全 文 ：· 86　· 2008No.22SerialNo.199 ChinaBrewing　　　 FoodSafety＆Detection
牛 肝 菌 多 糖 的 含 量 测 定
李燕平 ,袁永俊＊ ,张黎明 ,徐梦虬
(西华大学 生物工程学院 ,四川 成都 610039)
摘　要:苯酚-硫酸法是测定多糖的常用方法 ,影响该法显色的因素较多 ,对不同多糖物质 ,其最佳显色条件不同。采用正交试验设计法确定
牛肝菌多糖的最佳显色条件。结果表明 ,在显色时间 25min、显色温度 70℃、苯酚 1.2mL、硫酸 8.0mL条件下 ,采用苯酚-硫酸法测定牛肝菌
多糖含量时 ,平均回收率达 99.0%, RSD3.70%(n=6)。
关　键　词:牛肝菌;多糖;苯酚 -硫酸法;含量测定;显色条件
中图分类号:O657.32　　　文献标识码:A　　　文章编号:0254-5071(2008)22-0086-03
Determinationofpolysaccharidesinboletus
LIYanping, YUANYongjun＊ , ZHANGLiming, XUMengqiu
(SchoolofBioengineeringofXihuaUniversity, Chengdu610039 , China)
Abstract:Phenol-sulfuricacidmethodisacommonlyusedmethodformeasuringpolysaccharides.However, manyfactorsafectthecoloredconditionsand
diferenttypesofpolysaccharideshavedifferentcoloredconditions.Inthistest, colorimetricmethodforthedeterminationofpolysaccharidesinboletuswas
developedbytheuseofphenol-sulfuricacidandoptimizedbyorthogonalexperimentations.Theresultsshowedthatundertheoptimalconditionsoftime25
min, temperature70℃, phenol1.2mlandsulfuricacid8.0ml, thismethodwasrapidandaccuratewithgoodreproducibility.Theaveragerecoverywas
99.0﹪ , andtherelativestandarddeviationwas3.70﹪.
Keywords:boletus;polysaccharides;phenol-sulfuricacidmethod;contentdetermining;coloredconditions
　
收稿日期:2008-08-26
作者简介:李燕平(1984-),女 ,四川自贡人,硕士研究生 ,主要从事食品生物技术方向工作;袁永俊＊:通讯作者。
近年来我国对多糖的研究进展很快 ,多糖具有生物
活性和功能 (如能增强机体免疫功能及抗癌等 )作
用 [ 1] 。张小燕等 [ 2]报道美味牛肝菌多糖对机体中枢免
疫器官胸腺以及淋巴细胞的增长均有明显的促进作用 ,
另外还具有抗衰老的功效。
测定多糖含量常采用苯酚-硫酸比色法 [ 3] ,但影响该法
显色的因素较多 ,且对不同的多糖物质 ,其检测的最佳显色
条件不同 [ 4] 。本试验以巴山美味牛肝菌作为测定样品 ,采用
正交设计 L9(34)优化显色条件 ,研究苯酚-硫酸法测定牛肝菌
多糖含量 ,得到最佳显色条件 ,对于牛肝菌多糖提取工艺的
优化评价具有重要意义 ,对牛肝菌进行深加工提供参考。
1仪器与材料
UV-2600紫外可见分光光度计:尤尼柯(上海)仪器
有限公司;苯酚 、硫酸 、葡萄糖 、乙醇 (A.R.)均为科龙化
工试剂厂生产;巴山美味牛肝菌:市售。
2条件与方法
2.1牛肝菌多糖的提取
参考文献 [ 5 ]对多糖的提取方法:称取牛肝菌粉末
0.2g,用 80%vol乙醇 100mL回流提取 1h,过滤 ,菌粉用
80%vol乙醇洗涤(10mL×3)以去除单糖 、双糖 、低聚糖等
