全 文 ：2013年 第14卷 第3期0 4 5 5
植物 DNA提取是后续分子实验的基础，其质量
优劣直接影响下一步实验的成败，一般使用新鲜叶
片或硅胶干燥叶片。近些年来，由于地域限制、资金
等问题，一些未及时硅胶干燥的植物 DNA材料和腊
叶标本也成为重要的 DNA提取材料，但一直存在提
取的 DNA质量差的问题［1-4］。一方面是由于 DNA的
降解［1］，另一方面植物含有的次生代谢产物，如多糖
和多酚类，影响 DNA提取，并造成 DNA的污染 ［2］。
我国远志属有 42种 8变种［5-6］，其中药用 22种［7］，主
要含有皂苷、口山酮、寡糖酯类［7-11］。我们在对远志属
植物进行 DNA提取时，DNA材料包括硅胶干燥叶
片材料、常温干燥并保存 1年的叶片材料和腊叶标
本 3种，实验中发现常温干燥并保存 1年的叶片材
料和腊叶标本材料用常规 CTAB法无法提取到顺利
进行后续 PCR反应的 DNA。本研究以该属 4种植
物为例，对 3种来源的 DNA材料进行 DNA提取方
法的优化研究，该研究将为扩大 DNA提取材料范围
提供依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
本研究 DNA提取材料除了远志使用 3种叶片
材料外，即硅胶干燥叶片、常温干燥并保持 1年的样
品及腊叶标本外，其余均为腊叶标本叶片材料，凭证
标本存于中国科学院植物研究所标本馆（PE）。样品
来源见表 1。
1.2 实验方法
表 1 远志样品来源
编号 来源 采集地 保存方法及时间 凭证标本
1 远志 Polygala tenuifolia 山西新绛 硅胶干燥叶片 Fanjie1687（SCTCM）
2 远志 Polygala tenuifolia 山西灵丘 常温干燥并保存 1年 Fanjie1688（SCTCM）
3 远志 Polygala tenuifolia 陕西绥德 常温 59年 00631932（PE）
4 肾果小远志 Polygala furcata 四川延边 常温 11年 01853422（PE）
5 华南远志 Polygala glomerata 江西上犹 常温 6年 01853567（PE）
6 红花远志 Polygala tricholopha 云南屏边 常温 60年 00744070（PE）
PE：中国科学院植物所标本馆；SCTCM：山西中医学院
远志属 4种药用植物不同干燥方法叶材料 DNA提取方法研究
樊 杰，申飞翔，何 益，马全级，箫 迪，白 妍，束明月
（山西中医学院，山西 太原 030024）
摘要 目的：以远志属药用植物为例，对经过不同干燥方法的叶片材料进行 DNA提取方法优化研究。方法：在改良CTAB法
的基础上，对水浴时间、水浴温度、沉淀时间进行优化。结果：降低水浴温度为 45 ℃，延长水浴时间为 5 h，延长沉淀时间
为 1 h，可以从常温干燥并保存 1年的叶片材料和腊叶标本叶材料中提取到用于 PCR反应的 DNA。结论：硅胶干燥叶片
用改良 CTAB法可以得到满足后续 PCR反应的 DNA；对常温干燥并保存 1年的干叶片和腊叶标本叶材料，一定时间的
低温水浴是提取到满足后续 PCR实验 DNA的关键。
关键词 远志属；DNA提取；改良 CTAB法
中图分类号：R285.5 文献标识码：Ａ 文章编号：1671-0258（2014）05-0035-03
［基金项目］山西省自然科学基金项目（2012011034-2）；山西中医学院博士科研启动基金项目（2014）
［作者简介］樊杰，博士，讲师，E-mail：fanjie6789@163.com
A study on DNA extraction from leaves dried with different methods of four medicinal plant
in genus Polygala
Fan Jie，Shen Feixiang，He Yi，Ma Quanji，Xiao Di，Bai Yan，Shu Mingyue
（Shanxi College of TCM，Taiyuan Shanxi 030024）
Abstract Objective：Optimization of DNA extraction methods for leaf samples of Polygala medicinal plants dried with
different methods. Methods：Based on improved CTAB metheod，links of experiment including water bath time and tem－
perature，precipitation time，et al.，were optimized. Results：Low water bath temperature at 45 ℃ for a somewhat long time
of 5 h and a appropriate prolonged preciation of 1 h can extract DNA for PCR reaction from dried leaf under normal tem－
perature for 1 year and specimens. Conclusion：DNA obtained from leaf dried with silica gel using improved CTAB
method can be used for subsequent PCR reaction；Low temperature water bath for some time is the key of DNA extraction
for dried leaf under normal temperature for 1 year and specimens.
