全 文 ：　2001年 6月 重庆师专学报 Jun., 2001　
第 20卷　第 2期 Journal of ChongQing Teachers College Vol.20　No.2

苹果属植物组织培养研究进展
查 仁 明
(重庆师专　生物系 ,重庆　永川　402168)
[ 摘　要]介绍了苹果组织培养在育种 、快速繁殖 、苗木脱毒 、种质资源超低温保存等方面的国内外
研究状况 ,对苹果快速繁殖进行了特别详细的介绍。
[ 关键词] 组织培养;苹果;微繁;超低温保存
[ 中图分类号] H94—1　[文献标识码] A　[ 文章编号] 1008—6501(2001)02—0105—03
　　植物组织培养是在本世纪发展起来的。我国从
70 年代开始在许多领域和方面较大规模地开展了
这方面的工作 , 80 年代开始则在园艺植物的培养生
产上得到应用。现在组织培养技术广泛应用于苹果
种质资源保存 、育种 、快速繁殖苗木 、脱毒等方面。
1.育种
1.1 　单倍体植株培养
在常规育种中 ,为得到纯系材料要经多代自交 ,
而单倍体育种经染色体加倍后可以迅速获得纯合的
二倍体 ,大大缩短了育种的世代和年限 , 也有利于突
变种中对隐性突变的分离。1980年中国农科院通过
花药培养获得了花粉植株 , 1991 年开花结果 ,这标志
着我国果树花药培养已处于世界领先地位。
1.2　多倍体的诱导及培养
过去用秋水仙诱导新梢生长点 、叶芽或种子染
色体加倍 ,形成多倍体 , 存在严重嵌合体干扰。改用
试管秋水仙诱变胚性细胞染色体组加倍 , 再由四倍
体单细胞分化不定芽形成植株的新途径 , 排除了嵌
合体干扰 ,成功诱变出大批同质四倍体。从 39个苹
果 、梨二倍体品种 、品系胚培秋水仙诱变苗中筛选出
了 349个同质多倍体新株系。
1.3　原生质体培养及体细胞杂交
苹果体细胞杂交育种多是通过原生质体融合进
行的。取苹果幼芽进行组织培养 ,形成愈伤组织 , 分
离愈伤组织进行悬浮培养获得分散细胞或细胞团 ,
通过物理或化学的方法去壁获得原生质体 , 诱导原
生质体产生愈伤组织 , 进一步诱导根 、芽的分化 , 最
后得到 5株富士原生质体再生植株。用无菌山楂 、
苹果苗作试材进行嫁接 , 取在嫁接部位产生的愈伤
组织进行培养并对其诱导再生不定芽 、根 , 获得了山
楂 、苹果杂交苗 , 开辟了试管育种的新途径。
2.快速繁殖
2.1　无菌外植体的获得
苹果组织培养可用茎尖 、叶(叶柄)、茎段 、子叶 、
胚珠 、花药等作外植体。苹果外植体取下后 ,先用洗
衣粉等洗去灰尘 , 再用自来水冲洗约 20min , 然后用
75%酒精消毒 30s ,再用 0.1%HgCl2 消毒 5—7min , 最
后用无菌水冲洗 3—5 次 , 即可接种到初代培养基
(MS+2mg/ L6-BA)上。
外植体的采取时期影响其成活率。 难咽(Mauls
micromalus)外植体接种最适期为 4—6 月 , 新红星等
最好在展叶 4—5 片时接种生长点 , 污染率低 , 成活
率高 ,易于生长分化。
对苹果等木本果树而言 ,其外植体易在切口或
整株发生褐变 ,从而成为初代培养中影响外植体成
活的主要问题。可以采取一些措施抑制褐变:一是
从幼龄材料上采取外植体;二是培养基中加入 PVP、
谷氨酰胺 、抗坏血酸 、活性炭 、谷胱甘肽 ,皆可有效地
降低褐变率;三是暗培养 , 茎尖等外植体接种到初代
培养基上 ,茎尖开始膨大后转入恒温箱中进行暗培
