全 文 ：第 12 期
苦丁茶是我国民间广泛用于制备代茶饮品
（或茶药两用）的一大类代茶植物的统称。 其原植物
来源广泛，涉及 12 科 13 属，至少有 36 种之多（含
变种和变型）［1－3］。 冬青属苦丁茶是我国两大类最重
要的苦丁茶之一。 该类苦丁茶主要包括苦丁茶冬
青 （Ilex kudingcha C.J.Tseng），大叶冬青（I. latifolia
Thunb），枸骨 （I. cornuta Lindl），霍山冬青 （I. hu-
oshanesis Y.H.He，五棱苦丁茶（I. pentagona S.K.chen
Y.X.Feng et C．F.Liang），华中枸骨（I. centrochinensis
S.Y.Hu）等 6个物种。这些苦丁茶物种主要分布于我
国广东、广西、海南、浙江、安徽和贵州等省区［4－6］。根
据种植面积、 经济价值以及在国内外的影响情况，
苦丁茶冬青被众多专家认定为“大叶苦丁茶”正品。
冬青属苦丁茶中化学成分种类繁多，其中的绿原酸
作为一种多酚活性成分，已广泛应用于食品、医药
和日用化工等领域。 目前，有关冬青属植物的绿原
酸含量分析报道较少［7－9］。 本试验采用 HPLC法比较
了不同品种、不同产地、不同来源、不同发育时期和
收稿日期：2014-02-28
基金项目：国家自然科学基金项目（39860048，30060040）
作者简介：田建平（1972－），男，湖南澧县人，副教授，在读博士研究生，研究方向为植物系统学和中药资源学，（电话）13518071297，（电子信箱）
jptian666＠163．com；通讯作者：刘国民，教授，主要从事苦丁茶种质资源研究，（电话）13005082258（电子信箱）13005082258＠163．com。
六种冬青属苦丁茶叶片中绿原酸含量的
RP－HPLC分析
田建平 1a，1b，2，李娟玲 1c，胡远艳 1d，刘国民 1a，1b
（1．海南大学 a.苦丁茶研究所，b.农学院，c.园林园艺学院，d.热带生物资源教育部重点实验室，海口 570228；
2.海南医学院药学院，海口 571101）
摘要：采用超声提取和 RP－HPLC 法分析了 6 种冬青属苦丁茶新干燥的功能叶及苦丁茶冬青植物在不同
发育阶段、不同地域、野生与栽培材料、不同存放时间下功能叶中的绿原酸含量。 结果表明，不同样品材
料中的绿原酸含量由大到小排序依次为苦丁茶冬青、霍山冬青、大叶冬青、五棱苦丁茶、华中枸骨、枸骨；
新干燥的成熟叶样品在室温下存放 2 个月后绿原酸的含量显著下降； 在野生的苦丁茶冬青叶片不同发
育阶段中，一般是以老叶样品中的绿原酸含量高；野生苦丁茶冬青植株叶片中绿原酸的含量要高于栽培
植株叶片中绿原酸的含量。 6 种冬青属苦丁茶叶片样品中的绿原酸含量存在较大的种间差异。
关键词：冬青属苦丁茶；绿原酸；反相高效液相色谱；资源利用
中图分类号：TS275．2 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2014）12－2889-03
Comparison of Chlorogenic Acid in Leaves from Six Ilex Species Used as
Kudingcha by RP－HPLC
TIAN Jian－ping1a，1b，2，LI Juan－ling1c，HU Yuan－yan1d，LIU Guo－min1a，1b
（1.a.Kudingcha Research Institute，b.College of Agriculture，c.Horticulture and Landscape College，d.Key Laboratory for Tropical Biological
Resources，Hainan University，Haikou 570228，China；2.Department of Pharmacy，Hainan Medical College，Haikou 571101，China）
Abstract：Chlorogenic acid in the mature leaf was extracted ultrasonically and analyzed by RP－HPLC from six Ilex species
and I.kudingcha in different developing stage，region and storaging time，wild and cultivated samples. The results showed that
the content of chlorogenic acid in fresh mature leaves of six species was I． kudingcha ＞ I． huoshanesis ＞ I． latifolia ＞ I.
centrochinensis ＞ I. pentagona ＞ I． cornuta. The significant decrease of chlorogenic acid in dried fresh leaf was observed after
two months. In general，its content in old leaf was highest among different developing stage，and the content of wild leaf was
higher than cultivation one. There were large differences among six Ilex species in the contents of chlorogenic acid.
