全 文 ： 菌物学报     
jwxt@im.ac.cn  15 March 2014, 33(2): 242‐253  
Http://journals.im.ac.cn  Mycosystema ISSN1672‐6472    CN11‐5180/Q © 2014 IMCAS, all rights reserved.   
 
研究论文  Research paper      DOI: 10.13346/j.mycosystema.130069 


基金项目：浙江省自然科学基金（No. Y3100345，No. Y3090380，No. Y3110048）；浙江省森林食品研究创新团队建设
与人才培养项目（No. 2012F20012）；丽水市科技计划项目（No. 20120410） 
*Corresponding author. E‐mail: lihaibozj@126.com 
收稿日期: 2013‐03‐24,  接受日期: 2013‐04‐22 
 
牛肝菌属卷边组 Boletus sect. Appendiculati物种的分子识别 
魏海龙 1     李海波 1*     王丽玲 1     丁红梅 2     胡传久 1     曾凡清 3       
程俊文 1 
1浙江省林业科学研究院  浙江  杭州  310023 
2浙江中医药大学  浙江  杭州  310053 
3丽水市农业科学研究院  浙江  丽水  323000 
 
 
 
摘    要：依据牛肝菌属卷边组 Boletus  sect.  Appendiculati 内 7 个物种的核糖体基因 rDNA 内转录间隔区（internal 
transcribed spacer，ITS）序列比对，设计 5 对 ITS 特异引物，分别用于卷边牛肝菌 Boletus appendiculatus 与亚卷边
牛肝菌 B. subappendiculatus、卷边牛肝菌与拟桃红牛肝菌 B. pseudoregius、华靛牛肝菌 B. roseoflavus 与卷边牛肝菌
B. appendiculatus、华靛牛肝菌与华美牛肝菌 B. speciosus、拟桃红牛肝菌与华美牛肝菌的相互识别。ITS 区段的 PCR
扩增结果表明，5 对 ITS 特异引物皆成功扩增出可用于辨别这些近缘物种的目的条带。但未能设计出 ITS 特异引物，
以识别华靛牛肝菌与桃红牛肝菌 B. regius 两个近缘物种。 
关键词：牛肝菌，分类，ITS 
 
Molecular recognition of species in Boletus sect. Appendiculati 
WEI Hai‐Long1      LI Hai‐Bo1*      WANG Li‐Ling1      DING Hong‐Mei2      HU Chuan‐Jiu1       
ZENG Fan‐Qing3      CHENG Jun‐Wen1 
1Zhejiang Forestry Academy, Hangzhou, Zhejiang 310023, China 
2Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou, Zhejiang 310053, China 
3Lishui Academy of Agricultural Sciences, Lishui, Zhejiang 323000, China 
Abstract: Based on the sequences of internal transcribed spacer (ITS) of seven species in Boletus sect. Appendiculati, five 
pairs  of  specific  ITS  primers  were  designed  and  used  for  the  amplification  of  ITS  region  in  order  to  distinguish  B. 
魏海龙 等 /牛肝菌属卷边组 Boletus sect. Appendiculati 物种的分子识别





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appendiculatus  versus  B.  subappendiculatus,  B.  appendiculatus  versus  B.  pseudoregius,  B.  roseoflavus  versus  B. 
appendiculatus, B. roseoflavus versus B. speciosus, and B. pseudoregius versus B. speciosus, respectively. The results of 
PCR analysis using  the  five specific  ITS primers showed  that  the  target band  is amplified successfully  from  the species 
pairs,  respectively,  which  could  be  used  for  the  molecular  recognition  of  these  species.  However,  the  molecular 
recognition of B. roseoflavus versus B. regius is not achieved for lacking specific ITS primers to be designed.     
Key words: Boletus, taxonomy, ITS 
 