养(26℃—28℃)36—56 天 , 每个芽分化形成芽丛
30—40 个。另外 ,外植体接种到初代培养基上后连
105
[ 收稿日期] 2001—02—16
[ 作者简介] 查仁明 (1966—), 男, 重庆合川人 , 重庆师专生物系讲师。
续转移几次 ,可提高成活率。
2.2　继代培养
继代培养得到的芽丛剥离后转入继代增殖培养
(MS+0.5mg/L6BA+0.05mg/ LNAA)中培养 , 其培养
条件影响芽生长的好坏。
2.2.1　温度
温度是组培苗生长的重要环境因子 , 温度过低 ,
组培苗生长缓慢甚至完全停止 , 温度一旦正常又恢
复生长;温度过高 , 也会使生长速度下降 , 并可能产
生玻璃化苗。苹果组培的适宜温度范围为:光照
25—28℃/黑暗 18—25℃。
2.2.2　光照
组培苗营养型与普通生长条件下的植物有很大
差异。一方面 ,培养基里有充足的碳源供应 ,即组培
苗有异养性 ,另一方面 , 叶片有较弱的光合作用 , 有
自养性。据报道 , 光照时间长短影响组培苗叶片气
孔密度 ,连续光照下 , 气孔密度最高 , 连续黑暗下气
孔密度最低。苹果每天光照时间 10hr , 光照强度
2000lx。
2.2.3　湿度
水分状况不适 , 琼脂浓度过低是玻璃化苗产生
的主要原因。水分等环境胁迫产生应急乙烯 , 其直
接或间接作用是造成玻璃化苗的原因 , 提高琼脂浓
度 ,当琼脂浓度在 0.7%以上时 , 玻璃化现象趋于消
失。另外 ,培养室的空气湿度也不可忽视 , 要注意适
时调节。
2.2.4　培养基成分
苹果组培大多使用 MS 培养基 , 也有用其它培
养基的 ,如:改良 C-17 培养基培养新红星等。除细
胞及原生质体和根外植体培养时采用液体培养 , 微
嫁接采用液体纸桥培养外 ,一般多采用固体培养。
培养基成分及浓度对组培苗生长有很大影响。
马锋旺等研究了山梨醇和蔗糖两种碳源在苹果组培
上的作用 ,认为其最适浓度均为 30g/L , 两种碳源适
当比例(总浓度为 30g/L)利于芽增殖和生长。氨态
氮浓度过高会导致玻璃化苗产生 , 氨态氮浓度为
20mM/ L以上时 , 培养在培养基(MS +1.0mg/ LBA+
0.25mg/ LIAA+0.7%琼脂)上的第一代乔纳金全部
为玻璃化苗。张毅功等研究认为 , 对根系生长的影
响 ,硼远大于钙 , 而对整株的影响 ,硼小于钙;硼适宜
浓度为 5-6 mg/L ,钙适宜浓度为 40mg/L。
2.3　生根
随着继代培养次数的增加 , 组培苗生根能力增
强。难生根的乔纳森苹果品种第四次继代后 , ABA
含量下降 , IAA/ABA 由初代培养时的 0.2 提高到
0.7 ,生根能力明显增强。生根时生长素的种类不
同 ,对生根的作用也有差异 , 据报道 , NAA 促进生根
能力最差 , IBA生根能力最强 , IBA 通过改变内源激
素水平直接或间接作用于生根 。另外 , 培养基中加
入 3-6 mg/L多效唑 , 可促进生根 , 提高试管苗移栽
成活率。
目前 , 苹果组培苗生根有一步生根法和二步生
根法 ,二步生根法虽然要多转移一次培养基 ,但其生
根率高 ,并且生根驯化后不易污染 , 所以二步生根法
优于一步生根法。 二步生根法的作法是:先把
1.5cm 高度以上的继代苗转入根原基诱导培养基
(0.5%琼脂+3%蔗糖+0.5—1.0mg/ LIBA)中 , 黑暗
条件下培养 5—7天 , 根原基产生后转入不定根伸长