Key words： Kudingcha species in Ilex L．； chlorogenic acid； RP－HPLC； resource utilization
第 53卷第 12期
2014年 6 月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 53 No.12
Jun．，2014
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.12.010
湖 北 农 业 科 学 2014 年
贮藏条件下苦丁茶叶片样品中的绿原酸含量，为冬
青属苦丁茶植物种质资源的合理开发利用及产品
质量控制提供参考。
1 材料与方法
1．1 材料与试剂
冬青属苦丁茶叶片样品收集于全国各地，样品
经海南大学黄世满教授鉴定，分别为冬青科植物苦
丁茶冬青、大叶冬青、五棱苦丁茶、枸骨、霍山冬青
和华中枸骨，其中苦丁茶冬青包含野生与栽培 2 类
样品，其余 5 种均为栽培样品。 凭证标本保存于海
南大学苦丁茶研究所标本室，相关信息见表 1。
绿原酸标准品（110753－200413，98％），购于中
国食品药品检定研究院。
提取用甲醇和磷酸为分析纯（广州化学试剂公
司）， 色谱分析用甲醇和乙腈为色谱纯 （Sigma，美
国），去离子水。
1．2 主要仪器
2695－2487型高效液相色谱仪（Waters，美国）
1．3 方法
1．3．1 材料采集 分别采集不同产地苦丁茶冬青
野生和栽培材料叶片各 8 批， 每批野生材料分为 3
类（幼嫩叶、功能叶和老叶）；栽培材料只采集功能
叶。 新鲜叶片材料于 50 ℃干燥后室温放置；2 月后
再分别采集 6 种冬青属植物栽培材料的新鲜功能
叶，其中苦丁茶冬青来源于样品 9。随即将上述不同
时段采集的样品同时分析。
1．3．2 样品前处理 取样品于 50 ℃烘干，粉碎后过
24目筛备用。 称取 1．000 g左右样品，置具塞三角瓶
中，加入 50％（V ／ V，下同）甲醇 20 mL，称定重量。 超
声提取（40 kHz，180 W）30 min，放冷，用 50％甲醇补
足减失的重量，摇匀，过滤，50％甲醇洗涤 2～3 次，取
续滤液置于 25 mL 棕色量瓶中， 加 50％甲醇至刻
度，摇匀。精密吸取 600μL于 4mL离心管，于 0．22μm
微孔滤膜过滤后，待测。
1．3．3 标准品的配制 称取绿原酸标准品 10．4 mg
于 10 mL 棕色量瓶内，用甲醇（色谱纯）溶解并稀释
至刻度，摇匀，得 1．04 mg ／ mL 标准品贮备液，10 ℃
保存，待用。
1．3．4 色谱分析 在预试验基础上，参照文献［10］
色谱条件： 采用 XBridge C18色谱柱 （5 μm，4．6 mm×
150 mm）为固定相，以乙腈－0．06％磷酸（V ／ V＝1 ／ 9）
为流动相；流速 1．0 mL ／min，检测波长 327 nm，柱温
30℃。
1．3．5 方法学分析 根据回归分析得到绿原酸浓
度标准曲线，RP－HPLC方法系统适用性、 精度及重
复性试验参照文献［10］。
2 结果与分析
2．1 方法学分析
绿原酸标准品和样品色谱图分别见图 1 和图
2。 在上述色谱条件下，理论塔板数按绿原酸计算不
低于 1 000，样品中的绿原酸不受杂质干扰。
表 1 供试冬青科苦丁茶样品材料信息
物种名称
I. kudingcha
I. kudingcha
I. kudingcha
I. kudingcha
I. kudingcha
I. kudingcha
I. kudingcha
I. kudingcha
I. kudingcha
I kudingcha
I. kudingcha
