全 文 ：第 18卷第 4期 海 南 大 学 学 报 自 然 科 学 版 Vol.18 No.4
2000年 12月 NATURAL SCIENCE JOURNAL OF HINAN UNIVERITY Dec.2000
　　文章编号:1004-1729(2000)04-0383-05
收稿日期:2000-03-10
基金项目:热带作物生物技术国家重点实验室开放基金资助项目
作者简介:罗素兰(1969-),女 ,四川营山人 ,海南大学农学院副教授 , 博士.
葡萄属植物的基因组 DNA
提取及 RAPD体系优化
罗素兰1 ,周　鹏2 ,贺普超3 ,郑学勤2
(1.海南大学 农学院 , 海南 海口 570228;2.热带作物生物技术国家重点实验
室 , 海南 海口 571101;3.西北农业大学 园艺系 , 陕西 杨凌 712100)
摘　要:采用 CTAB 改良法提取葡萄属 7 种植物的基因组 DNA ,对其完整性进行了测定 ,并以
此为模板进行 RAPD反应.对 RAPD反应体系的 5 个主要影响因子进行系统的初选与复选 , 获
得了葡萄属植物的 RAPD最优反应体系及扩增程序.
关键词:葡萄属;基因组 DNA;RAPD;关键因子
中图分类号:S 663.1　　　文献标识码:A
RAPD(Randomly Amplified Polymorphic DNA)技术 ,即随机扩增多态性 DNA是近几年来应用
甚广的一种分子遗传标记技术.其研究内容主要包括连锁标记检测主基因 ,建立遗传图谱 ,基
因的染色体定位 ,系谱分析和分类等方面[ 1] ,尤其是 RAPD能灵敏地检出 DNA 多态性 ,可直接
用于变异检测 ,属 、种鉴定及系统分类.
葡萄属植物的起源历史悠久 ,分布广泛 ,属内种间易杂交 ,中间型 、过渡型相当普遍 ,这就
给分类工作造成较大困难.我国是葡萄属植物(Vitis L.)的原产地 ,拥有丰富的葡萄野生资源 ,
为了充分利用我国的野生葡萄种质资源 ,在分子水平上对其进行系统分类显得非常迫切 ,为
此 ,需对上百个品种 、株系提取基因组 DNA ,用于 PCR反应.由于 RAPD 稳定性不甚理想 ,因
此 ,提取 DNA的方法和质量 ,以及反应体系的优劣 ,直接影响着 RAPD扩增结果.笔者针对野
生葡萄的特性 ,如多糖含量高 ,材料绒毛 、腺毛 、皮刺较多的特点 ,对前人用过的适于葡萄基因
组DNA提取的CTAB法[ 2～ 6]进行改良 ,获得了高质量的 DNA ,并进一步对适合本属种的 RAPD
体系系统地进行了优选.
1　材料与方法
1.1　材料　华东葡萄(V.pseudoreticulata W.T.Wang):白河-35-1;艹婴艹奥葡萄(V.adstricta
Hance):泰山-1(♀);秋葡萄(V.romanetii Roman):江西-1(♀);复叶葡萄(V.piasekii Max-
im):南郑-2;刺葡萄(V.davidii(Roman)Foex):福建-4;毛葡萄(V.quinquangularis Rehd):83
-4-67;山葡萄(V.amurensis):华县-47.1998-06-08采自西北农业大学葡萄种质资源圃 ,
掐取梢尖 ,放入 4 ℃冰箱中 ,次日用保温箱带至海南热带作物生物技术国家重点实验室 ,立即
放入-70 ℃冰箱中冷冻备用.
DOI :10.15886/j.cnki.hdxbzkb.2000.04.012
试剂:Taq酶购自华美生物工程公司 ,随机引物为 Operon公司产品 , dNTPs为 Promega 公司
产品 ,其它为国产和进口产品 ,PCR仪为 PE公司 480型.
1.2　方法
1.2.1　基因组 DNA提取法　分别采用傅荣昭[ 7] 、王跃进[ 2] 、王军[ 3] , Cheng F S[ 5]的 CTAB法 ,
综合其优点 ,针对野葡萄材料的特点进行改良 ,方法如下.