 
牛肝菌属 Boletus  L.是高等真菌的重要类
群，该类真菌不但具有重要的生态功能，而且
还是重要的食药用真菌（臧穆  2006；戴玉成
和杨祝良  2008；戴玉成等  2010）。牛肝菌属
卷边组 Boletus  sect.  Appendiculati  Konrad  & 
Maubl. ex Lannoy & Estadès 物种广泛分布于北
半球（Singer 1986），其典型特征为子实体的菌
柄上或多或少有网纹，全菌柄呈一致黄色，菌
管和菌孔受伤后经常变蓝；菌肉变蓝或不变
蓝，口尝具温和口感；许多种在菌柄基部呈些
许粉红色彩。近年来的分子研究支持分布于欧
洲的 5个物种是隶属于该牛肝菌属卷边组的真
正成员，包括卷边牛肝菌 B.  appendiculatus 
Schaeff.: Fr.、亚卷边牛肝菌 B. subappendiculatus 
Dermek,  Lazebn.  &  J.  Veselský、费氏牛肝菌 B. 
fechtneri Velen.、拟桃红牛肝菌 B. pseudoregius 
(Huber) Estadès 和桃红牛肝菌 B. regius Krombh.
（Singer 1986；Marques & Muñoz 2006）。最近
研 究 报 道 的 源 自 中 国 的 华 靛 牛 肝 菌 B. 
roseoflavus Hai B. Li & Hai L. Wei新种为牛肝菌
属卷边组的又一成员（Li et al. 2013）。 
自上世纪以来，国际真菌分类界对牛肝菌
属卷边组内的一些种的错误鉴定就曾有报道，
例如产于欧洲的拟桃红牛肝菌曾被错误地冠
以了华美牛肝菌 B.  speciosus  Forst.的种名
（Assyov  &  Denchev  2004），二者虽在形态特
征、颜色和变色反应上的差别并不显著，但并
非同种。华美牛肝菌是最初描述于北美的牛肝
菌属卷边组物种（Smith & Thiers 1971），其鉴
别特征为菌盖颜色为鲜红到玫瑰红色，菌肉、
菌孔受伤后均立刻变蓝，与产于欧洲的拟桃红
牛肝菌的粉红色、暗红色菌盖显然不同。源自
中国的华靛牛肝菌标本先后被错误鉴定为桃
红牛肝菌、华美牛肝菌和卷边牛肝菌，事实上
华靛牛肝菌与这些最初描述于欧洲和北美的
种并非同一物种（Li  et  al.  2013）。Kuthan  & 
Kotlaba（1981）将源自保加利亚的一份标本鉴
定为卷边牛肝菌，之后修正为拟桃红牛肝菌
（Kuthan & Kotlaba 1989）。此外，同为牛肝菌
属卷边组内产于欧洲的亚卷边牛肝菌与卷边
牛肝菌尤为相近，区别仅在于亚卷边牛肝菌的
菌肉受伤不变蓝、菌帽颜色略白以及在生长林
地上的差别（Assyov & Gyosheva 2010）。 
鉴于牛肝菌属卷边组物种鉴定的混乱，
Assyov（2012）和 Li et al.（2013）提出了对该
组内几个种辨别的主要外形特征，其中子实体
在菌盖颜色和变色反应上的差异是典型特征，
显微特征如担孢子大小只能作为次级辨别特
征。尽管菌盖颜色和变色反应上的差异是辨别
牛肝菌属卷边组内物种的主要特征，但在对野
外标本的主观判别上，由于菌盖颜色和变色反
应常常易受生境、气候、土壤类型、子实体生
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长期、生理状况等的影响而导致判断出现偏
差。对于长期保藏的干标本，特别是古老标本、
模式标本的重新鉴别研究，仅凭子实体颜色、
形态特征更是难以准确鉴定。因此，在大型真
菌分类研究上，分子技术已成为了对标本辅助
鉴定的重要手段。 
真菌的核糖体基因 rRNA 的内转录间隔区
（internal transcribed spacer，ITS）的保守性基
本上表现为种内相对一致，种间差异比较明
显，这使得 ITS 区段不仅适合于属内物种间或
种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分
析，而且非常适合于真菌物种的分子鉴定。近
年来，在研究华靛牛肝菌时，我们借用了产自
欧洲、北美和中国的卷边组内不同物种的标
本，并完成了 ITS 区段的 DNA 测序（Li  et  al. 
2013），本研究将在前期华靛牛肝菌新种研究
的基础上，基于这些牛肝菌物种已有的 ITS 序
列数据，通过进一步比对分析，设计 ITS 特异
引物以分别用于产于欧洲的卷边牛肝菌与亚
卷边牛肝菌、卷边牛肝菌与拟桃红牛肝菌，产
于中国的华靛牛肝菌与产于欧洲的卷边牛肝
菌、华靛牛肝菌与产于北美的华美牛肝菌，以
及产于欧洲的拟桃红牛肝菌与产于北美的华
美牛肝菌的相互识别，旨在为牛肝菌属卷边组
物种的准确鉴定提供分子数据。 
1 材料与方法 
1.1  研究标本与 ITS 序列 
在本研究使用的 30 份标本中，其中 21 份
标本的名称、产地、ITS 序列及其他有关信息
详见 Li et al.（2013）的描述，其余 9 份标本的
信息如下：拟桃红牛肝菌标本 3 份，借自比利
时国家植物园隐花植物标本室（Herbarium  of 
Cryptogams，the  National  Botanical  Garden  of 
Belgium， BR），即 VDKO431、 VDKO504 和
VDKO585，对应的 GenBank 序列号分别为
HQ882200、HQ882201 和 HQ882202。桃红牛
肝菌标本 3 份，即 Wu 26746、Wu 30042 和 Wu 
28971 ， 对 应 的 GenBank 序 列 号 分 别 为
KC416634、KC416635 和 KC416635；费氏牛肝
菌标本 3 份，即 Wu25234、Wu21299 和
Wu18427，对应的 GenBank 序列号分别为
KC416637、KC416638 和 KC416639。这 6 份标
本保存于维也纳大学植物学研究所标本室
（Herbarium of Institute of Botany，University of 
Vienna，WU）。所有标本的 DNA 提取、ITS 区
段扩增及测序采用 Li et al.（2013）的方法。 
1.2  方法 
1.2.1  ITS 特异引物设计：用 Clustal  X（version 
1.81）（ Thompson  et  al.  1997）软件中的
Alignment程序对研究物种的 ITS序列进行多重
对位排列（multiple  alignments），通过手工将
对位排列结果中 5和 3端的非对位排列区去
除。根据序列比对结果，设计可分别用于辨别
卷边牛肝菌与亚卷边牛肝菌、卷边牛肝菌与拟
桃红牛肝菌的两对 ITS 特异引物，用于辨别华
靛牛肝菌与卷边牛肝菌，华靛牛肝菌与华美牛
肝菌的两对 ITS 特异引物，以及可用于辨别拟
桃红牛肝菌与华美牛肝菌的一对 ITS 特异引
物。引物设计采用 Oligo 6.54  软件（MBI，USA），
引物合成由生工生物工程（上海）有限公司   
完成。   
1.2.2 ITS 特异引物对牛肝菌标本的 PCR 扩增：
PCR 扩增体系为 10×PCR Buffer 2.5L，10mmol/L 
dNTPs  2µL，25mmol/L  MgCl2  2µL，5U/µL  Taq 
DNA 酶 0.3µL，10mol/L  上下游 ITS 特异引物各
1µL，15ng/µL 模板 DNA  3µL，ddH2O  14.2µL，
反应总体积为 25µL。扩增反应在博日科技有限
公司（杭州）的 TC‐XP 型扩增仪上进行，94℃
预变性 6min 后；94℃变性 40s，退火 40s，72℃
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延伸 2min，共 30 个循环；最后于 72℃补平
7min，终止温度为 4℃。通过逐步提高 PCR 反
应的退火温度，取得对 ITS 特异引物对的最佳
退火温度（表 1）。 
 
