全 文 ：ChineseJournalofNewDrugs2011, 20(3)
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中国新药杂志 2011年第 20卷第 3期
[作者简介 ] 　吴怀恩 ,女 ,博士研究生, 主要从事中药药效物质基础
与质量标准化研究。联系电话:(0771)3137585, E-mail:wuhe0001@
yahoo.com.cn。
·实验研究·
HPLC法同时测定旋覆花配方颗粒中绿原酸及咖啡酸含量
吴怀恩 ,周燕园 ,杨志丽 ,魏后超 ,黄　莉
(广西中医学院药学院 ,南宁 530001)
　　[摘要 ] 　目的:建立同时测定旋覆花配方颗粒中绿原酸及咖啡酸含量的 HPLC方法。方法:采用正交
试验优化旋覆花配方颗粒的提取工艺 ,用 HPLC法测定旋覆花配方颗粒中绿原酸及咖啡酸的含量。色谱柱
为 Shim-packVP-ODS柱(250nm×4.6mm, 5μm);流动相为乙腈-0.1%磷酸(9∶91);检测波长为 327nm;流
速为 1.0mL·min-1。结果:绿原酸在 0.86 ～ 2.58 μg(r=0.999 9)范围内线性关系良好 ,平均回收率为
102.95%, RSD为 1.21%;咖啡酸在 0.28 ～ 1.10 μg(r=0.999 9)范围内线性关系良好 , 平均回收率为
99.72%, RSD为 1.64%。结论:该方法简便 、快速 、重复性好 ,可作为旋覆花配方颗粒中绿原酸及咖啡酸的
含量测定方法 。
[关键词 ] 　旋覆花配方颗粒;高效液相色谱法;绿原酸;咖啡酸
[中图分类号 ] R927.2　　[文献标志码 ] A　　[文章编号 ] 1003-3734(2011)03-0280-04
DeterminationofchlorogenicacidandcaffeicacidinXuanfuhua
dispensinggranulebyHPLC
WUHuai-en, ZHOUYan-yuan, YANGZhi-li, WEIHou-chao, HUANGLi
(ColegeofPharmacy, GuangxiTraditionalChineseMedicalUniversity, Nanning530001, China)
[ Abstract] 　Objective:TodevelopaHPLCmethodforthesimultaneousdeterminationofchlorogenicacid
andcafeicacidinXuanfuhuadispensinggranule.Methods:Theorthogonaltestwasusedtooptimizeextractcondi-
tions.ChlorogenicacidandcafeicacidwereseparatedonShim-packVP-ODS(250mm×4.6mm, 5μm)column
anddetectedat327nm, withAcetonitrile-0.1% phosphoricacidsolution(9∶91)asmobilephase.Theflowrate
was1.0mL·min-1.Results:Themethodhadgoodlinearrelationshipintherangeof0.86 ～ 2.58μg(r=0.999 9)
forchlorogenicacidand0.28 ～ 1.10μg(r=0.999 9)forcafeicacid, respectively.Theresultsoftheaveragere-
coverywere102.95% withRSDof1.21%forchlorogenicacidand99.72% withRSDof1.64%forcafeicacid.
Conclusion:Themethodwassimpleandreliablewhichcanbeusedtosimultaneouslydeterminechlorogenicacid
andcafeicacidinXuanfuhuadispensinggranule.
[ Keywords] 　Xuanfuhuadispensinggranule;HPLC;chlorogenicacid;cafeicacid
　　旋覆花为菊科植物旋覆花 Inulajaponica
Thunb.或欧亚旋复花 I.britannicaL.的干燥头状花
序 ,味苦 ,辛 、咸 ,性微温 ,归肺 、脾 、胃 、大肠经。具有
降气 、消痰 、行水 、止呕等功效 ,中医临床多用于风寒
咳嗽 、痰饮蓄结 、胸膈痞满 、喘咳痰多 、呕吐噫气 、心
下痞硬等症[ 1] 。旋覆花配方颗粒是旋覆花饮片经
水提 、浓缩 、干燥 、制粒等工序制成的单味中药配方
颗粒剂 。据报道 [ 2-3] ,绿原酸 、咖啡酸为旋覆花抗菌
消炎作用的酚酸类活性成分 。 《中华人民共和国药
典》2005年版暂未规定旋覆花的含量测定项。本实
验运用正交试验确定旋覆花配方颗粒中绿原酸 、咖
啡酸的最佳提取工艺 ,并采用 HPLC法[ 1-2, 4]同时测
定制剂中绿原酸 、咖啡酸含量 ,为旋覆花配方颗粒的
质量控制提供科学依据。
仪器和试药
