全 文 ：北方园艺 2008(12):161 ～ 163 ·生物技术 ·
第一作者简介:陈红(1983-),女 ,山东菏泽人 ,硕士,研究方向为观
赏植物种质资源。 E-mail:chenhong19830909@126.com。
通讯作者:臧德奎。 E-mail:zangdk@sdau.edu.cn。
基金项目:山东省优秀中青年科学家奖励基金资助项目(2004BS
06003);山东农业大学博士基金资助项目(23215)。
收稿日期:2008-07-30
适于木瓜属植物AFLP分析用 DNA提取方法研究
陈 　红1 , 张 　雷1 , 吕 晓贞2 , 孙永山3 , 郑 　林1 , 臧 德奎1
(1.山东农业大学林学院,山东 泰安 271018;2.杭州市园林绿化工程有限公司 ,浙江杭州 310016;3.东营市东营区城市管理局 ,山东东营 257000)
　　摘　要:利用改进的CTAB 法提取了29个木瓜属品种的基因组DNA ,并进行了AFLP 分析。
结果表明:该方法提取的 DNA 溶液无色透明 ,紫外分光光度计测得 A260/A280值为 1.8 ～ 2.0 ,
0.8%琼脂糖胶电泳为清晰的一条带 ,RNA去除干净 ,无降解现象;AFLP分析条带清晰 ,多态性
好。说明该方法完全适于 AFLP 分析。
关键词:木瓜属;DNA提取;AFLP
中图分类号:S 685.99;Q 946.2　文献标识码:A　文章编号:1001-0009(2008)12-0161-03
　　木瓜属(Chaenomeles)植物属于蔷薇科 ,是重要的观
赏和药用植物。近些年 ,国内外学者对其进行了栽培繁
殖、形态分类 、孢粉学分类 、数量分类 、观赏特性 、化学成
分及提取和药用食用价值等方面的研究[ 1-7] ,但其叶片
DNA提取比较困难 ,目前尚无该类植物的 AFLP 分子
标记方面的研究。为此 ,进行了木瓜叶片 DNA 提取的
研究 ,并总结出适宜 AFLP 分析用的木瓜基因组 DNA
提取的有效方法。AFLP试验成功的关键是高质量的基
因组 DNA的制备 ,但由于木瓜属植物的叶片内多酚类
物质及多糖等次生代谢物质及色素等干扰物质 ,直接影
响了 Taq-DNA聚合酶的活性 ,常导致扩增反应失败[ 8] 。
经研究 ,总结了一种适于该类植物AFLP 分析用的DNA
提取方法 ,为AFLP技术有效地用于其系统进化及亲缘
关系的研究提供依据。
1　材料与方法
1.1　试材
试材来自山东农业大学木瓜种质资源圃(泰安)和
山东省临沂市河东区。共 29个品种 ,分别为:`醉杨妃
C.cathayensis `Zui Yangfei ;`罗扶 C.cathayensis
`Luofu ;`长俊 C.cathayensis `Changjun ;`一品香
C.cathayensis `Yipin Xiang ;`报春 C.speciosa `Bao-
chun ;`多彩 C.speciosa `Toyo Nishiki ;`凤凰木 C.
speciosa `Fenhuang Mu ;`红星 C.speciosa `Hongx-
ing ;`红霞 C.speciosa `Hongxia ;`夕照 C.speciosa
`Xizhao ;`猩红与金黄 C.× superba `Crimson and
Gold ;`长寿乐 C.× superba `Changshoule ;`绿宝石
C.× superba `Lǜ Baoshi ;`紫衣 C.×superba `Ziyi ;
`大富贵 C.× superba `Da Fugui ;`红宝石 C.×
superba `Hong Baoshi ;`复长寿 C.× superba `Fu
Changshou ;`碧雪 C.× superba `Bixue ;`沂红 C.×
superba `Yi Hong ;`粉蝶 C.× superba `Fendie ;`红
舞 C.× superba `Hongwu ;`沂橙 C.× superba `Yi
Cheng ;`骄阳 C.× superba `Jiaoyang ;`单白 C.ja-
ponica `Danbai ;`单粉 C.japonica `Dan Fen ;`日落
C.japonica `Riluo ;`矮红 C.japonica `Pygmaeus ;
`日本红 C.japonica `Rubra ;`四季红 C.japonica
`Siji Hong 。取嫩叶提取 DNA 。
1.2　试剂
CTAB 缓冲液 2%(W/V)CTAB ,1.4 mol/L NaCl ,
20 mmol/L EDTA(pH 8.0),100 mmol/ L Tris-HCl(pH
8.0),3%PVP-40 ,5%(V/V)β-巯基乙醇。
1.3　方法
1.3.1　DNA的提取　取幼嫩叶片 2 ～ 3 g 放入液氮预
