全 文 ：用毕赤酵母表达李属坏死环斑病毒外壳蛋白基因
及表达产物抗血清的制备与研究
陈定虎 刘恭源 杨雷亮 张 博 王 勇 张宪臣
(中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心 广东中山 528403)
基金项目:广东出入境检验检疫局科技项目(2009GDK48)
收稿日期:2012 － 08 － 01
Expression in Pichia pastoris and antiserum preparation of Prunus necrotic ringspot virus CP gene． Chen
Dinghu，Liu Gongyuan，Yang Leiliang，Zhang Bo，Wang Yong，Zhang Xianchen(Inspection Technical Center of
Zhongshan Entry － Exit Inspection ＆ Quarantine Bureau ，Zhongshan 528403，China)
Abstract The CP gene of Prunus necrotic ringspot virus was obtained by RT － PCR and inserted into pGEM －
T vector to formed recombination pGEM － T － PNRSV which was then cloned in Eukaryotic expression vector
pPIC9K and transformed into Pichia pastoris strain GS115，the CP gene was expressed effectively after inducing
with methanol． 40mL PNRSV antiserum was got from rabit immouned with expressed CP and the titer was 3． 2 ×
104 assay by ID － ELISA． The method by using of genetic technique to prepare PNRSV antiserum can throughly re-
duce the risk of the virus escape from propogation．
Key words Prunus necrotic ringspot virus;coat protein;Pichia pastoris;antiserum
摘要 用 RT － PCR的方法克隆李属坏死环斑病毒的外壳蛋白(CP)基因，然后将其连接到 pGEM －
T 载体上，得到 pGEM － T － PNRSV重组载体，然后将其克隆到真核表达载体 pPIC9K 上，转化毕赤酵母
GS115 菌株后，在甲醇的诱导下表达外壳蛋白，表达产物经过 SDS － PAGE 及 Western － blot分析，结果表明
该病毒的 CP基因在毕赤酵母中得到了高效表达，回收表达蛋白并免疫家兔，获得 PNRSV特异性抗血清共
计 40mL，经过间接酶联免疫吸附法测定其效价为 3． 2 × 104，本研究利用基因克隆的方法来制备 PNRSV 抗
血清，完全避免了用该病毒的繁殖来制备抗血清而导致该病毒扩散蔓延的风险。
关键词 李属坏死环斑病毒;外壳蛋白;毕赤酵母;抗血清
中图分类号 S41 － 30
李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot vi-
rus，PNRSV)是我国进境植物检疫性有害生物，是
核果类果树危险性最大的病毒之一，可以侵染李属
植物如桃、油桃、樱桃、李、杏、樱花以及其他属的植
物如月季、苹果和啤酒花果等［1 － 3］，一般可造成
30% ～70%产量损失。且该病毒传播速度快，在短
