 mmo l/LT ris缓冲液
(pH7.4)透析去除尿素。
研究发现 ,无论 PNRSV CP 蛋白的 N-末端是
否携带 32aa的 S-蛋白 tag ,两种结构的 CP 蛋白表
达产物都为不溶性蛋白 。从纯化柱洗脱以后 ,在溶
液中尿素浓度降低为 2 mo l/L 时 ,蛋白就开始沉淀
析出。为此 ,本研究中以含 4 mo l/L 尿素的蛋白洗
脱液进行 SDS-PAG E ,按照 Hager 等的方法对凝胶
染色[ 9] , 分别切割 25ku 的 PN RSV1 和 29ku 的
PNRSV2蛋白条带 , 切胶回收的蛋白用以免疫大
白兔。
2.5　抗血清的制备和效价测定
将纯化后切胶回收得到的高纯度 CP 蛋白分别
免疫大白兔 ,加强免疫 3 次后获得了 PN RSV 特异
性抗血清。经过 ELISA测定 ,空白对照 A405平均值
为 0.063 ,阴性对照 A405平均值为 0.065 ,而带有 N
段的 CP 免疫抗血清在 1 000 、4 000 、8 000 、16 000
和 32 000稀释倍数时的 A405平均值为分别为0.172 、
0.162 、0.152 、0.147 和 0.131 ,故该抗血清效价为
3.2×104 ,而不带有 N 段的 CP 免疫抗血清效价为
仅为 8 000 ,且抗血清都不与李痘病毒 、黄瓜花叶病
毒等抗原发生反应。
图 3　纯化回收 PNRSV CP蛋白的 SDS-PAGE分析
3　讨论
李属坏死环斑病毒在温带广泛分布 ,在自然和
试验条件下 , 病毒可侵染 21 科双子叶植物。
PN RSV 在李属许多种上引起坏死环斑 ,在欧洲酸
樱桃上引起严重症状 ,引起甜樱桃皱花叶 、杏及玫瑰
花叶病 。李属坏死环斑病毒甚至能侵染未展开叶 ,
从而引起严重症状。PNRSV 被列为我国进境检疫
性有害生物 ,由于其感染率较高 ,对果树种植尤其是
核果类果树栽培是一个严重的威胁 。
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35 卷第 4 期 李明福等:李属坏死环斑病毒怀柔分离物 CP 基因的克隆 、原核表达及其抗血清制备
李属坏死环斑病毒虽然可以侵染一些草本植物
如黄瓜 、烟草等 ,但由于其病毒粒子很不稳定 ,在未
稀释的植物病汁液中侵染活性只有几分钟的时间 ,
Bamet t 的研究报道[ 10] 与本研究经验都表明 ,
PN RSV 接种成功率非常低 ,且病毒粒子不易提纯。
传统的植物病毒抗血清制备以提纯的病毒粒子直接
免疫动物 ,需要的抗原用量较大 ,得到的抗血清中常
含有寄主蛋白的抗体 ,容易导致假阳性反应。本研
究中构建了 pET29a 的原核高效表达系统 , 通过
IPTG 诱导 ,得到了两种结构的 PNRSV 蛋白的大量
表达:都带有 C-末端 6×His尾巴 ,可用于亲和柱纯
化;PNRSV2蛋白另外融合 N-末端 32aa 的 S-蛋白
tag ,PN RSV 1蛋白则去除。C-末端 6×His 尾巴的
融合使得大量表达的外源蛋白回收 、提纯和浓缩变
得简便可行 。而原核高效表达系统获得大量重组蛋
白的周期大大缩短 ,也无需接种病毒到植株和大量
收集染病材料而提纯病毒;同时基因工程表达的重
组蛋白纯化后不含任何的寄主植物成分 ,制备抗血
清特异性强。
研究中发现 ,N-末端携带 S-蛋白 tag 和去除 N-
末端的融合 PN RSV 蛋白在大肠杆菌系统中都得到
了高效表达 , 不同独立菌落间的表达水平相似 ,
IPTG 诱导 30min即有明显的外源蛋白表达。表达
纯化的 PN RSV 蛋白在过柱洗脱后表现出不溶性 ,
较高浓度的蛋白在尿素浓度降低时从溶液中沉淀析
出 ,无法直接免疫动物 ,为此作者采用了蛋白从纯化
柱洗脱后切胶回收的方法。PN RSV 蛋白的不溶性
也许与 PN RSV 病毒粒子在植物汁液中的不稳定以
及接种植株成功率低有关 。
两种结构的蛋白体免疫大白兔都获得了高效价
的抗血清 ,但是 N-末端融合 S-蛋白 tag 的 CP 免疫
抗血清效价为 3.2×104 ,而 N-末端没有融合 S-蛋白
tag 的 CP 免疫抗血清效价仅为 8 000 ,究其原因可
能是 N-末端融合肽段的存在提高了 PN RSV CP 蛋
白的免疫原性 ,或者由于 N-末端融合肽段的存在 ,
使融合蛋白构象的变化正好暴露了 CP 蛋白在病毒
粒子自然状态下的相关抗原决定簇 。
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