将0.2 ～ 0.3 g 梢尖置于研钵中 ,加适量液氮研碎 ,转入 1.5 mL 离心管中 ,加入 500 μL
CTAB提取缓冲液(100 mmol·L-1 Tris pH 8.0 ,1.4 mol·L-1 NaCl , 20 mmol·L-1 EDTA ,ρ=2%的
CTAB ,20 mmol·L-1偏重亚硫酸钠 ,φ=3%的 β-巯基乙醇)充分混匀 ,同时加入100μL φ=20%
的PVP.亦可不用液氮而直接加 500 μL CTAB提取缓冲液 ,充分研磨后转入离心管中 ,加入 600
μL(等体积)氯仿-异戊醇(V氯仿∶V异戊醇=24:1)倒管混匀.65 ℃温浴 30 min , 12 000 r/min离心
10 min ,取上清液 ,加入 2/3体积异丙醇沉淀 DNA ,室温静置 15 min ,用枪头挑出丝状 DNA ,用 1
mL φ=70%、100%的酒精各洗涤 1次 ,短暂干燥.用500μL 高盐TE(10 mmol·L-1 Tris-HCl ,pH
8.0 , 1 mmol·L-1 EDTA ,1 mol·L-1 NaCl)溶解 ,加 RNase 至终浓度 20 mg·L-1 ,37 ℃保温 30 ～ 60
min ,加2V 无水乙醇 ,1/10V 3 mol·L-1NaAc(pH 5.2)沉淀 ,10 000 r/min 4 ℃离心 5min或挑出
沉淀干燥 ,用 50 μL 或 100μL TE(pH 8.0)溶解.在 BECKMAN DUR-70型紫外分光光度计上测
波长 260 nm 及 280 nm 处的光吸收值(OD值),计算 DNA 浓度 ,据 OD 260/OD 280比值判断
DNA样品的纯度 ,然后在 w=0.8%的琼脂糖凝胶(含 0.5mg·L-1溴化乙锭),1×TAE缓冲液条
件下电泳 ,以 λDNA/Hind Ⅲ为标准 ,检查 DNA的分子量大小及浓度.
1.2.2　RAPD反应体系优化　
1.2.2.1 　体系初选　对影响 RAPD反应体系的 5个主要因子的用量设计不同梯度(表 1),完
全随机组合 ,共 256个处理 ,从中筛选出最佳的组合.总反应体积为25 μL ,其中含有 10×反应
缓冲液 2.5μL(500mmol·L-1KCl;100 mmol·L-1 Tris-HCl ,pH 9.0 , 25 ℃;φ=1%的 Triton X-
100),Mg2+浓度用 25 mmol·L-1 MgCl2(Promega产品)调整 ,用 ddH2O定容到 25μL.初选反应用
艹婴艹奥(泰山-1♀)作模板 ,引物为OPB05 ,序列为5′TGCGCCCTTC 3′,重复试验3次.PCR产物用
含0.5 mg·L-1溴化乙锭的琼脂糖胶电泳分离 , 1×TAE电极缓冲液 , 150 V电压下电泳 40 min ,
紫外灯下观察照相.
表 1　RAPD反应体系初选处理(各因子完全随机组合)
模板/ng 引物/μL dNTPs/(μmol·L-1) Mg2+/(mmol·L-1) Taq 酶/ u
10 0.5 100 1.5 0.5150 2.0 1.0
20 1.0 200 2.5 1.5
250 3.0 2.0
1.2.2.2　体系复选　根据初选结果 ,从中筛出各因子的最佳用量 ,据此设计 4个较理想的反
应体系(表 2),对不同种的模板(表 3),用表 2的 4个反应体系分别扩增 ,所用引物为OPJ10 ,其
序列为5′AAGCCCGAGG 3′.
1.2.3　反应循环条件　预变性:94 ℃7min;94 ℃1 min , 36 ℃1 min , 72 ℃2min ,45个循环;
最后一个循环 72 ℃延伸 10 min.