培养基(1/2MS)(不含激素 、蔗糖)中 , 2—3 周后即可
进行驯化处理。
2.4　驯化移栽
生根试管苗 ,光合能力差 , 仅自身光合产物不能
满足其生长发育需要 ,另外 , 组培苗长期处于高湿度
环境(RH85%以上), 叶片的气孔开张超过保卫细胞
的极限 ,需要通过加大光照强度 , 降低空气湿度的驯
练。试管苗锻炼后 , 可使幼苗组织充实 , 叶大而浓
绿 ,根系发育良好 , 提高了抗性 , 是试管苗外移成功
的关键措施。试管苗经生根培养 2—4 周后 ,先打开
培养瓶 ,光照提高为 3000lx ,温度为 18-21℃, 驯化 5
天左右;经驯化后移入消毒的细砂中 , 注意喷雾保
湿 ,能达到 80%以上的成活率 , 经过渡移栽后 , 组培
苗可移入田间 ,成活率可达 90%以上。
3　脱毒
3.1　热处理茎尖组织培养法
把盆栽苗或继代苗置于 38+1℃恒温条件下 ,处
理 21-35天;取 1cm长的处理苗茎尖 , 灭菌后(继代
苗不需要这一步)切取生长点(0.1-0.15cm 长 , 仅有
一个叶原基), 先置于初代培养基中培养 40 天 , 然后
继代培养 2-3次 , 可获得足量的试管苗。
3.2　茎尖微体嫁接培养
利用试管苗作接穗 , 可排除采取接穗时期对微
体嫁接成功率的影响。嫁接苗培养基可采用 MS 液
体培养基 ,平底试管(组培容器)里有一滤纸桥 , 桥上
的小孔可固定嫁接苗。这种方法的优点 , 一是能保
持种质 ,二是愈合和生根同步。
除了目前广泛应用的这两种脱毒方法外 , 一些
研究者提出了一些改进的脱毒方法。如微尖培养
法 ,对褪绿叶斑病毒 、茎沟病毒 、茎痘病毒 、花叶病毒
106
脱毒 , 一次取尖脱毒率分别达 95.16%、97.56%、
97.56%、100%,两次取尖 、脱毒率均可达 100%。 郑
书旗等提出的茎尖二次脱毒方法 , 取的茎尖更大
(0.5-0.7MM), 但可提高成活率 50%以上 , 降低污
染率 10%以上 , 能明显提高繁殖效率 , 且操作简便 ,
易于掌握。另外 ,培养基中加抗病毒药剂 , 脱去了短
枝富士的苹果褪绿叶斑病毒和苹果茎沟病毒。
4.种质资源保存
植物材料首先进行预培养 , 提高细胞分裂的比
例 ,减少细胞内的自由水含量。苹果继代培养苗 ,
5℃低温下驯化 3 -5 周后 , 用玻璃化液预处理
80min ,或经蔗糖溶液预培养 , 然后于无菌空气中干
燥脱水至含水量 30%左右。吴永杰等研究认为 , 休
眠茎尖经冬季的深冷驯化 ,并具有较低的含水量 , 是
超低温保存的良好材料。其次 , 添加冷冻防护剂。
苹果资源保存多用二甲亚砜(DMSO)、甘油 、蔗糖等
糖类。冷冻防护剂可增加溶液的粘性 , ;使温度下降
时溶液内冰的结晶中心的增长速度下降;DMSO 又
易渗透到细胞内部 , 不致使细胞在冷冻和融冰时因
脱水过度 , 受渗透冲击的损失。 再次 , 进行冷冻处
理 ,包括快冻 、预冻 、慢冻 , 慢冻法保存植物材料效果
较好 , 快冻法保存茎尖 , 一般化冻后成活率也可达
70%以上。最后解冻和再培养 , 快速解冻 , 细胞不会
发生再结冰 ,细胞的成活率高 , 用培养液稀释解冻后
的组织和细胞 ,以免产生质壁分离 , 待冷冻防护剂除
去后即可转移到培养基上进行再培养。
[参考文献]
[ 1] Saito A., Suzuki M.Plant cell rep.1999 , 18(7/ 8):549
-553.