表 1  辨别牛肝菌属卷边组各物种的 ITS 引物序列及其最适退火温度 
Table 1 Sequence of ITS primers used for distinguishing species  in Boletus sect. Appendiculati and  its optimal annealing 
temperature 
ITS 引物 
ITS primer 
序列 
Sequence (5 −3′ ′) 
退火温度 
Annealing  temperature 
(℃) 
扩增片段 
Amplified fragment 
(bp) 
可辨物种 
Target species pair 
Bsu_U  AGAAAAGCTCAGCCCGCTCAAA  60  Ba‐Bsu（630）  卷边牛肝菌与 
Bsu_L  ACTGTCGCTGGCCCCTCCACTCTG      亚卷边牛肝菌 
Bsu_U  AGAAAAGCTCAGCCCGCTCAAA  60  Ba‐Bsu（630）  B. appendiculatus versus
Bsu_L  ACTGTCGCTGGCCCCTCCACTCTG      B. subappendiculatus 
Bp_U  TAGCTCACAGCCCACTCAATGT  65  Ba‐Bp（481）  卷边牛肝菌与 
Bp_L  GGGATGGGACAGTCGGATAATGTT     拟桃红牛肝菌 
Bp_U  TAGCTCACAGCCCACTCAATGT  65  Ba‐Bp（481）  B. appendiculatus versus
Bp_L  GGGATGGGACAGTCGGATAATGTT     B. pseudoregius 
Broa_U  CTTGCTCAGCCCAACTCAACG  60  Bro‐Ba（625）  华靛牛肝菌与 
Broa_L  ATCTCTGGGTGGAGCATGTGCACG     卷边牛肝菌 
Broa_U  CTTGCTCAGCCCAACTCAACG  60  Bro‐Ba（625）  B. roseoflavus versus 
Broa_L  ATCTCTGGGTGGAGCATGTGCACG     B. appendiculatus 
Bros_U  ATTGAAGACCGTCCGGGATG  65  Bro‐Bs（437）  华靛牛肝菌与 
Bros_L  AGTTAAAAGTGACCAAGCC      华美牛肝菌 
Bros_U  ATTGAAGACCGTCCGGGATG  65  Bro‐Bs（437）  B. roseoflavus versus 
Bros_L  AGTTAAAAGTGACCAAGCC      B. speciosus 
Bps_U  AAGTGACCAAAAGCCAAGG  60  Bp‐Bs（435）  拟桃红牛肝菌与 
Bps_L  TGAAGACCGTCCGGGATGGGACAG     华美牛肝菌 
Bps_U  AAGTGACCAAAAGCCAAGG  60  Bp‐Bs（435）  B. pseudoregius versus 
Bps_L  TGAAGACCGTCCGGGATGGGACAG     B. speciosus 
注：字母 U 和 L 分别代表上、下游 ITS 特异引物，字母 Ba、Bsu、Bp、Bro 和 Bs 分别代表卷边牛肝菌、亚卷边牛肝
菌、拟桃红牛肝菌、华靛牛肝菌和华美牛肝菌. 
Note: The  letters U and  L  refer  to  the  specific upstream and downstream primer  for  the  ITS  region,  respectively. The 
letter Ba, Bsu, Bp, Bro and Bs refer to Boletus appendiculatus, B. subappendiculatus, B. pseudoregius, B. roseoflavus and 
B. speciosus, respectively.     
 