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表 2　4个 RAPD复选体系
NO. 模板/ ng 引物/μL dNTPs/(μmol·L-1) Mg2+/(mmol·L-1) Taq 酶/u
1 10 0.5 150 1.5 1.0
2 10 1.0 150 1.5 1.0
3 20 0.5 200 2.0 1.5
4 20 1.0 200 2.0 1.5
表 3　不同种葡萄的基因组 DNA提取结果比较
　　种名 　株系名 OD260/OD280 DNA 浓度/(g·L-1)＊ 产率/(μg·g-1)＊＊
　华东葡萄 白河-35-1 1.705 2.890 724.0
　 艹婴艹奥葡萄 泰山-1(♀) 1.780 3.230 807.5
　秋葡萄 江西-1(♀) 1.752 1.438 359.5
　复叶葡萄 南郑-2 1.850 2.320 580.0
　刺葡萄 福建-4 1.918 2.300 575.0
　毛葡萄 83-4-67 1.818 2.112 528.0
　山葡萄 华县-47 1.910 2.400 600.0
　　　　注:＊浓度指每升水溶液中所含DNA的克数;＊＊产率指每克植物材料所提取出的 DNA 的微克数.
2　结果与分析
2.1　基因组 DNA的完整性和纯度　用上述改良CTAB法提取不同种葡萄的基因组DNA的完
整性较好 ,长度大于 23 kb(图 1),且产率较高 ,平均每克梢尖可达 596.3μg DNA ,OD260/OD280
比值介于 1.705 ～ 1.918之间 ,说明所获得的 DNA纯度较高.这与取用正处于细胞分裂生长旺
盛时期的梢尖作为提取材料有关 ,且这一结果明显高于王军 、Doyle J J等[ 3 ,4 , 8]用幼叶提取DNA
的产率 ,以此模板进行 RAPD扩增能产生丰富清晰和重复性较好的条带.
1.λDNA/Hind Ⅲ分子量标准;2.山葡萄;3.秋葡萄;4.复叶葡萄;
5.刺葡萄;6.艹婴艹奥葡萄;7.华东葡萄;8.毛葡萄
图 1　不同种葡萄基因组 DNA
2.2　RAPD体系初选结果　根据常规 RAPD所用各成分的浓度范围设计了 256个初选体系 ,
从这些处理的 PCR产物电泳图谱得出如下结果:模板 10 ～ 20 ng;dNTPs 150 ～ 200 μmol·L-1;
Mg
2+
1.5 ～ 2.0 mmol·L-1;Taq酶1 ～ 1.5 u;引物 0.5 ～ 1μL均能扩增出较好的条带.
10 ng 与 20 ng 的模板扩增效果差异不大 ,20 ng 的背景较亮 ,但不如 10 ng 的带清晰好辨.
Taq酶的用量为 0.5 u时 ,普遍扩增效果不佳 ,且不稳定 ,条带少 ,有的根本扩增不出来 ,如图 2
中第 3泳道.由此看来 ,要使 RAPD扩增成功 ,适量的 Taq 酶是必需的.1 ～ 2 u 均能扩增出产
385第 4期　　　　　　　　罗素兰等:葡萄属植物的基因组 DNA提取及 RAPD体系优化
物 ,但 2 u已出现条带弥散 ,1 u和 1.5 u扩增差异不大(图 2).Mg2+浓度在 1.5 ～ 3.5 mmol·L-1
之间对 RAPD扩增没有显著影响 ,故均可采用.dNTPs从 100 ～ 250μmol·L-1的扩增效果差异较
小 ,浓度太高产生错误掺入 ,浓度过低产率太低(图 3),因而采用 150 ～ 200μmol·L-1较宜.引物
用量在 0.5 ～ 1μL(Operon产品)对扩增效果影响不大.在初选处理中 , 0.5 μL 引物的条带更清
晰一些.
