全 文 ：基因组学与应用生物学，2009年，第 28卷，第 1期，第 109-114页
Genomics and Applied Biology, 2009, Vol.28, No.1, 109-114
实验技术
Experimental Technology
落羽杉属树木基因组总 DNA的提取及 SRAP反应体系的优化
於朝广 * 殷云龙
江苏省中国科学院植物研究所(南京中山植物园),南京, 210014
*通讯作者, yucg168@sina.com
摘 要 本文针对落羽杉属植物组织中多糖、多酚等次生物质含量高的特点，对其基因组 DNA提取方法进
行研究，比较了 SDS法、CTAB法提取落羽杉属植物基因组 DNA的效果，结果表明：CTAB法提取效果较
佳。在此基础上，利用正交设计法，对 SRAP反应体系中的各个主要影响因子Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚
合酶进行了优化筛选，确立了适合落羽杉属植物 SRAP-PCR反应的最佳体系，即 10 μL体系中含有 1 μL
10×PCR buffer，Mg2+ 2.0 mmol/L，dNTP 100 μmol/L，引物 0.3 μmol/L，Taq DNA聚合酶 0.5 U和 50 ng模板
DNA。利用该优化体系，通过 48对 SRAP引物组合对 2个落羽杉属植物(落羽杉和墨杉)及 4个杂交后代进
行 SRAP扩增，结果发现，SRAP引物及优化后的反应体系能够有效地用于落羽杉属植物种质资源鉴定及遗
传多样性分析等研究。
关键词 落羽杉属, DNA提取, SRAP-PCR,体系优化
Extraction of Genomic DNA and Optimization of SRAP Reaction System in
Taxodium Plants
Yu Chaoguang * Yin Yunlong
Institute of Botany, Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences, Nanjing, 210014
* Corresponding author, yucg168@sina.com
Abstract Study on the extraction of high quality DNA from Taxodium was carried out in allusion to high levels
of polysaccharides and poly phenols combined with nucleic acid. We compared the methods of SDS and CTAB
extracting DNA from Taxodium, the results showed that CTAB extraction method is more effective. Then the con-
centration of Mg2+, dNTP, primer and Taq DNA polymerase in the SRAP-PCR system was optimized for genomic
DNA in Taxodium, the optimal concentration was 10×PCR buffer，Mg2+ 2.0 mmol/L, dNTP 100 μmol/L, Primer
0.3 μmol/L, Taq DNA polymerase 0.5 U, template DNA 50 ng with a total volume of 10 μL reaction solution. The
molecular identification of two Taxodium plants and 4 hybrids was conducted by 48 SRAP primers with the optimal
SRAP marker system. It showed that the SRAP primers and its optimized system can be applied in the germplasm
identification and genetic diversity analysis of Taxodium plants effectively．
Keywords Taxodium, DNA extraction, SRAP-PCR, System optimization
基金项目：本研究由江苏省高技术(农业)研究项目(BG2007318),国家林业局植物新品种保护办公室植物新品种测试指南及已
知品种数据库项目(2007010)和江苏省林业三项工程项目(lysx200702)资助
落羽杉属(Taxodium Rich.)树木为杉科(Taxodi-
aceae)落叶或半常绿乔木，该属有 3个树种，分别是
落羽杉(T. distichum(Linn.) Rich.)、池杉(T.ascendens
Brongn.)和墨西哥落羽杉(简称墨杉) (T. mucronatum
Tenore)。原产北美洲和墨西哥，具生长快、干型直、材
质好、耐水湿、树形美和适应性广等优点，是林业和
园林建设中很有发展前景的树种，在美国被称为“永
不腐朽之木”(陈永辉等, 1987,江苏科学技术出版社,