Agilent1100高效液相色谱仪 (美国 Agilent公
司);LG16 -W型高速离心机 (北京医用离心机
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厂);B3500S-MT超声清洗仪(上海必能信超声有
限公司);电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械
厂);BP211D电子分析天平(德国赛多利斯);SHZ
-D循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限公司)。
绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所 ,批号:
110753-200413);咖啡酸对照品(中国药品生物制品
检定所 ,批号:110885-200102);旋覆花配方颗粒(江
阴天江药业有限公司 , 批号:0902050, 0906038,
0908142)。乙腈 (色谱纯 ,美国 Fisher科学世界公
司);甲醇(分析纯 ,国药集团化学试剂有限公司);
水为纯化水。
方法与结果
1　色谱条件
色谱柱:Shim-packVP-ODS(250nm×4.6mm, 5
μm);流动相为乙腈 -0.1%磷酸(9∶91);检测波长为
327nm;流速为 1.0mL·min-1;柱温为室温;进样量
为 10μL;理论塔板数按绿原酸峰计算≥5 000,按咖
啡酸峰计算≥6 000。
2　对照品溶液的制备
精密称取绿原酸对照品 5.38mg,置 25mL量瓶
中 ,加 75%甲醇适量使溶解并定容至刻度 ,摇匀 ,即
得浓度为 0.215 2mg·mL-1的绿原酸对照品溶液。
精密称取咖啡酸对照品 2.87mg,置 25mL量瓶
中 ,加 75%甲醇适量使溶解并定容至刻度 ,摇匀 ,吸
取 6mL置 10mL量瓶中 ,加 75%甲醇定容至刻度 ,
摇匀 ,即得浓度为 0.068 88mg·mL-1的咖啡酸对照
品溶液 。
3　供试品溶液的制备
精密称取旋覆花配方颗粒 0.5g,置具塞锥形瓶
中 ,精密加 75%甲醇 15mL,密塞 ,称定重量 ,超声
(功率:140 W,频率:42kHz)提取 60min,放冷 ,用
75%甲醇补足减失的重量 ,摇匀 ,滤过 ,取续滤液离
心即得 。
4　阴性对照溶液的制备
取旋覆花配方颗粒的辅料交联淀粉适量 ,按供
试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液 。
5　专属性试验
分别精密吸取上述咖啡酸对照品溶液 、绿原酸
对照品溶液 、供试品溶液和阴性对照溶液各 10μL
进样分析 ,结果见图 1。绿原酸 、咖啡酸的保留时
间分别为 19.4和 25.3min,与各自相邻峰的分离
度均 >1.5。阴性对照不干扰本品中 2种活性成
分的测定 。
图 1　绿原酸对照品(A)、咖啡酸对照品(B)、供试品(C)和阴性对照样品(D)的高效液相色谱图
6　供试品处理的正交试验
根据绿原酸 、咖啡酸的性质及初步预试验结果 ,
采用正交试验 L9 (34)进行旋覆花配方颗粒的甲醇
超声提取工艺研究 ,以绿原酸 、咖啡酸的含量为评价
指标 , 选择甲醇浓度 (50%, 75%, 100%)、料液比
[ 1∶30, 1∶40, 1∶50(g·mL-1)] 、超声时间(20, 40, 60
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min)3个因素 ,每个因素设 3个水平 。结果表明 ,各
因素对 2种成分的总含量影响顺序为甲醇浓度 >料
液比 >超声时间 ,确定最佳提取工艺为 75%甲醇 30
倍量 ,超声处理 60min。
精密称取旋覆花配方颗粒 3份 ,每份 0.5g,按
照上述最佳工艺进行超声提取 ,并按供试品溶液制
备方法制备 ,按上述色谱条件下精密吸取 10μL进
样分析 。结果表明 ,本法的提取效果较好 。见表 1。
表 1　验证试验结果 n=3
序号
绿原酸 咖啡酸 绿原酸 +咖啡酸
含量
/mg·g-1
平均含量
/mg·g-1
RSD
/%
含量
/mg·g-1
平均含量
/mg·g-1
RSD
/%
总含量
/mg·g-1
平均总含量
/mg·g-1
RSD
/%
1 4.58 2.00 6.58
2 4.51 4.56 0.87 2.03 2.01 0.76 6.54 6.57 0.40
3 4.58 2.01 6.59
7　线性关系考察
分别精密吸取绿原酸对照品溶液 4, 6, 8, 10, 12
μL,咖啡酸对照品溶液 4, 8, 10, 12, 16μL注入液相
色谱仪进行分析 ,以进样量(X, μg)为横坐标 ,峰面
积(Y)为纵坐标绘制标准曲线 ,得到绿原酸回归方
程为:Y=2 899.33X-1.82, r=0.999 9;咖啡酸回归
方程为:Y=5 212.72X+46.58, r=0.999 9。结果
表明 ,绿原酸 、咖啡酸分别在 0.86 ～ 2.58 μg和
0.28 ～ 1.10μg范围内 ,进样量与峰面积呈良好线
性关系。
8　精密度试验
分别精密吸取上述绿原酸对照品溶液 、咖啡酸