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1.2.3 PCR 产物检测和扩增图谱摄取：采用 1.5%
的琼脂糖凝胶电泳检测 ITS 特异引物对牛肝菌
标本 ITS 区段的 PCR 扩增产物，采用培清科技
有限公司（上海）的 JS‐380A 自动凝胶图像分
析仪摄取扩增图谱。 
2 结果与分析 
2.1 ITS 特异引物设计 
我们对 7份卷边牛肝菌标本和 3份亚卷边
牛肝菌标本所测得的 10个 ITS序列以及从国际
基因数据库 GenBank下载的 2个卷边牛肝菌种
的 ITS 序列经多重对位排列产生了 827 个碱基
位点，图 1 显示了可用于辨别卷边牛肝菌与亚
卷边牛肝菌的上游特异引物 Bsu_U 所在的第
1–124 位点区段及下游特异引物 Bsu_L 所在的
第 621–744 位点区段。 
对 9份卷边牛肝菌标本和 5份拟桃红牛肝
菌标本所测得的 14个 ITS序列经多重对位排列
产生了 846 个碱基位点，图 2 显示了可用于辨
别卷边牛肝菌与拟桃红牛肝菌的上游特异引
物 Bp_U 所在的第 1–124 位点区段及下游特异
引物 Bp_L 所在的第 501–625 位点区段。 
对 6 份产自中国的华靛牛肝菌标本和 9 份
卷边牛肝菌标本所测得的 15 个 ITS 序列经多重
对位排列产生了 825 个碱基位点，图 3 显示了
可用于辨别华靛牛肝菌与卷边牛肝菌的上游特
异引物 Broa_U所在的第 1–125位点区段及下游
特异引物 Broa_L 所在的第 626–750位点区段。 
对 6 份华靛牛肝菌标本和 3 份产自北美的
华美牛肝菌标本所测得的9个 ITS序列经多重对
位排列产生了 823 个碱基位点，图 4 显示了可
用于辨别华靛牛肝菌与华美牛肝菌的上游特异
引物 Bros_U所在的第 116–287位点区段及下游
特异引物 Bros_L 所在的第 581–751 位点区段。 
 