干扰性成分[ 6] 。菌粉连同滤纸置于烧瓶中 ,用 100mL水加
热提取 1h,过滤 ,菌粉用热水洗涤(10mL×3),洗液并入滤
液 ,将滤液移入 250mL容量瓶中 ,稀释至刻度 ,备用。
2.2测定方法
精密吸取多糖溶液 0.8mL置于 10mL干燥比色管中 ,
加入 5%的苯酚 1.2mL,混匀 ,迅速滴加浓硫酸 8mL,即刻摇
匀 ,于 70℃水浴中加热 25min,采用流水冷却后于波长
486nm处比色测吸光度值。
2.3多糖含量的计算
采用苯酚 -硫酸法测定多糖 [ 6]时 ,大部分以葡萄糖作为
标准品 ,并证实是可行的。试验也采用葡萄糖作为测定多
糖的标准品 ,根据得到的葡萄糖浓度(C)、样品质量(W样)
和样品液的稀释因素(D)计算多糖含量(%):
多糖含量 =C×DW样 ×100%。
2.4显色条件的选择
2.4.1最大吸收波长的选择
吸取一定标准葡萄糖溶液和和牛肝菌多糖溶液按测定
方法分别显色 ,全波长扫描 ,扫描图谱见图 1。由图 1看出 ,
牛肝菌多糖经苯酚-硫酸法显色后 ,其最大吸收峰在波长
486nm处 ,与葡萄糖基本相同 ,所以测定牛肝菌多糖含量时
使用的吸收波长为 486nm。
2.4.2显色条件的选择
苯酚 -硫酸法的显色原理:多糖或寡糖被硫酸水解成单
糖 ,并迅速脱水生成糠醛衍生物 ,再与苯酚络合成有色物
质。经试验发现此有色物质在波长 486nm处和一定浓度范
围 ,其吸收值与糖浓度呈线性关系 ,从而可用比色法测定多
糖含量。试验以显色时间(A)、显色温度(B)、苯酚的用量
(C)、浓硫酸的用量(D)为考察因素 ,通过预试验 ,确定各个
食品安全与检测 　　中 国 酿 造 2008年 第 22期总第 199期 · 87　·
因素的水平值 ,在此基础上 ,采用正交试验设计优选最佳显
色条件 ,试验数据和计算结果(表 1)。由极差分析可知 ,硫
酸用量是影响显色条件最主要因素 ,最佳显色条件为
A3B2C3D3 ,即显色时间 25min,显色温度 70℃, 5%的苯酚
1.2mL,浓硫酸 8mL。在最佳工艺条件下进行 3次验证试
验 ,吸光度值的平均值为 0.210。
图 1牛肝菌多糖(A)、葡萄糖(B)吸收光谱
Figure1.Absorptionspectrumofpolysaccharides(A)andglu-
cose(B)inboletus
表 1优化测定显色条件正交试验设计及结果
Table1.Resultoforthogonaltest
试验号 A显色时间 /min
B显色温度 /
℃
C5%苯酚 /
mL
D浓硫酸 /
mL
Y吸光
度值
1 15 40 0.8 6 0.138
2 15 70 1.0 7 0.191
3 15 100 1.2 8 0.187
4 20 40 1.0 8 0.194
5 20 70 1.2 6 0.160
6 20 100 0.8 7 0.167
7 25 40 1.2 7 0.205
8 25 70 0.8 8 0.193
9 25 100 1.0 6 0.126
∑(1) 0.516 0.537 0.498 0.424
∑(2) 0.521 0.544 0.511 0.563
∑(3) 0.524 0.480 0.552 0.574
k1 =∑(1)/3 0.172 0.179 0.166 0.141
k2 =∑(2)/3 0.174 0.181 0.170 0.188
k
3
=∑(3)/3 0.175 0.160 0.184 0.191
极差 R 0.003 0.021 0.018 0.050
因素影响顺序 D>B>C>A
2.5标准曲线的制定
精密称取已干燥至恒重的无水葡萄糖 100mg置于
100mL容量瓶中 ,加水稀释至刻度 ,摇匀。再吸取该标准溶
液 10mL于 100mL容量瓶中 ,加水稀释至刻度 ,摇匀 ,该标
准葡萄糖溶液浓度为 0.1mg/mL。精密吸取 0.1mg/mL标
准葡萄糖溶液 0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL分别置
于 10mL比色管 ,各加水使体积为 0.8mL,再各加 5%的苯酚
1.2mL,摇匀 ,迅速滴加浓硫酸 8.0mL,摇匀 ,于 70℃水浴中