冷的研钵中 ,在液氮下将嫩叶迅速研磨成粉末。立即将
粉末转入 1.5 mL离心管中 ,加 700μL已预热至65℃的
CTAB 缓冲液 , 充分混匀。在 65℃水浴保温 45 ～
60 min ,其间小心颠倒摇动使之充分受热。加入等体积
的 Tris-饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1 ,V/V/V),充
分混匀 10 min ,12 000 r/ min离心 10 min。取上清液于
新离心管中 ,加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1 ,V/V),混
匀 10 min ,12 000 r/ min离心10 min。取上清加1/10体
积的 NaAc(3 mol/L ,pH 5.2)和 2倍-20℃预冷的无
水乙醇 ,并在-20℃冰箱内静置 5～ 10 min后取出 ,用枪
头轻轻将沉淀钩出 ,70%乙醇反复冲洗 ,干燥。加入
40μL 无菌水 ,在室温下溶解 DNA(12 h 以上),12 000
r/min离心10 min ,去除不溶解物质 ,将上清液转入干净
离心管中 ,加入 1 μL无 DNA酶的 RNase(10 mg/mL)
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37℃保温1～ 2 h ,用等体积氯仿∶异戊醇(24∶1 ,V/V)
在12 000 r/min下离心 10 min ,取上清。重复抽提1次 ,
上清液加 1/10体积的 NaAc(3 mol/L ,pH 5.2)和 2倍
体积的无水乙醇 ,混匀 , -20℃静置 10 min ,12 000 r/min
离心20 min ,弃上清。75%的乙醇漂洗 3次 ,室温风干后
用50μL 无菌水溶解 ,4℃下溶解 1 ～ 2 d ,4℃冰箱保存 ,
或-20℃长期保存。
图1　木瓜品种的基因组DNA
1.3.2　DNA的质量检测　DNA紫外吸收值。天然双
链DNA在260 nm处的吸收值与在 280 nm处的吸收值
之比应在 1.8左右 ,低于 1.8说明可能残存蛋白质及氨
基酸 、酚类等小分子杂质 ,高于 1.8则说明提取的 DNA
中可能还含有 RNA 。取10μL DNA溶液用 TE稀释至
400μL ,在紫外分光光度计上检测 DNA的浓度及纯度;
DNA的电泳检测。取5μL DNA样品 ,加入 2μL Load-
ing Buffer于0.8%琼脂糖凝胶中电泳 ,EB染色 ,拍照 ,判
断DNA分子量大小及完整程度。
1.3.3　AFLP分析　按王卓伟[ 9]方法进行 ,并按北京鼎
国公司提供的银染试剂盒及方法进行银染。
图 2　29 个品种的 AFLP图谱:引物组合
EcoRI-AAG +MseI-CAA
2　结果与分析
应用此改进的CTAB 法提取了29个木瓜属品种的
基因组DNA ,在提取过程中未出现多酚类物质的褐化现
象。获得的DNA溶液无色透明 ,紫外分光光度计测得
其 A260/A280为 1.8 ～ 2.0之间 ,取 10 μL DNA 溶液在
0.8%琼脂糖胶电泳 ,结果如图 1。表明所提 DNA主带
清晰 ,DNA片段比较完整 ,无降解现象。利用此方法提
取的 DNA在引物组合 EcoRI-AAG+MseI-CAA下的
AFLP分析结果见图 2。表明 AFLP 带纹相当丰富 ,在
不同的材料间表现出丰富的多态性。因此 ,用上述方法
提取的 DNA质量好 、纯度高 ,AFLP 分析效果好。
2.1　抗氧化剂的作用
高质量的 DNA模板制备是 AFLP 试验成功的关
键。AFLP 每个反应要求 100 ～ 500 ng DNA ,如果 DNA
模板量不足 ,或制备过程中被盐 、EDTA 、蛋白质等污染 ,
则选择性扩增产物在 5%～ 6%的变性聚丙烯酰胺凝胶
上经过电泳分离后不能形成AFLP指纹 ,或显出的条带
非常弱。木瓜属植物叶片含多糖 、酚类物质很多 ,采用
一般的 DNA提取方法如 SDS 法 ,提取的 DNA往往不
能达到 AFLP所要求的纯度 ,内含杂质 ,部分发生氧化 ,
颜色为浅褐色。这些浅褐色的非可溶性物质与DNA结
合 ,影响了 Taq(DNA 酶)的活性 ,从而导致 AFLP 扩增
失败。因此 ,在提取 DNA时 ,必须将这些物质去除。多
数报道是在提取液中加 β-巯基乙醇与水溶性PVP ,但该
研究发现对木瓜属植物而言这种方法效果不理想。针
对该类植物叶片中多糖 、多酚 、色素等物质含量较高的
特点 ,研究采用了改良的 CTAB 法提取叶片 DNA , 2%
的 CTAB 裂解缓冲液中加入 3%非水溶性 PVP-40和
5%β-巯基乙醇。非水溶性的 PVP ,可防止酚类氧化为