图 1  辨别卷边牛肝菌与亚卷边牛肝菌的 ITS 特异引物位点      小圆点表示碱基相同，短横线表示碱基缺失，箭头所
指分别为上下游引物 Bsu_U 和 Bsu_L，Ba 代表卷边牛肝菌，Bsu 代表亚卷边牛肝菌. 
Fig.  1  Localization  and  specificity  of  the  specific  ITS  primers  used  for  distinguishing  Boletus  appendiculatus  from  B. 
subappendiculatus. Dots  indicate sequences  identity. En dashes  indicate base deletion. The upstream and downstream 
primers  (Bsu_U  and Bsu_L)  are  indicated by  arrows  in  the  sequence. Ba  and Bsu  represent B. appendiculatus and B. 
subappendiculatus, respectively. 
魏海龙 等 /牛肝菌属卷边组 Boletus sect. Appendiculati 物种的分子识别





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图 2  辨别卷边牛肝菌与拟桃红牛肝菌的 ITS 特异引物位点      小圆点表示碱基相同，短横线表示碱基缺失，箭头所
指分别为上下游引物 Bp_U 和 Bp_L，Ba 代表卷边牛肝菌，Bp 代表拟桃红牛肝菌. 
Fig.  2  Localization  and  specificity  of  the  specific  ITS  primers  used  for  distinguishing  Boletus  appendiculatus  from  B. 
pseudoregius. Dots indicate sequences identity. En dashes indicate base deletion. The upstream and downstream primers 
(Bp_U and Bp_L) are  indicated by arrows  in the sequence. Ba and Bp represent B. appendiculatus and B. pseudoregius, 
respectively. 
 
对 5 份拟桃红牛肝菌标本和 3 份华美牛肝
菌标本所测得的 8 个 ITS 序列经多重对位排列
产生了 818 个碱基位点，图 5 显示了可用于辨
别拟桃红牛肝菌与华美牛肝菌的上游特异引物
Bps_U 所在的第 126–250 位点区段及下游特异
引物 Bps_L 所在的第 501–625 位点区段。 
上述 5 对 ITS 特异引物的碱基序列、退火
温度及扩增 ITS 片段长度详见表 1。 
2.2  牛肝菌属卷边组物种的分子识别 
分别以 7份卷边牛肝菌标本与 3份亚卷边
牛肝菌标本、与 5 份拟桃红牛肝菌标本，6 份
华靛牛肝菌标本与 7 份卷边牛肝菌标本、与 3
份华美牛肝菌标本，以及 5 份拟桃红牛肝菌标
本与 3 份华美牛肝菌标本的基因组 DNA 为模
板，以表 1所示各自的 ITS特异引物对进行 PCR
扩增。在各自 PCR 扩增经过优化取得的最适退
火温度下，两对特异引物 Bsu_U/Bsu_L 和
Bp_U/Bp_L 分别仅从亚卷边牛肝菌标本和拟
桃红牛肝菌标本中扩增出了唯一的一条带，且
片段长度与预期设计的一致，分别约为 630bp
和 481bp （ 图 6A ， B ）。 特 异 引 物 对
Broa_U/Broa_L 仅从华靛牛肝菌标本中扩增出
了唯一的一条带，且片段长度与预期设计的一
致，约为 625bp（图 6C）；特异引物对
Bros_U/Bros_L 从华靛牛肝菌标本中扩增出了
2 条带，其中片段较小的一条与预期设计的一
致，约为 437bp（图 6D）。特异引物对
Bps_U/Bps_L 仅从拟桃红牛肝菌标本中扩增出
了唯一的一条带，且片段长度与预期设计的一
致，约为 435bp（图 6E）。 
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图 3  辨别华靛牛肝菌与卷边牛肝菌的 ITS 特异引物位点      小圆点表示碱基相同，短横线表示碱基缺失，箭头所指
分别为上下游引物 Broa_U 和 Broa_L，Bro 代表华靛牛肝菌，Ba 代表卷边牛肝菌. 
Fig.  3  Localization  and  specificity  of  the  specific  ITS  primers  used  for  distinguishing  Boletus  roseoflavus  from  B. 
appendiculatus.  Dots  indicate  sequences  identity.  En  dashes  indicate  base  deletion.  The  upstream  and  downstream 
primers  (Broa_U  and  Broa_L)  are  indicated  by  arrows  in  the  sequence.  Bro  and  Ba  represent  B.  roseoflavus  and  B. 
appendiculatus, respectively.   
 