从左至右各泳道分别为:1.PCR Marker;2.CK;
3～ 4.0.5 u;5～ 6.1 u;7～ 8.1.5 u;9～ 10.2.0 u
图 2　不同 Taq酶用量的扩增结果
1.PCR Marker;2.CK;3～ 6分别为:
100 、150 、200 、250(μmol·L-1)
图 3　不同浓度 dNTPs 的扩增结果
1.PCR Marker;2.华东葡萄;3.秋葡萄;
4.复叶葡萄;5.剌葡萄;6.毛葡萄;7.山葡萄
图4　第 1种复选体系的扩增结果
2.3　复选结果　根据初选结果 ,采用最优单因子组成 4
个反应体系 ,用不同的模板(表 3 所列),同一引物 OPJ10
进行复选 ,图 4显示 ,第 1种扩增效果最好 ,最经济.本反
应体系(25μL反应体积)中只用 150μmol·L-1 dNTPs , 1 u
Taq酶 ,0.5 μL 引物 ,比其他通用的 200 μmol·L-1 dNTPs ,
2.0 mmol·L-1Mg2+ , 1.5 u酶 , 1μL引物[ 2 ～ 4]节约简便 ,且
扩增出的带型清晰 ,重复性好.
2.4　反应循环参数优化　据文献[ 2 ,9]所用热循环参数 ,
做适当调整 ,最后确定以下 2种循环模式.(1)预变性 94
℃7 min ,94 ℃1 min ,36 ℃1 min ,72 ℃2 min ,共 45个循
环 ,最后72 ℃延伸 10 min;(2)预变性95 ℃5 min ,94 ℃1
min ,35 ℃1 min ,72 ℃2 min , 共 40个循环 ,最后 72 ℃延
伸5 min.结果表明:第 1种循环模式扩增效果较好 ,第 2种扩增产率较低 ,带较暗 ,最后确定采
用第 1种循环模式.
3　讨　论
许多研究表明[ 3 ,9 ,10] :不同的取材部位及不同的 DNA提取方法所获得的模板 DNA对实验
效果有很大的影响.大多数研究者采用幼嫩的组织器官 ,尤其是幼叶.葡萄的幼叶 、卷毛 、梢尖
等部位均可作为供试材料[ 9] .由于野葡萄中 ,诸如毛葡萄的幼叶新梢及叶片多被白色绒毛 ,秋
葡萄则多被紫色腺毛 ,刺葡萄多有皮刺 ,且体积大 ,而梢尖体积小 ,且夏芽具早熟性 ,易萌发 ,所
以 ,本实验采集幼嫩梢尖装入保温箱 ,箱中放入足量冰 ,尽快到达目的地 ,立即放入-70 ℃冰
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箱中冰冻保存 ,材料质量保持良好 ,这与沈向[ 8]所述采样后直接送入冰箱易使样品发黑 ,并伴
有强烈苦杏仁味有异.
提取 DNA时只要充分研细 ,用液氮与不用液氮研磨 ,两者的提取效果基本是一致的 ,但加
液氮易研碎 ,尤其是手工研磨成百个样品时 ,提倡用液氮.
RAPD反应条件既具保守性 ,又有较大的灵活性 ,不同的 PCR仪型号及不同的植物材料 ,
要不同的循环程序及反应体系 ,且同一循环程序和体系往往在另一物种上不能获得较好的扩
增效果.笔者用 PE公司 480型 PCR仪 ,根据野葡萄资源的特性 ,建立了适合于葡萄属植物的
RAPD优化体系 ,并且节约试材 、试剂.
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Optimization of Grape Genomic DNA
Isolation and RAPD System
LUO Su-lan1 , ZHOU Peng2 ,HE Pu-chao3 , ZHENG Xue-qin2
(1.Agricultural College of Hainan University , Haikou 570228 , China;
2.National Key Biotechnology Laboratory for Tropical Crops , Haikou 571101 , China;
3.Department of Hort iculture , Northwestern Agricultural University , Yangling 712100 ,China)
Abstract:An improved DNA extraction protocol with CTAB was developed for Vitis species.DNA was
extracted successfully from the samples of 7 species and was suitable for RAPD analysis.Five important
factors affecting RAPD were designed for screening and re-screening the best RAPD reaction system.An
economic and effective RAPD system was obtained which adapted to grape RAPD analysis in order to be
used for large-scale classification research of grape.
Key words:Vitis;genomic DNA;RAPD;key factors
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