时间内即可能给整个国家的果树业发展带来灾难
性损失，我国仅有局部发生［4 － 6］。
酶联免疫吸附分析法(ELISA)是目前灵敏度较
高、比较稳定且通量较高的一种成熟的检测方法，是
口岸植物病毒的常规检测和对多个样品的快速检测
的首选方法。本研究采用真核生物即毕赤酵母
(Pichia pastoris)来表达该病毒的外壳蛋白基因。毕
赤酵母由于是真核生物，其表达的产物与原核生物
即大肠杆菌表达的产物具有本质的区别:毕赤酵母
可以对其表达的蛋白进行糖基化、磷酸化、折叠等一
系列表达后的修饰，与天然病毒的外壳蛋白类似，从
而使其表达的蛋白具有生物活性，因此可望制备出
具有反应原性的特异性该病毒的抗血清。
1 研究材料
1． 1 实验材料
PNRSV感病材料由西班牙国家生物技术中心分
子生物学实验室提供，于 －80 ℃超低温冰箱中保存;
马铃薯 X病毒(potato virus X，PVX)、马铃薯 Y病毒
(potato virus Y，PVY)和烟草花叶病毒(tobacco mosaic
virus，TMV)由本实验室保存，健康的桃树、李属和樱
桃叶片等植物对照均购自 AGDIA公司。
1． 2 试剂与仪器
试剂:Trizol 试剂、Taq 酶、M － MLV 反转录酶，
T4 连接酶及甲醇﹑山梨醇﹑ PCR扩增片段回收试
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剂盒、酵母氮碱、RNA 提取试剂盒等均购自广州普
博生物技术公司;限制性内切酶均购自大连宝生物
公司;pPIC － 9K 载体、毕赤酵母 GS115 菌株购自
Invitrogen公司。
仪器:BIOTEK 酶联检测仪、日本梯度 PCR 仪、
Labofuge400R型冷冻高速离心机，高速台式离心
机、DYY －7 型转移电泳仪、Pharmacia EPS601 型电
泳仪、法国 UVP凝胶成像系统、日本 Shimadzu 公司
UV －120 － 02 型可见 －紫外分光光度计等。
2 研究方法
2． 1 病毒样品的保存及鉴定
保存:主要采用 2 种方法，一是选取症状典型
叶片标本速冻干燥后，保存于 － 80 ℃冰箱中;二是
抽提病株总 DNA和 RNA后保存于 － 80 ℃冰箱中。
鉴定:样品先采用血清学方法，主要是 ELISA
进行检测，根据血清学检测结果，再用分子生物学
方法如 PCR检测法进行确证。
2． 2 PNRSV的血清学检测方法
采用常规的间接 ELISA方法进行［7］。
2． 3 总 RNA提取方法
按照 RNA 提取试剂盒推荐的方法进行，提取
的 RNA在 － 70℃保存备用。
2． 4 RT － PCR 扩增目的基因
(1)引物设计
根据已测定的 PNRSV CP基因保守序列设计 1
对引物，上游 PNRSV － F :5 － GT GGATCC TAC
GTA ATGGTTTGCCGAATTTG －3(画线处为 BamHI
酶切位点，斜体为 SnaBⅠ酶切位点) ，下游 PNRSV
－ R:5 － GGAAGCTT GCGGCCGC GATCTCAAG-
CAGGTC －3(画线处为 Hind Ⅲ酶切位点，斜体为
NotⅠ酶切位点) ，并在设计的引物两端即 5及 3
端分别加上了 SnaBⅠ及 NotⅠ酶切位点，引物由北
京奥科生物公司合成。
(2)扩增参数体系
采用大连宝生物公司的试剂盒 PrimeScriptTM
One － Step Ver． 2． 0 进行一步法 RT － PCR 扩增。
PCR 扩增参数:50℃ 30min，94℃ 3min;然后 94℃
1min 60℃ 30s 72℃ 1min，35 个循环;72℃ 10min，
然后 4℃保存。
2． 5 基因克隆及序列测序
(1)PNRSV CP产物的回收:参照 PCR 产物回
收试剂盒回收方法进行，回收的 DNA 在 － 20 ℃保
存备用。
(2)重组质粒的构建
采用 pGEM － T载体进行 TA克隆，构建重组