图 4  辨别华靛牛肝菌与华美牛肝菌的 ITS 特异引物位点      小圆点表示碱基相同，短横线表示碱基缺失，箭头所指
分别为上下游引物 Bros_U 和 Bros_L，Bro 代表华靛牛肝菌，Bs 代表华美牛肝菌. 
Fig. 4 Localization and specificity of the specific ITS primers used for distinguishing Boletus roseoflavus from B. speciosus. 
Dots indicate sequences identity. En dashes indicate base deletion. The upstream and downstream primers (Bros_U and 
Bros_L) are indicated by arrows in the sequence. Bro and Bs represent B. roseoflavus and B. speciosus, respectively. 
魏海龙 等 /牛肝菌属卷边组 Boletus sect. Appendiculati 物种的分子识别





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图 5  辨别拟桃红牛肝菌与华美牛肝菌的 ITS 特异引物位点      小圆点表示碱基相同，短横线表示碱基缺失，箭头所
指分别为上下游引物 Bps_U 和 Bps_L，Bp 代表拟桃红牛肝菌，Bs 代表华美牛肝菌. 
Fig.  5  Localization  and  specificity  of  the  specific  ITS  primers  used  for  distinguishing  Boletus  pseudoregius  from  B. 
speciosus. Dots  indicate  sequences  identity. En dashes  indicate base deletion. The upstream and downstream primers 
(Bps_U  and  Bps_L)  are  indicated  by  arrows  in  the  sequence.  Bp  and  Bs  represent  B.  pseudoregius  and  B.  speciosus, 
respectively. 
 