pp.92-97)。
我国对落羽杉属植物的育种工作也非常重视，
早在 1963年，林木育种先驱叶培忠教授就开展了落
羽杉属植物的杂交育种工作，并获得优良杂交后代
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“东方杉”(张建军等, 2003)。随后江苏省中国科学院
植物研究所从 1973年开始开展落羽杉属种间杂交
优势利用研究，育成了耐盐碱、生长快、观赏价值高
的“中山杉 302”[(T. distichum (♀ )×T. mucronatum
(♂)]和“中山杉 118”[(T. distichum (♀)×T. mucrona－
tum (♂)×T. mucronatum (♂)]等一批国家级审定良种
无性系(於朝广和殷云龙, 2008)，已在江苏、浙江、上
海、山东等沿海省(市)进行了大面积的推广。
用分子标记技术进行落羽杉属植物重要性状的
早期选择是落羽杉属植物育种的关键技术之一。但
是目前应用于落羽杉属植物研究的分子标记很少，
其中应用最多的是 RAPD标记，主要用于落羽杉属
植物亲缘关系鉴定(李涵等, 2007;陈云鹏等, 2002)、
指纹图谱的构建(周玉珍等, 2006)等。在研究中发现，
由于落羽杉属植物组织中含有大量的多糖和多酚等
次生代谢物质，因此 DNA提取难度较大，另外，在
RAPD标记的应用中发现，由于 RAPD标记为显性
标记，无法区分纯合型和杂合型基因，部分遗传信息
难以表达，并且 RAPD标记在落羽杉属植物的研究
中检出效率较低，李涵等(2007)从 100个 10 bp的随
机引物中仅仅筛选出 13个扩增效果较好的引物。因
此研究选择先进有效的分子测定方法仍是落羽杉属
树种研究过程中需要解决的问题。
序列相关扩增多态性标记(sequence-related am-
plified polymorphism, SRAP)是由 Li和 Quiros (2001)
开发的一种基于 PCR扩增的新型分子标记技术。该
标记针对基因外显子中 GC含量丰富而启动子、内
含子中 AT 含量丰富的特点来设计引物进行 PCR
扩增，因不同个体的内含子、启动子与间隔区长度不
等而产生多态性。该技术具有操作简便、快速，多态性
丰富，重复性好，不需预知物种序列信息以及成本较
低等诸多优点，目前，SRAP标记在植物遗传图谱构建
(林忠旭等, 2003;张丽等, 2007)、基因克隆(刘雅辉等,
2007)、遗传多样性分析及品种鉴定 (Ferriol et al.,
2003;李丽等, 2006;陈伦林等，2008)、基因连锁标记
的寻找与基因定位(陈碧云等, 2006)、比较基因组学及
杂种优势预测(海燕等, 2006,河南农业科学, (9): 9-12)
等方面已得到了较为广泛的应用。
本文通过 SDS法和 CTAB 法两种方法提取落
羽杉属植物的 DNA，对提取效果进行比较，并将所
提 DNA用于 SRAP扩增，在此基础上，通过正交设
计法对落羽杉属植物的 SRAP-PCR反应体系中各成
分进行优化，以期获得最佳的落羽杉属植物
SRAP-PCR反应体系，并通过 SRAP技术及其优化
体系对墨杉和落羽杉以及它们的 4个杂交后代(正反
交)进行扩增，以对优化体系进行验证。为 SRAP标记
及其优化体系在落羽杉属植物的进一步研究中提供
技术支持。
1材料与方法
1.1材料
试验材料为落羽杉、墨杉及墨杉(♀)×落羽杉(♂)
的 3个杂交后代 T405、T406、T407和落羽杉(♀)×墨
杉(♂)的 1个杂交后代“中山杉 302”。均取自江苏省
中国科学院植物研究所试验苗圃，材料及编号见表 1。
1.2基因组 DNA提取
十二烷基硫酸钠法(sodium dodecyl sulfate, SDS)：
取 5 g左右参试材料幼叶，用液氮研磨成粉状，转
入 15 mL的离心管中(以 1/2 管为宜)，根据样品量
加入适当的 DNA提取液[1 L提取液配方: 1 mol/L
Tris-HCl (pH 8.0), 100 mL; 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0),
100 mL; 5 mol/L NaCl, 100 mL; 20% SDS, 62.5 mL;
Na Bisulfate 3.8 g]，搅匀，成粘稠状，65℃水浴 1 h；
冷却至室温后，加入与上清液等体积的氯仿: 异戊
醇(24:1)，混匀后在摇床上摇动 1 h；3 200 r/min 离
心 30 min；取上清液(用去尖的枪头吸出)加入 2 倍
体积预冷的无水乙醇使 DNA沉淀，-20℃放置 1 h；
挑出 DNA到 1.5 mL的 Eppendorf管，加入适量的
70%乙醇洗涤 2次；将 DNA干燥，然后再加入等体
积的氯仿:异戊醇(24:1)，混匀后重复前面的步聚，对
DNA进行纯化，最后将所提取的 DNA在-20℃冰
材料名称
Names of materials
T407
T. mucronatum×T.distichum
T406
T. mucronatum×T.distichum
T405
T. mucronatum×T.distichum
中山杉 302
T.distichum×T. mucronatum
墨杉
T. mucronatum
落羽杉
T.distichum
编号
Serial No.