质粒，连接反应方法按 pGEM － T 试剂盒推荐的
方法进行。
(3)感受态细胞制备、转化及重组质粒的抽提
感受态细胞制备、转化采用氯化钙法，重组质
粒的抽提采用碱裂解法抽提质粒 DNA，具体参考
《分子克隆实验指南》方法［8］。
(4)重组质粒的鉴定
采用特异引物 PCR 鉴定、酶切鉴定及序列测
定 3 种方法进行。
2． 6 PNRSV CP基因真核表达载体的构建
用 PCR扩增出 PNRSV CP基因，然后回收该基
因片段后用 SnaBⅠ和 NotⅠ双酶切，再与用同样双
酶切的载体 pPIC9K 相连接构建成表达载体
pPIC9K － P，将 pPIC9K － P转化大肠杆菌 JM109 后
经筛选培养基筛选，碱法提取其重组质粒，然后用
酶切及 PCR进行鉴定。将筛选出的阳性重组子送
至宝生物工程(大连)有限公司进行 DNA 测序，以
验证阅读框的正确性。
2． 7 酵母菌的转化及 CP基因的诱导表达
序列分析验证后，再用酶 BglⅡ将表达载体
pPIC9K － P线性化，然后通过电转移方法将该表达
载体导入酵母 GS115 菌株的感受态细胞，具体操作
按 Invitrogen公司 Pichia Expression Kit程序进行。
2． 8 表达蛋白分子量的测定
取 1mL酵母发酵液，13 000rpm离心 15min，取上
清 10μL进行 SDS －PAGE，电泳后用考马斯亮兰染色。
2． 9 表达蛋白 Western － blot检测
SDS － PAGE电泳后将表达蛋白电转移到硝酸
纤维素膜(NC)上，然后用 PNRSV 抗血清作为一抗
与 NC膜上的蛋白进行免疫反应，之后再用第二抗
血清即碱性磷酸酶标记的羊抗兔抗血清对表达蛋
白进行特异性鉴定，以未用甲醇诱导的酵母培养液
作为阴性对照。
2． 10 表达产物的纯化及抗血清制备
回收表达产物并免疫家兔制备抗血清［7］。
2． 11 抗血清效价及特异性测定
将抗血清进行一系列稀释后，用 ELISA方法测
定抗血清的效价和特异性［7］。
3 结果与分析
3． 1 提取植物总 RNA以及 CP基因片段的克隆
以带病叶片总 RNA为模板，经 RT － PCR扩增，
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经琼脂糖凝胶电泳检测，得到长度约 675bp 的 DNA
目的片段。扩增产物经纯化后克隆到pGEM － T
载体上，经蓝白斑筛选和酶切鉴定，对所获得的阳性
克隆进行序列测定，确定了扩增产物的核苷酸序列，
其中包含 675bp 的 PNRSV CP 序列，与 GenBank 报
道的 CP序列完全一致。
3． 2 含 CP基因重组载体的 PCR鉴定
应用特异性引物 PNRSV － F和 PNRSV －R所获
得的 CP基因 PCR 产物经双酶切后，连接到同样用
BamH1和 HindIII双酶切的克隆载体上，组建成重组
载体。经细菌转化后用 PCR鉴定，阳性克隆可以得
到 675bp大小的条带，如图 1所示。
图 1 PNRSV重组质粒 PCR鉴定
M．表示 100bp ladder DNA Marker;2、3、5、6 号转化子有 PNRSV CP
基因片段插入;1、4．无 CP基因插入
3． 3 表达载体 pPIC9K － PNRSV的鉴定
表达载体 pPIC9K － PNRSV 的构建策略如图 2
所示，对表达载体 pPIC9K － PNRSV 分别用 PCR 及
SnaBⅠ /NotⅠ双酶切鉴定及 PCR 扩增，结果表明
PNRSV CP 基因已经克隆于表达载体 pPIC9K 上，
对表达载体进行序列分析，结果发现 CP 插入方向
及位置完全正确，可以进行下一步诱导表达。
图 2 真核分泌型表达载体 pPIC9K －PNRSV的构建
3． 4 PNRSV CP 基因的诱导表达及表达蛋白的
SDS － PAGE分析
带有表达载体的 GS115 在 28℃条件下，在 BM-