上述结果表明，我们基于牛肝菌属卷边组
各物种间的 ITS 序列差异设计的 5 对特异引物
可以用于 PCR 分子手段，在各自的最适退火温
度条件下扩增出完全不同的 ITS 图谱，进而可
以有效辨别卷边牛肝菌与亚卷边牛肝菌、卷边
牛肝菌与拟桃红牛肝菌、华靛牛肝菌与卷边牛
肝菌、华靛牛肝菌与华美牛肝菌、以及桃红牛
肝菌与华美牛肝菌。 
3 讨论 
牛肝菌属卷边组物种具有一些共同的形
态特征，对标本的辨别主要依赖于菌盖颜色和
变色反应的些许差异（Assyov  2012；Li  et  al. 
2013）。但仅凭并不显著的颜色差异来准确辨
别这些担子果形态高度相似的物种并不容易，
即使是同一物种在不同生长期，或处在不同生
境下，其担子果的颜色也可能存在细微或较大
变化，如在牛肝菌属牛肝菌组 Boletus  sect. 
Boletus Singer  中，美味牛肝菌 B. edulis Bull.、
铜色牛肝菌 B.  aereus  Bull.、网柄牛肝菌 B. 
reticulatus  Schaeff.、褐红牛肝菌 B.  pinophilus 
Pilát  &  Dermek 和分布于东亚的 10 余物种
（Dentinger et al. 2010；Feng et al. 2012）、橙
黄 鸡 油 菌 Cantharellus  cuticulatus  Corner.
（Eyssartier  et  al.  2009）、球盖光柄菇 Pluteus 
podospileus  Sacc  &  Cub（Takehashi  &  Kasuya 
2009）、色钉菇属 Chroogomphus 的易混色钉菇
C. confusus Yan C. Li & Zhu L. Yang、东方色钉菇
C. orientirutilus Yan C. Li & Zhu L. Yang 和淡红色
钉菇 C.  rutilus  (Schaeff.: Fr.) O.K. Mill.（Li et al. 
2009），以及红菇属 Russula 的一些物种如斑红
菇 R. maculata Quél & Roze、辛辣红菇 R. placita 
Burl.（Smith & Lebel 2001）等。由于存在大量
表型变异，使得像美味牛肝菌物种的错误鉴定
时有发生（Leonardi et al. 2005；Beugelsdijk et 
al. 2008）。 
 ISSN1672‐6472    CN11‐5180/Q    Mycosystema    March 15, 2014    Vol. 33    No. 2   
   
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250 
 
图 6  牛肝菌属卷边组物种的 ITS 特异引物扩增图谱      M：DNA 分子量标准；CK：PCR 反应对照；白色箭头所指为
目的条带；A 的 1–7：卷边牛肝菌标本 VDKO429、JR7012、AF1335、HDM7195、Van Holen B.22、HP8316 和 TENN20569，
8–10：亚卷边牛肝菌标本 Wu 19720、Wu4729 和  Wu18328；B：1–7：卷边牛肝菌标本 VDKO429、JR7012、AF1335、
HDM7195、Van Holen B.22、HP8316 和 TENN20569，8–12：拟桃红牛肝菌标本 Lachapelle 2266.01、VDKO585、VDKO431、
Omer Van de Kerckhove 925 和 VDKO504；C：1–7：卷边牛肝菌标本 VDKO429、JR7012、AF1335、HDM7195、Van Holen 
B.22、HP8316 和 TENN20569，8–13：华靛牛肝菌标本 HZFA07901、HZFA05801、HZFA09901、HKAS41720、HKAS41723
和 HKAS14707；D：1–6：华靛牛肝菌标本 HZFA07901、HZFA05801、HZFA09901、HKAS41720、HKAS41723 和 HKAS14707，
7–9：华美牛肝菌标本 TENN26581、TENN28301 和 TENN42159；E：1–3：华美牛肝菌标本 TENN26581、TENN28301
和 TENN42159，4–8：拟桃红牛肝菌标本 Lachapelle 2266.01、VDKO585、VDKO431、Omer Van de Kerckhove 925 和
VDKO504. 
Fig.  6  The  PCR  amplification  pattern  of  species  in  Boletus  sect.  Appendiculati with  the  specific  ITS  primers. M: DNA 
marker; CK: control; The white arrow shows the location of target band; A: 1–7: B. appendiculatus specimens VDKO429, 
JR7012, AF1335, HDM7195, Van Holen B.22, HP8316 and TENN20569, 8–10: B. subappendiculatus specimens Wu 19720, 
Wu4729  and Wu18328;  B:  1–7:  B.  appendiculatus  specimens  VDKO429,  JR7012, AF1335, HDM7195,  Van Holen  B.22, 
HP8316  and  TENN20569,  8–12:  B.  pseudoregius  specimens  Lachapelle  2266.01,  VDKO585,  VDKO431,  Omer  Van  de 
Kerckhove  925  and VDKO504; C:  1–7: B.  appendiculatus  specimens VDKO429,  JR7012, AF1335, HDM7195, Van Holen 
B.22, HP8316 and TENN20569, 8–13: Chinese B. roseoflavus specimens HZFA07901, HZFA05801, HZFA09901, HKAS41720, 
HKAS41723  and  HKAS14707;  D:  1–6:  B.  roseoflavus  specimens  HZFA07901,  HZFA05801,  HZFA09901,  HKAS41720, 
HKAS41723 and HKAS14707, 7–9: B. speciosus specimens TENN26581, TENN28301 and TENN42159; E: 1–3: B. speciosus 
specimens  TENN26581,  TENN28301  and  TENN42159,  4–8:  B.  pseudoregius  specimens  Lachapelle  2266.01,  VDKO585, 
VDKO431, Omer Van de Kerckhove 925 and VDKO504. 
魏海龙 等 /牛肝菌属卷边组 Boletus sect. Appendiculati 物种的分子识别