加热 25min,采用流水冷却后于波长 486nm处比色测吸光
度值。另取 0.8mL水 ,同上操作加苯酚 、硫酸进行显色反
应 ,作为空白对照。以吸光度值为纵坐标 ,葡萄糖浓度为横
坐标 ,求得标准曲线回归方程为:y=0.6917x– 0.0019,相
关系数 R2 =0.9994,表明在所试验的 0.1mg/100mL～
0.8mg/100mL范围内呈良好线性关系 ,结果见图 3。
图 3葡萄糖标准曲线
Figure3.Standardcurveofglucose
2.6精密度试验
取同一样品溶液按上述方法 2.2测定 6次 ,结果(表 2)
表明 ,精密度良好。
表 2精密度试验结果
Table2.Resultofprecisiontest
吸光度值测定值
1# 2# 3# 4# 5# 6#
平均吸光度值 RSD/%
0.164 0.165 0.165 0.154 0.163 0.153 0.160 3.49
2.7稳定性试验
取同一样品溶液按上述方法 2.2测定 ,显色后间隔不
同时间 ,在波长 486nm处测吸光度值 ,表明样品溶液在 1h
内吸光度值稳定 ,结果见表 3。
表 3稳定性试验结果
Table3.Resultofstabilitytest
结果 放置时间 /min
0 5 10 15 20 25 30 40 50 60
吸光度值 0.164 0.165 0.1640.164 0.163 0.163 0.163 0.163 0.163 0.163
2.8重现性试验
按多糖的提取方法 2.1及多糖含量测定方法 2.2对同
一样品重复测定 6次 ,结果(表 4)表明 ,重现性良好。
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表 4重现性试验结果
Table4.Resultofreproducibletest
吸光度值测定值
1# 2# 3# 4# 5# 6#
平均吸光度值 RSD/%
0.148 0.149 0.152 0.157 0.151 0.164 0.154 3.92
2.9牛肝菌多糖含量的测定
牛肝菌粉末按方法 2.1、2.2和 2.3进行提取与测
定 ,吸光度值代入标准曲线 ,求得牛肝菌多糖含量 ,结果
见表 5。
表 5牛肝菌多糖含量测定
Table5.Contentofpolysaccharidesinbletus
多糖含量 /%
1# 2# 3# 4# 5# 6#
平均多糖含量 /%
3.39 3.42 3.49 3.60 3.46 3.78 3.52
2.10回收率试验
表 6回收率试验结果
Table6.Resultofrecoverytest
次数多糖含量 /μg
加入葡
萄糖 /μg
测得糖 /
μg
回收率 /
%
平均回
收率 /%
RSD/
%
1 16.29 4 19.99 98.52
2 16.29 7 23.17 99.48
3 16.29 10 26.36 100.26
4 16.29 13 29.84 101.88
5 16.29 17 33.90 101.83
6 16.29 20 37.09 92.03
99.00 3.70
采用加样回收法。吸取多糖样品溶液 0.6mL,分别加
入 0.1mg/mL标准葡萄糖溶液 0.04mL、0.07mL、0.10mL、
0.13mL、0.17mL、0.2mL,加水至 0.8mL,按上述方法 2.2测
定 ,结果(表 6)表明 ,其回收率高达 99.00%,说明该方法的
准确度高。
3结论
苯酚 -硫酸法是测定多糖的常用方法 ,影响该法显色的
因素较多 ,对不同多糖物质 ,其最佳显色条件不同。试验采
用正交设计 L9(34)优化显色条件 ,试验表明 ,硫酸用量是显
色的主要因素 ,最佳显色条件为显色时间 25min,显色温度
70℃, 5%的苯酚 1.2mL,浓硫酸 8mL。通过线性关系考察、
精密度 、重现性 、回收率试验及样品测定结果 ,表明试验所
确定的提取方法及用苯酚 -硫酸法测定牛肝菌多糖 ,操作
简单 、迅速 ,检测数据真实可靠 ,对于牛肝菌多糖提取工
艺的优化评价具有重要意义。
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