[ 2] 刘用生.用试管嫁接进行山楂—苹果无性杂交研
究初报[ J] .河南职技师院学报 , 1993 , 21(1):58-60.
[ 3] Rugini E., Muganu M.Plant cell rep.1998 , 17(6/ 7):
581-585.
[ 4] 达克东 ,张松 ,李雅志.苹果叶柄体细胞胚胎发生
[ J].核农学报 1996.10(2):75-78
[ 5] 金芳.珠美海棠适宜培养基的选择研究[ J] .甘肃
农业科技 , 1996(4):23-24.
[ 6] Krieken W.M.van der , Breteler H., Visser M.H.M.et
al , 1993 , Plant cell rep.1996 , 12(4):203-206.
[ 7] 范昆华 ,蒋震涛.苹果子叶愈伤组织的诱导及植株
再生的研究[ J] .上海农学院学报 , 1993 , 11(3):243-248.
[ 8] 丁爱萍 ,曹玉芬.苹果胚性细胞原生质体培养获再
生植株[ J] .植物生理学通讯 ,1992 , 28(3):206-207.
[ 9] 马宝琨.苹果砧木离体培养快速繁殖的研究[ J] .
河北农业大学学报 , 1991 ,14(3):21-25.
[ 10] 师效欣 ,高仪 ,马宝琨.苹果茎尖培养中无菌繁殖
系建立的研究[ J] .河北农业大学学报 , 1997 ,20(2):45-49.
[ 11] Nomura K., Matsumoto S., Masuda K.et al.Plant cell
rep.1998 , 17(8):597-600.
[ 12] 滕人贵 ,刘丽君 ,蒋秀姬.北斗苹果茎尖培养与移
栽[ J] .北方果树 , 1990(4):15-16.
[ 13] 程家胜 ,史永忠 ,张志云.苹果组织培养中的玻璃
苗问题[ J] .植物生理学通讯 ,1990(1):33-35.
[ 14] ZacchiniM., Morini S., Vitagliano C.Plant cell , tissue
and organ culture , 1997, 49(3):195-200.
[ 15] 师效欣 ,陈四维 ,马宝琨.苹果砧木离体培养中玻
璃化问题的研究[ J] .河北农业大学学报 , 1990, 13(3):12-
16.
[ 16] 张洪胜 ,牟云官 ,辛培刚.苹果离休培养中试管苗
玻璃化现象机理的探讨[ J] .果树科学 , 1991 ,8(2):71-74.
[ 17]Marin M.L., Marin J.A., Plant cell rep.1998 , 18(3
4):350-355
[ 18] 王乔春.影响苹查试管嫁接苗培育的因素[ J] .果
树科学 , 1996 , 13(2):79-83.
[ 19] 马锋旺 ,王飞.山梨醇作碳源对苹果微体繁殖的
效应[ J] .西北农业大学学报 ,1996 , 24(4):102-104.
[ 20] 张毅功 ,李春俭.不同硼浓度及不同硼 、钙处理对
苹果组培苗生长的影响[ J] .河北林果研究 , 1998 , 13(2):
152-157.
Advance in Tissue Culture of Malus
ZHA Ren-ming
(Department of biology , Chongqing Teachers College , Yongchuan , Chongqing 402168 , China)
Abstract:This paper discusses the internal and external studies on breeding , quick propagation , decon-
tamination of shoot , and cold storage of natural resources in Malus tissue culture and recommends in de-
tail of quick propagation of Malus.
Key Words:Tissue culture;Malus;Micro propagation;Cold storage
107