菌物学报
251 
分子生物学技术对真菌分类与鉴别带来
了革命性的变革（Yang  2011）。基于核糖体基
因 rRNA 的 ITS 序列间的碱基差异建立的 PCR
分子手段已被广泛用于牛肝菌属内不同物种
的辨别，尤其是对牛肝菌属牛肝菌组内的美味
牛肝菌与其他成员如铜色牛肝菌、褐红牛肝菌
和夏生牛肝菌 B. aestivalis  (Paulet) Fr.的辨别研
究较多。例如，Leonardi et al.（2005）利用内
切酶 AluⅠ对 ITS 片段的 PCR/RFLP 分析完成了
美味牛肝菌、褐红牛肝菌、铜色牛肝菌和夏生
牛肝菌的分子辨别；Mello et al.（2006）根据
ITS 序列设计特异引物，实现了美味牛肝菌、
铜色牛肝菌、褐红牛肝菌和夏生牛肝菌的分子
辨别，为牛肝菌属牛肝菌组物种的准确界定和
欧洲蘑菇市场上美味牛肝菌种的真伪辨别提
供了分子手段。此外，Moor  et  al.（2002）基
于 ITS 序列建立的多重 PCR（Multiplex PCR）检
测手段用于美味牛肝菌种与乳牛肝菌 Suillus一
些物种的分子辨别。Lian et al.（2008）基于 ITS
序列设计的特异引物成功用于了中国“美味
牛肝菌”与其他蘑菇种的分子辨别。但迄今为
止，对牛肝菌属卷边组内物种的分子辨别目前
尚属空白。 
在本研究中，牛肝菌属卷边组内卷边牛肝
菌、亚卷边牛肝菌、拟桃红牛肝菌、桃红牛肝
菌、费氏牛肝菌、华靛牛肝菌以及华美牛肝菌
的 ITS区段长度分别为 405–455bp、541–543bp、
528–547bp、533–534bp、516–517bp、536–552bp
和 510bp，这些相似物种种间的 ITS 区段长度
差异仅为几个、几十个碱基，从常规的 PCR 凝
胶电泳结果难以准确分辨，如进一步克隆测序
不仅费时，而且将增加较大的工作量。我们基
于 ITS 序列比对进一步设计的特异引物进行
PCR 扩增，使得这些相似物种种间的 ITS 区段
差异可以直接表现为特异扩增条带的有无，因
而可非常便捷地用于这些相似物种的快速分
子识别，不仅为牛肝菌属卷边组内 7 个物种的
准确界定提供了分子依据，也为基于形态特征
辨别标本提供了有效的辅助手段。   
在牛肝菌属卷边组内的 7 个物种中，桃红
牛肝菌与华靛牛肝菌在菌盖颜色和变色反应
上的差异较小，二者区别主要在于菌孔受伤
后，桃红牛肝菌不变蓝，而华靛牛肝菌立刻变
蓝。但由于桃红牛肝菌与华靛牛肝菌的 ITS 序
列差异很小，所以难以设计特异引物进行有效
辨别。另外，该组内的费氏牛肝菌菌盖呈银灰
色、灰色、白色，很易于与其他牛肝菌物种进
行辨别，所以本研究没有考虑进行费氏牛肝菌
与其他牛肝菌物种的分子识别。此外，在本研
究基础上，进一步利用多重 PCR技术将几对 ITS
特异引物整合使用，实现一次 PCR 反应可以同
时辨别卷边牛肝菌、华靛牛肝菌与其他牛肝菌
物种也是今后值得尝试的技术思路。 
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