醌类 ,有效去除多糖 ,避免溶液变褐[ 10] ;β-巯基乙醇作为
还原剂和抗氧化剂 ,也可防止材料中的酚类氧化[ 11] ,将
其浓度由 2%提到 5%,效果更为理想。需要注意的是
β-巯基乙醇 、PVP-40等防止酚类物质氧化的物质 ,不易
久放 ,应随用随配。
2.2　DNA提取方法
该研究还改进了操作流程 ,进一步减少了色素和其
他物质的影响 ,提高了模板 DNA 的纯度。首先在第一
次无水乙醇沉淀后 ,用细玻棒钩出絮状沉淀 ,反复漂洗 ,
而不是离心 ,这不仅能使 DNA 沉淀和其他杂质分开 ,而
且 DNA沉淀在松散状态下漂洗 ,可以洗去粘附在上面
的大部分色素;其次将已充分溶解过的 DNA溶液高速
离心 ,弃沉淀 ,从而能除去附着在 DNA上的不溶物;最
后 ,在无水乙醇沉淀DNA时 ,加入 NaAc以产生大量的
DNA沉淀。由于 DNA在乙醇的盐溶液中的沉淀速度
大于色素 、多糖和酚类等物质[ 12] ,所以用有机溶剂沉淀
DNA时间宜短 ,尽可能减少共沉淀。经过以上处理 ,得
到的 DNA经过氯仿/异戊醇(体积比为 24∶1)多次抽
提 ,RNA酶去除 RNA ,再经 70%乙醇多次洗涤 ,最终能
保证获得高质量的模板 DNA。经测定 ,供试材料 DNA
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的A260/A280值在 1.8 ～ 2.0 之间。另外 ,该类植物的
DNA提取受季节干扰较严重 ,最好选择春季提取。
综合上述结果看出 ,该方法所提取木瓜 DNA纯度
高 ,完全适于进行AFLP 等分子生物学试验。
3　小结
改良后的 CTAB法增加了 3%的非水溶性 PVP和
5%巯基乙醇 ,防止酚类物质的氧化 ,并有效去除了多
糖。操作流程上的改进包括用细玻棒钩出絮状沉淀;无
水乙醇沉淀都加入 NaAc ,以产生大量的 DNA沉淀 ,并
缩短沉淀时间。这些做法均在一定程度上减少了多糖 、
色素 、酚类物质等杂质 ,提高了DNA的纯度和质量。
用该方法提取的 DNA 作 AFLP 分析 , AFLP 带纹
相当丰富 ,在不同的材料间表现出丰富的多态性 ,AFLP
分析效果较为理想。
参考文献
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DNA Extraction Method for AFLP Analysis in Chaenomeles
CHEN Hong1 , ZHANG Lei1 , LV Xiao-zhen2 , Sun Yong-shan3 , ZHEN Lin1 ,ZANG De-kui1
(1.Forestry College , Shandong Ag ricultural University , Taian , Shangdong 271018;2.Hangzhou ParkQ reen Co., Ltd , Hangzhou , Zhejiang
310016 , China;3.Dongying District Management Bureau of Dongying City , Dongying , Shandong 257000 , China)
Abstract:The Genomic DNA samples of 29 cultivars in the genus Chaenomeles were isolated by modified CTAB method
and then AFLP analysis was conducted.The result indicated that the DNA ex tracted by this method appeared as a clear
band when electrophoresed in 0.8%agrarose gel , and the RNA was eliminated completely.Measured the DNA by smart
spec TM 3 000 , the value of A260/A280was 1.80 ～ 2.0.AFLP analysis indicated the primer(EcoRI-AAG +MseI-CAA)
produced clear polymorphic pat terns.Therefore this method could be used for extracting ideal DNA samples and be suit-
able for AFLP.
Keywords:Chaenomeles;Extraction of DNA;AFLP
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