1
2
3
4
5
6
表 1参试材料名称及编号
Table 1 Names and No. of experimental materials
110
箱保存备用。
十六烷基三甲基溴化胺(cetyltrimethylammonium
bromide, CTAB)法：取 5 g左右参试材料幼叶，用液氮
研磨成粉状，转入 15 mL的离心管中(以 1/2管为宜)，
根据样品量加入适当的 DNA提取液[1 L提取液配方:
CTAB, 20 g; NaCl, 81.816 g; PVP, 20 g; 1 mol/L Tris-
HCl (pH 8.0), 100 mL; 0.5 mol/L EDTA-Na2 (pH 8.0),
40 mL; β-巯基乙醇, 20 mL]，搅匀，成粘稠状，65℃
水浴 1 h；冷却至室温后，加入与上清液等体积的氯仿:
异戊醇(24:1)，混匀后在摇床上摇动 1 h；3 200 r/min离
心 30 min；取上清液(用去尖的枪头吸出)再加入等体
积的氯仿:异戊醇(24:1)重复前面的步骤，进行 2次抽
提；取上清液(用去尖的枪头吸出)加入 2倍体积预冷
的无水乙醇使 DNA沉淀，-20℃放置 1 h；挑出 DNA
到 1.5 mL的 Eppendorf管，加入适量的 70%乙醇洗涤
2次；将 DNA干燥，加入 100 μL TE在室温下溶解，
最后将所提取的 DNA在-20℃冰箱保存备用。
1.3 DNA质量检测
采用琼脂糖凝胶电泳检测。取 2 μL DNA、2 μL
ddH2O与 2 μL 0.25%的溴酚兰，将其混合后，上样于
0.8%琼脂糖凝胶(含有溴化乙锭(EB)染色剂)，同时取
50 ng/μL的 λDNA作梯度(上样量分别为 1 μL, 2 μL,
3 μL, 4 μL, 5 μL, 6 μL)，在 1×TAE的电泳缓冲液
中进行水平板电泳(电泳仪为 DY-A型电泳仪，电泳
槽为 H2-中号水平电泳槽)，电泳电压为 60 V，时间
60 min左右，电泳结束后，在上海复日 FR-200A全
自动紫外与可见光凝胶图像分析仪观测分析，确定
DNA浓度并拍照。
1.4 SRAP-PCR反应体系优化
在 10 μL的 PCR反应体系中，除含有 1 μL 10×
PCR buffer和 50 ng模板 DNA外，采用 L9(34)正交试
验设计，对 Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶进行
4因素 3水平筛选，试验方案如表 2，以获得最佳反
应体系。SRAP引物由上海博亚生物技术有限公司合
成，体系优化选用引物 Me3+Em1 (正向引物序列:
5-TGAGTCCAAACCGGACC-3; 反向引物序列 :
5-GACTGCGTACGAATTCAA-3 )。dNTP和 Taq酶
购自南京申能博彩公司。DNA marker 购自南京
TaKaRa公司。依照扩增条带的灵敏性、条带的强弱
及杂带多少判断体系的优劣。
1.5 SRAP-PCR扩增程序及扩增产物的检测
SRAP-PCR 扩增程序为：94℃预变性 4 min；94
℃变性 1 min，37℃退火 1 min，72℃延伸 10 s，5个循
环；94℃变性 1 min，50℃退火 1 min，72℃延伸 10 s，35
个循环；循环结束后 72℃延伸 7 min，4℃保存。扩增
反应在英国 TECHNE 公司的 TC-412 型 PCR 仪上
进行。
扩增产物的检测：扩增结束后，在扩增产物中加
入 2 μL 6×loading buffer混匀，上样于 10%的聚丙烯
酰胺凝胶进行分离(电泳仪为 DYY-8B型,电泳槽为
JY-SCZ6型,北京六一)，电泳结束后快速银染检测。
2结果与分析