MY培养基连续培养 96h 后，取培养基上清经 SDS
－ PAGE 电泳分析，发现在泳道中有一条非常明显
的蛋白条带，大小约为 25Ku，而在未诱导的阴性对
照中几乎看不到任何蛋白条带，经测定其蛋白表达
量约为 50 ～ 60μg /mL上清，如图 3。
图 3 酵母表达蛋白 SDS － PAGE分析
1． Marker(Ku) :15，20，31，43，66． 2;2．表达蛋白;3．阴性对照
3． 5 表达蛋白的鉴定
经 Western － blotting分析发现表达蛋白条带能
够与 PNRSV兔抗血清发生特异性的免疫反应，说
明 PNRSV CP 基因在酵母中得到了正确表达，如
图 4。
图 4 表达蛋白 Western － blotting特异性检测
1．甲醇诱导的表达产物;2．阴性对照
3． 6 表达产物的纯化
大量诱导的菌液经 SDS － PAGE 电泳染色后，
切下 25ku的表达蛋白条带作为直接免疫原。
3． 7 抗血清的制备和效价及特异性测定
将切下得到的 CP 蛋白免疫大白兔，获得了
PNRSV 特异性抗血清 40mL。经过 ELISA 测定其
抗血清效价为 3． 2 × 104，见表 1，经 ELISA 检测验
证，该抗血清均与 PVX、PVY、TMV 及健康的桃树、
李属和樱桃叶片(阴性对照)等植物没有血清学
反应。
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表 1 抗血清效价的测定
抗血清稀释倍数 1 /1000 1 /4000 1 /8000 1 /16000 1 /32000 空白对照 阴性对照
OD450nm 0． 186 0． 152 0． 146 0． 145 0． 138 0． 039 0． 065
0． 158 0． 159 0． 148 0． 146 0． 134 0． 041 0． 066
平均值 0． 172 0． 156 0． 147 0． 146 0． 136 0． 040 0． 066
4 结论与讨论
李属坏死环斑病毒是我国进境植物检疫性有
害生物，目前我国对该病毒的研究不多，相关研究
文献还很少，血清学方法尤其是酶联免疫吸附法在
今后一段时间内仍然是口岸一线种苗病毒检测的
最主要方法，但是血清学方法需要阳性对照和该病
毒的抗血清，由于该病毒在果树体内含量非常低且
不稳定，繁殖困难，因此要大量提纯该病毒并制备
高效价的抗血清就变得十分不易。目前，国内还需
要高价从国外购买抗血清，且定货时间长，急需我
们自己制备检测该病毒的抗血清和阳性对照，并做
成酶联检测试剂盒，以满足我国对该病毒检测任务
日益增长的需要。
本研究采用的真核生物即毕赤酵母来表达该
病毒的外壳蛋白基因，因为它具有不同于其他表达
系统的优势:第一，它有先进的异源蛋白折叠途径，
当使用酵母分泌信号序列时，可以分泌经正确折叠
和加工的蛋白质，因此有功能的和完整折叠的异源
蛋白可以分泌到培养基中;第二，它可以在简单的
培养基中快速生长，并能高效发酵，生产异源蛋白。
因此自 1980 年以来，酵母一直被用来大规模生产
人、动物及植物来源的蛋白质。国外已有多种蛋白
酶及抗体等基因得到了高效表达，一些已经商品化
生产，而国内应用的还不很多，但也有外源基因表
达的报道，如恶性虐裂殖子表面蛋白 1(MSP1)［9］
及人血清白蛋白(HAS)均在毕赤酵母中得到了成
功表达［10］。
本研究构建的是一种分泌型 Muts 表达载体，
即含表达载体的酵母菌株在含甲醇的培养基上生
长缓慢，其表达的异源蛋白可以分泌到培养基中，
由于酵母本身不分泌内源蛋白，使目的基因表达的
蛋白质纯化比较方便。我们在实验中发现阴性对
照的培养基上清在电泳道上几乎看不到任何蛋白
条带，而在经诱导的培养基上清在电泳道中有一条
非常明显的目标蛋白条带，这样就可以比较容易地
分离出表达的目的蛋白，以便对其作进一步研究。
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