Key words Polygala L.；DNA extraction；improved CTAB method
中药制剂工程与技术
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2013 Vol.14 No.314 Vol.15 No.5
1.2.1 DNA提取方法 除远志硅胶干燥材料仅使用
改良 CTAB法外，其他材料都进行了改良 CTAB法 1-
5实验。改良 CTAB法参考 Doyle and Doyle（1987）［12］。
主要过程为：取 0.1 g腊月标本叶片材料，加 0.01 g
PVP在提前-20 ℃预冷的研钵中迅速研磨至粉状，迅
速转移到预热至水浴温度并提前加入 7 μL β-巯基乙
醇的 CTAB溶液中水浴，氯仿：异戊醇（24∶1）抽提 2
次，加入三分之二体积的提前-20 ℃预冷的异丙醇，
轻轻上下颠倒 3次，-20 ℃ 30 min，用 70%乙醇清洗
2次，晾干后，加入 1×TE溶液溶解。
在改良 CTAB法［12］基础上，我们根据一些已有
的研究，对水浴温度、水浴时间、CTAB浓度、沉淀时间
等进行了优化研究［2-3］（改良 CTAB法 1-5见表 2）。
1.2.2 DNA质量检测方法
1.2.2.1 琼脂糖凝胶电泳法 用 0.8%的琼脂糖凝
胶电泳。取 5 μL DNA样品，加 3 μL上样缓冲液混
匀后，加入胶孔内，在 100 V电压下电泳 40 min。
1.2.2.2 PCR扩增及测序检测 PCR扩增片段为核基
因片段 ITS。除远志硅胶干燥叶片材料外，其余材料
提取的 DNA均无法一次扩增成功，分为 ITS1和ITS2
两段进行扩增。采用参考文献［13］中的引物，ITS1
片段使用的引物为 ITS forward：5′- cga gaa gtc cac
tga acc tta tc -3′和 ITS internal reverse：5′- gcg ttc aaa
gac tcg atg gtt c-3′，ITS2片段使用的引物为 ITS inter－
nal forward：5′- gactctcggcaacgg atatctcggc-3 和 ITS
reverse：5′-tcttytcctccgcttattgatatgc-3′。PCR总体积为
25 μL，包括：12.5 μL Mix（Takara Premix Taq），10 μM
引物各 0.5 μL，0.5 μL～1 μL模板（10 ng～50 ng），用
灭菌超纯水补足反应体积。ITS扩增程序为：94 ℃，
3 min；33个循环：94℃，1 min；58℃，1 min；72℃，1 min
20 s；72 ℃，6 min。PCR产物用 1%琼脂糖凝胶电泳
检测。PCR产物送华大基因测序。
1.2.2.3 核酸测定仪检测 核酸蛋白质测定仪为
Eppendorf BioPhotometer plus。除远志硅胶干燥材料
提取 DNA外，其余 DNA用灭菌超纯水稀释 10倍后
进行检测。测定的指标主要为：A260/A280，表示
DNA 纯度，A260/A280 在 1.8～2.0 之间表示无蛋白
质污染；DNA含量的单位为 μg/mL。
2 结果与分析
2.1 基因组 DNA电泳分析
在紫外分析仪上观察，除远志硅胶干燥叶片材
料外，其余材料提取的 DNA均无条带，也无弥散。说
明 DNA浓度太低，琼脂糖凝胶电泳失败。
2.2 PCR扩增及测序
远志硅胶干燥材料可以一次完成 ITS 片段扩
增。其余材料提取的 DNA则只能分别扩增 ITS1和
ITS2 片段。用改良 CTAB 法 1、2 提取的 DNA 在
PCR扩增后均无结果；除远志常温干燥并保持 1年
的材料外，其余样品用改良 CTAB法 3提取的 DNA
在 PCR扩增后均无结果；除红花远志外，改良 CTAB
法 4 提取的 DNA 在 PCR 扩增后在相应位置有条
带；用改良 CTAB法 5提取的 DNA在 PCR扩增后