对照品溶液 10μL,连续进样 6次 ,计算峰面积 RSD
分别为 0.33%, 0.15%。表明仪器精密度良好。
9　稳定性试验
取同一份供试品(批号 0902050),按供试品溶
液制备方法制备 ,以上述色谱条件分别在 0, 2 , 4, 6,
8, 12h进样 10μL,测定绿原酸和咖啡酸的峰面积 ,
RSD分别为 1.40%, 1.82%。表明供试品溶液在
12h内稳定。
10　重复性试验
取同批号(批号 0902050)供试品 6份 ,分别按
供试品溶液制备方法制备 ,以上述色谱条件进样
10μL,结果绿原酸平均含量为 4.56mg·g-1 , RSD为
0.86%;咖啡酸平均含量为 2.01 mg·g-1 , RSD为
1.10%。表明本法重复性良好。
11　加样回收率试验
取同批号(批号 0902050)已知含量的供试品 6
份 ,分别精密加入一定量的绿原酸 、咖啡酸对照品 ,
按供试品溶液制备方法制备 ,以上述色谱条件进样
10μL,测定绿原酸 、咖啡酸的含量 。结果表明 ,本法
准确度较好 。见表 2。
表 2　样品中绿原酸 、咖啡酸加样回收率测定结果 n=6
化合物 已知量 /mg 加入量 /mg 测得量 /mg 回收率 /% 平均回收率 /% RSD/%
绿原酸 1.12 1.14 2.31 104.03 102.95 1.21
1.15 1.14 2.33 103.91
1.13 1.14 2.31 103.11
1.16 1.14 2.34 103.54
1.15 1.14 2.32 102.39
1.13 1.14 2.28 100.72
咖啡酸 0.50 0.51 1.01 100.89 99.72 1.64
0.50 0.51 1.01 99.04
0.50 0.51 1.01 99.98
0.51 0.51 1.01 97.82
0.51 0.51 1.01 98.41
0.50 0.51 1.02 102.18
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12　样品的测定
按供试品溶液制备方法和色谱条件 ,对 3批旋
覆花配方颗粒进行含量分析 ,结果见表 3。
表 3　样品中绿原酸和咖啡酸含量测定结果 n=3
批号 绿原酸含量/mg·g-1
RSD
/%
咖啡酸含量
/mg·g-1
RSD
/%
0902050 4.56 0.81 2.01 1.14
0906038 4.86 1.02 2.03 1.23
0908142 4.27 0.96 1.99 1.27
讨　　论
1　提取条件的优化
本试验采用正交试验优化提取条件 ,以极差 R
值确定影响因素的主次排序 ,以 K值选择各因素最
优水平 ,再通过方差分析判断各因素对实验结果是
否有显著性的影响。实验表明 , 3个因素中甲醇浓
度对结果有显著性影响 ,为保证绿原酸和咖啡酸的
提取效率 ,将最佳工艺确定为加入 30倍量的 75%
甲醇 ,超声处理 60min。
本正交优化试验有绿原酸和咖啡酸 2项评价指
标 ,绿原酸含量与咖啡酸含量相当 ,并且二者含量的
变化趋势基本一致 ,因此在实际生产中可以二者总
含量为评价指标。
2　流动相的选择
本研究曾以乙腈-0.4%磷酸溶液 (11∶89)[ 1] 、
(10∶90)[ 2, 4]为流动相 ,绿原酸与咖啡酸分离效果均
不理想 。流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液(9∶91)可使
二者与其他组分得到较好分离 。但是考虑到 pH值
过低对色谱柱的损坏 ,最终采用乙腈-0.1%磷酸溶
液(9∶91)为流动相。
3　含量测定结果的分析
以绿原酸和咖啡酸作为指标成分 ,测定同一厂
家不同批号旋覆花配方颗粒的含量 ,其结果存在一
定差异 ,这可能与旋覆花的采收季节 ,来源及加工过
程有关 ,因此应对市场上该产品建立一定的质量控
制体系 。
[ 　参　考　文　献　]
[ 1] 　国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[ S] .2005年
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编辑:周卓 /接受日期:2010-03-24
　(上接第 269页)
PVA浓度 、乳化搅拌速度是影响盐酸噻吩诺啡微球
体外释放的主要因素 ,其中微球释放速度最主要的
影响因素是载体材料 PLGA的相对分子质量 。通过
选择不同相对分子质量的 PLGA可以显著地改变微
球释药速度和释药周期。因此在开发微球制剂时 ,
应根据所需要的释药周期 ,选择合适的 PLGA材料。
选择减小理论载药量 、PLGA浓度和 PVA浓度可以
降低突释 ,减缓释放速度;乳化搅拌速度对微球突释
有较大影响 ,而后期释药行为影响不大 。
但是体外释放度试验不能完全模拟体内环境 ,
体内酶的作用和降解所产生的酸性物质等等都有可
能影响 PLGA的降解速度 [ 6] ,因此盐酸噻吩诺啡微
球在体内的释药速度还有待进一步评价。
[ 　参　考　文　献　]
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编辑:周卓 /接受日期:2010-08-20