2.1两种方法提取 DNA质量检测及其比较
SDS法提取 DNA：采用 SDS法提取 DNA，加
入提取液，65℃水浴时，叶片发黄，上清糖分含量
高，成粘稠状；酒精沉淀后会有大块的呈褐红色的
DNA沉淀产生，纯化以后，DNA仍呈褐红色，且量
较大，加入 TE 后又特别难溶解；将溶解了的 DNA
用 0.8%的琼脂糖胶检测其浓度，结果 DNA浓度特
低，甚至检测不到，这说明褐色的大块沉淀含有大
量杂质(糖及酚类)。
CTAB法提取 DNA：采用 CTAB法提取 DNA，
加入提取液，65℃水浴时，叶片为绿色，上清稍粘；酒
精沉淀后会有白色块状 DNA悬浮在溶液上方，加入
TE后较易溶解，将溶解了的 DNA用 0.8%的琼脂糖
胶检测 DNA浓度，检测结果表明，用 CTAB法提取
的 DNA质量好、浓度高，参试的 6份材料均一次性
提取成功(图 1)，本实验最终将各样品的 DNA浓度
统一稀释到 50 ng/μL，作为模板 DNA的浓度。
编号
Serial No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Mg2+
(mmol/L)
1.0
1.0
1.0
1.5
1.5
1.5
2.0
2.0
2.0
表 2 SRAP-PCR 10 μL反应体系正交设计
Table 2 Orthogonal design for 10 μL SRAP-PCR system
dNTP
(μmol/L)
100
150
200
100
150
200
100
150
200
Primer
(μmol/L)
0.20
0.25
0.30
0.25
0.30
0.20
0.30
0.20
0.25
Taq DNA
polymerase (U)
0.25
0.50
1.00
1.00
0.25
0.50
0.50
1.00
0.25
因素
Factors
落羽杉属树木基因组总 DNA的提取及 SRAP反应体系的优化
Extraction of Genomic DNA and Optimization of SRAP Reaction System in Taxodium Plants 111
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2.2 落羽杉属植物基因组 DNA 的 SRAP-PCR 反应
体系建立
根据正交试验设计的 9个反应体系，利用试验材
料墨杉和引物 Me3+Em1进行体系优化，SRAP-PCR
扩增结果见图 2，依照条带强弱及杂带多少，尤其是
箭头所指的几条带，很明显地看出体系 7优于其他
体系。即 10 μL体系中含有Mg2+ 2.0 mmol/L，dNTP
100μmol/L，引物 0.3μmol/L，TaqDNA聚合酶 0.5 U。
2.3 SRAP-PCR反应体系应用
利用优化后的 10 μL SRAP-PCR反应体系：1 μL
10×PCR buffer、Mg2+ 2.0 mmol/L，dNTP 100 μmol/L，
引物 0.3 μmol/L，Taq DNA聚合酶 0.5 U和 50 ng模
板 DNA，通过 48对 SRAP引物组合对落羽杉属植物
2个种(落羽杉和墨杉)及其正反交的 4个后代(T405,
T406, T407和“中山杉 302”)进行 SRAP扩增，结果
发现，48个引物组合均扩增出了清晰的谱带，条带
数量适宜且主带清晰，同时反应体系具有较好的稳
定性和可重复性。表明利用优化后的反应体系能够
有效地对不同品种基因组进行 SRAP扩增，该反应
体系实用性强，可用于遗传多样性分析、种质资源
鉴定等研究。
图 3 为引物组合 Me11+Em10 和 Me10+Em10
在 6个落羽杉属植物材料中的扩增结果[(引物序列:
Me9 (5-TGAGTCCAAACCGGAAC-3); Me11 (5-T
GAGTCCAAACCGGAAG-3); Em10 (5-GACTGCG
TACGAATTCAT-3)]。从图 3中也可以看出，引物
Me9+Em10的扩增结果中，1~4号 4个杂交后代均具
有两亲本(5号和 6号)的特异性条带(箭头所指)；在
引物 Me11+Em10 的扩增结果中，1~4 号 4 个杂交
后代均具有 5 号亲本(墨杉)的特异性条带(箭头所
指)，3号和 4号后代均具有 6号亲本(落羽杉)的特
异带(箭头所指)，从这些特异性条带可以证明这 4个
后代均为真杂种。
图 1参试材料 DNA原液及稀释为 50 ng/μL的电泳检测图
注: A:原液;前 6个样品为DNA,从左到右分别为 50 ng, 100 ng,
150 ng, 200 ng, 250 ng, 300 ng; B:稀释 50 ng/μL
Figure 1 Electrophoresis of genomic DNA and its 50 ng/μL dilu-
tion for 6 tested samples
Note: A: Stock solution; Left former 6 samples were DNA, from
left to right were 50 ng, 100 ng, 150 ng, 200 ng, 250 ng, 300 ng;
B: 50 ng/μL dilution
图 2正交设计 SRAP-PCR反应体系扩增结果
注: M: Marker; 1~9:处理编号同表 2;箭头所指为体系 7较其
它体系扩增清晰的条带
Figure 2 The amplified results of treatments in orthogonal experi-
mental design
Note: M: Marker; 1~9: Treatment No. as showed in table 2; The
arrowhead indicated the more clear bands in reaction system 7
than in other systems
图 3引物Me9+Em10和Me11+Em10对 6份落羽杉属植物的
扩增结果
注: M: Marker; 1~6:编号同表 1;箭头所指为双亲特异带; A:
Me9+Em10; B: Me11+Em10
Figure 3 The amplified results by SRAP primer combinations
Me9+Em10 and Me11+Em10 in six Taxodium accessions
Note: M: Marker; 1~6: No. as showed in table 1; The arrowhead
indicated the polymorphic bands in two parents; A: Me9+Em10;
B: Me11+Em10
112
3结论与讨论
20世纪 80年代以来，分子生物学技术的快速发
展为生物界的遗传学研究提供了更直接、更精确的
方法，通过分子标记技术直接检测 DNA本身的序列
变化。DNA分子标记方法成为目前为止最有效的遗
传分析方法，克服了形态标记与等位酶标记受环境
影响的不足，以及等位酶遗传标记数量有限的不足。
目前，分子标记技术在许多植物的研究中都得到了
广泛的应用，而在落羽杉属植物中的应用非常少。
如前所述，在落羽杉属植物的研究中应用最多
的分子标记为 RAPD标记，但 RAPD标记因为所使
用的引物较短，专一性差，极易从模板链上脱落，且
具有较差的重复性。而 SRAP标记既具有 RAPD的