I. kudingcha
I. kudingcha
I. kudingcha
I. kudingcha
I. kudingcha
I. latifolia
I. pentagona
I. houshanensis
I. cornuta
I. centrochinensis
产地来源
海南白沙
海南保亭
广西马山
广东大埔
海南三亚
广东英德
海南白沙
海南白沙
海南万宁
海南五指山
湖南通道
海南定安
云南江城
云南江城
广西武鸣
海南保亭
浙江淳安
广西马山
安徽霍山
湖南祁东
湖南衡山
类别
野生
野生
野生
野生
野生
野生
野生
野生
栽培
栽培
栽培
栽培
栽培
栽培
栽培
栽培
栽培
栽培
栽培
栽培
栽培
编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
图 1 绿原酸标准样品的色谱图
0.50
0.40
0.30
0.20
0.10
0.00
吸
光
度
//a
.u
.
1.00 3.00 5.00 7.00 9.00 11.00 13.00 15.00
保留时间//min
图 2 苦丁茶冬青新鲜功能叶所含绿原酸典型 HPLC 图谱
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
吸
光
度
//a
.u
.
1.00 3.00 5.00 7.00 9.00 11.00
保留时间//min
2890
第 12 期
对不同浓度标准品进行测定，计算绿原酸的标
准曲线为 Y＝4×107X－125 553（r＝0．996 9），吸取适量
标准品溶液， 连续进样 5 次， 测得峰面积 RSD 为
0．36％（n＝5），表明仪器精密度良好。 稳定性试验中，
各峰面积 RSD＝0．8％（n＝5），表明样品溶液在 8 h 内
稳定，重复性结果表明峰面积 RSD＝1．13％（n＝5），即
方法重复性较好。
2．2 功能叶中绿原酸含量的比较
绿原酸含量测定时各材料测量均重复 5 次，冬
青属苦丁茶栽培样品新鲜功能叶中绿原酸含量见
图 3。由图 3可知，苦丁茶冬青所含绿原酸的质量百
分含量（以下简称含量）最高（0．58％），霍山冬青、大
叶冬青、五棱苦丁茶及华中枸骨所含绿原酸含量次
之，枸骨叶中的绿原酸含量最低。
2．3 不同发育阶段叶片中绿原酸含量的比较
经低温干燥处理，室温密封保存 2 月后，各产
地的苦丁茶冬青野生样品在不同发育时期叶片（老
叶、功能叶、幼叶）中的绿原酸含量见图 4，除样品 7
和 8 外， 都是老叶中的绿原酸含量大于功能叶，绿
原酸含量最高者为样品 2，含量达 0．26％。
2．4 不同产地野生与栽培材料功能叶中绿原酸含
量的比较
经干燥处理，室温放置 2 个月后，各产地的苦
丁茶冬青野生与栽培材料功能叶中的绿原酸含量
见图 5。 由图 5可知，整体上野生材料中的绿原酸含
量要高于栽培材料，但在栽培样品中，14号样品的绿
原酸含量最高（0．12％），样品 15含量最低（0．05％）；在
野生样品中，5号样品含量最高（0．08％）。
另外，由图 3 与图 5 的比较可知，苦丁茶冬青
新鲜功能叶所含绿原酸含量是低温处理放置 2 个
月样品含量的 9倍。
3 讨论
苦丁茶冬青是应用最广泛的冬青属苦丁茶。 就
绿原酸含量而言， 以苦丁茶冬青的绿原酸含量最
高，霍山冬青次之。比较已报道的冬青属苦丁茶中的
齐墩果酸和熊果酸含量， 霍山冬青也位列第二 ［11］，
因此霍山冬青是一种值得开发的冬青属苦丁茶种
质资源。 另外，上述结果表明野生样品中绿原酸含
量整体上要高于栽培样品。 这种现象可能与其产地
或遗传因素有关，为选育苦丁茶良种提供了参考。
绿原酸是多酚类化合物， 分子中含有酯键、不