在相应位置均有条带且测序成功，Blast表明均为远
志属序列，GenBank序列号见表 3。
2.3 DNA检测结果
用改良 CTAB法 5提取的 DNA其 A260/A280值
范围为 1.50～1.99，含量范围为 243.00 μg/mL～1 144.00
μg/mL（见表 3）。其中华南远志的 A260/A280值为
1.50，说明纯度不够，有蛋白质污染。核酸测定仪检测
DNA含量均满足 PCR反应，但部分样品纯度不够。
3 讨 论
常温干燥并存放一年的远志叶片材料和腊叶标
本叶片材料使用改良 CTAB法，65 ℃水浴 1 h，提取
的 DNA无法进行后续的 PCR反应。将水浴温度降
低为 45 ℃，水浴 5 h，可以得到进行后续 PCR反应
的 DNA，并完成测序。常温干燥材料和腊叶标本材
料染色体中与 DNA结合的核蛋白不易分离，需要降
低水浴温度并延长水浴时间，才能够让足够多的
DNA游离出来，同时不造成 DNA的进一步降解［2-3］。
表 3 改良 CTAB法 5提取的 DNA检测结果及 GenBank序列号
种名 保存方法及时间
DNA含量
（μg/mL） A260/A280
GenBank序列号
ITS1 ITS2
远志 常温干燥并保存 1年 354.00 1.76 KJ462466 KJ490655
远志 常温 59年 304.00 1.98 KJ462464 KJ462470
肾果小远志 常温 11年 539.00 1.79 KJ490654 KJ490656
华南远志 常温 6年 243.00 1.50 KJ490653 KJ490657
红花远志 常温 60年 1144.00 1.99 KJ490652 KJ490658
表 2 DNA提取步骤的优化实验
序号 提取方法
水浴温度
（℃）
水浴时间
（h）
沉淀时间
（h）
抽提
次数
CTAB
浓度
1 改良 CTAB法 65 0.5-1 0.5 2 2×
2 改良 CTAB法 1 65 1 0.5 2 3×
3 改良 CTAB法 2 55 5～6 5 2 2×
4 改良 CTAB法 3 50 5～6 5 2 2×
5 改良 CTAB法 4 45 5～6 5 2 2×
6 改良 CTAB法 5 45 5～6 1 2 2×
2×：每 100 mL水溶液中含有 2 g CTAB（十六烷基三甲基溴
化铵）
中药制剂工程与技术
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图 4 空白微乳粒径分布图 图 5 载药微乳粒径分布图
3 讨 论
本实验考察了不同表面活性剂、助表面活性剂
和油相等对微乳形成区域的影响，并根据伪三元相
图与微乳的载药能力确定当 Km为 1.5∶1时，微乳区
域面积最大。综合考虑微乳的流动性、稳定性、粒径
和表面活性剂的用量，在混合乳化剂与油的比例选
取为 9∶1 时，确定聚山梨酯-80、无水乙醇、油酸乙
酯、蒸馏水、远志 50％醇提取物的比例为 27∶18∶5∶100∶
2.8形成的微乳最好。
参考文献
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（编辑：张世霞）
已有的报道中水浴温度范围为55 ℃～60 ℃，水浴时
间 1 h～5 h［2-3］。可以看出，不同植物类群的腊叶标
本，水浴温度和水浴时间需要筛选。
一般认为存放时间越久，腊叶标本中 DNA降解
的越严重；但最近的研究表明其影响要比不同植物
类群及不同制作方法造成的影响小得多［1，14-15］。本研
究也基本验证了这个观点，6年～60年的腊叶标本，
提取的 DNA质量与存放时间没有明显的相关性。
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（编辑：翟春涛）
（上接第 29页）
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