简捷性，又具备了 AFLP的较丰富的多态性及较高
的稳定性和可重复性。与其它标记相比，因 SRAP标
记是一种基于 PCR的新型分子标记技术，不需要像
RFLP标记那样要求高纯度和高浓度的 DNA和使用
放射性同位素，减少了对试剂质量、仪器设备的要
求，同时也减少了对实验操作人员的身体等方面的
损害；另一方面，SRAP标记是 17 bp的正向引物和
18 bp的反向引物随机组合成引物组合，与 RAPD、
SSR标记相比在引物设计、开发及合成方面既节省
了人力、物力，又节省了财力；也不需像 AFLP那样
需要预扩增和连接，减少了对人力、物力的需求和依
赖。由于具有这些优点，SRAP标记从开发以来已经
在很多植物上开展了一系列的相关研究，对于这种
具有诸多优点的分子标记若能在落羽杉属植物研究
中得到广泛的应用，将大大促进落羽杉属植物分子
及生物学的研究。
DNA的质量直接影响到 DNA分子标记的分析
结果。落羽杉属植物是一种富含多酚、多糖的植物，
针对这一特性，人们在提取落羽杉属植物的 DNA时
采取了相应的措施(陈云鹏等, 2002;周玉珍等, 2006;
李涵等, 2007)，因此，使得提取步骤复杂化，最常用且
步骤最简化的 SDS法和 CTAB 法可否提取出高质
量的满足分子标记分析的落羽杉属植物的 DNA，到
目前为止没有文献报道，本研究对这两种最简单的
方法进行了尝试，发现 CTAB法提取的 DNA效果很
好，只要在裂解液中加入 2%的 PVP和 2%的 β-巯
基乙醇可有效地去除多糖和酚类物质，所有材料的
DNA都一次性提取成功，且量较大，因此，通过本项
研究为落羽杉属植物分子标记的研究提供了一种最
简便的 DNA提取方法。
SRAP-PCR反应的扩增效率是反应体系中各因
素综合作用的结果，建立稳定的 PCR 反应体系是
SRAP多态性应用的基础。目前 PCR体系优化的方
法主要有两种：单因素试验与正交试验优化。相比较
而言，采用正交试验设计，用较少的试验次数而得到
极佳的试验结果，较单因素试验设计节省了大量的
时间、人力和物力(杜黎明等, 2007;孙晋科等, 2007)。
本文选择 L9(34)正交设计法对影响落羽杉属植物
SRAP-PCR反应体系的4个因素(Taq酶, Mg2+, dNTP,
引物)在 3个水平上进行了优化，经过体系优化实验 9
个反应体系的扩增图谱，很明显地发现第 7体系优于
其它体系，从而建立了落羽杉属植物 SRAP-PCR的最
佳反应体系：10 μL体系中含有 1 μL 10×PCR buffer，
Mg2+ 2.0 mmol/L，dNTP 100 μmol/L，引物 0.3 μmol/L，
Taq DNA聚合酶 0.5 U和 50 ng模板 DNA。应用优
化后的体系随机选取了 48对 SRAP引物对落羽杉
和墨杉及其 4个杂交后代进行扩增，结果发现 48对
引物均可扩增出清晰的谱带，且多态性较高，并且在
应用中发现，通过两亲本落羽杉和墨杉在一些引物
中的特异性条带，可以将 4个杂交后代均鉴定为真
杂种，如引物组合 Me9+Em10的扩增结果中，4个后
代既具有父本的特异带又具有母本的特异带，即仅
这 1对 SRAP引物就可以鉴定 4个后代的真实性，
大大提高了分子鉴定的效率，这说明本试验所建立
的 SRAP-PCR反应体系不仅稳定性好，而且可以有
效地应用于落羽杉属植物的杂种(或品种)鉴定以及
遗传多样性的研究中。该 SRAP-PCR反应体系的成
功建立为今后落羽杉属植物的品种鉴定、遗传多样
性研究、指纹图谱构建以及遗传连锁图谱的构建等
均奠定了重要基础，也将促进落羽杉属植物的分子
标记及遗传育种研究进程。
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