饱和双键及多酚 3 个不稳定结构，因此其储藏条件
将直接影响绿原酸在叶中的含量。 通过比较新鲜叶
片和室温密闭放置 2 个月后叶片中的绿原酸含量，
发现后者所含的绿原酸含量急剧下降。 因此传统苦
丁茶工艺中的“杀青”措施，对于抑制鲜叶中多酚化
合物的酶促氧化反应十分必要。 另外老叶所含的绿
原酸含量较高，可能与其感染了菌类，呼吸作用强
烈从而促进绿原酸的合成相关。
综上所述，冬青属苦丁茶不同样品中的绿原酸
含量差异较大，这可能与物种，基因型或者种质材
料的所在地域相关；苦丁茶冬青作为冬青属苦丁茶
的主流种类，是人工栽培面积最大和产量最高的冬
青属苦丁茶种类，可考虑从其种质资源库中筛选出
一些富含绿原酸且综合性状良好的种质资源材料，
通过组培或扦插等无性繁殖手段加速繁殖，尽快培
育出富含绿原酸且高产优质的新品系或新品种，并
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
绿
原
酸
含
量
//%
1 2 3 4 5 6 7 8
样品编号
功能叶
幼叶
老叶
图 4 各产地苦丁茶冬青野生样品的老叶、幼叶和
功能叶绿原酸含量（n＝5）
图 3 6 种冬青属苦丁茶功能叶的绿原酸含量（n＝5）
0.70
0.60
0.50
0.40
0.30
0.20
0.10
0.00
苦丁茶 大叶冬青 五棱 霍山冬青 枸骨 华中枸骨
苦丁茶
绿
原
酸
含
量
//%
图 5 各产地野生与栽培样品的苦丁茶
冬青功能叶的绿原酸含量（n＝5）
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
绿
原
酸
含
量
//%
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
样品编号
（下转第 2897页）
田建平等：六种冬青属苦丁茶叶片中绿原酸含量的 RP－HPLC 分析 2891
第 12 期
2．4 方法评价
吸取标准品 10 μL，重复进样 6 次，求得峰面积
RSD为 1．39％，表明仪器精密度良好。
吸取标准品 10 μL，进样，分别于 0～6 h，每间隔
0．5 h重复上述操作，求得峰面积 RSD 为 1．9％，结果
表明标准品溶液在 6 h内基本稳定。
吸取已知浓度的供试品溶液 500 μL， 加入
0．80 mg ／ mL 的熊果酸标准品溶液 500 μL，混匀，进
样 10 μL，平行测定 3 次，求得熊果酸平均回收率为
98．08％。
称取已知浓度的同一样品 6 份，依次分别制得
样品溶液，精密吸取样品溶液 10 μL，进样，求得峰
面积 RSD为 1．9％。
3 结论
锁阳中熊果酸在 4．0～16．0 μg ／μL 范围内线性
关系良好 （r＝0．999 8）， 其回归方程为 y＝622．7x－
85．517，r＝0．999 8。 精密度 RSD 为 1．39％，加样回收
率平均为 98．08％，RSD为 1．9％。熊果酸提取的最佳
工艺条件是：乙醇体积分数为 85％、料液比 1∶25、超
声时间 30 min、超声功率 150 W，锁阳中熊果酸的含
量约为 1．53％。 该方法提取锁阳中的熊果酸含量较
高，可为开发利用相关药材提供参考。
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（责任编辑 周有祥）
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（上接第 2891页）
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（责任编辑 周有祥）
危 晴等：锁阳中熊果酸的超声提取及高效液相色谱法测定 2897