全 文 ：铜色牛肝菌活性胞外多糖的发酵优化研究
许春平1，刘远上1，李萌姗1，赵姗姗1，史超文2
（1.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州 450002，2.河南农业大学生命科学学院，
河南郑州 450002）
摘 要：选择发酵液中的胞外多糖含量为生物指标，对其进行培养基（碳源、氮源、无机盐）和环境条件（pH、温度）的
优化，最后确定了蔗糖 50 g/L，酵母粉 5 g/L的最优培养基和温度=25℃，pH=6的最优培养条件；用优化后的条件通过
5 L式发酵罐发酵培养铜色牛肝菌，5天后胞外多糖产量达 1.84 g/L。胞外多糖经除蛋白后，通过 ABTS、DPPH、临二氮
菲法测其抗氧化性，结果表明其胞外多糖具有很好的抗氧化能力。
关键词：铜色牛肝菌；胞外多糖；液体发酵；优化；抗氧化
Optimization of Active Exopolysaccharides Production by Submerged Culture of Boletus Aereus
XU Chun-ping1，LIU Yuan-shang1，LI Meng-shan1，ZHAO Shan-shan1，SHI Chao-wen2
（1. College of Food and Biological Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，
Henan，China；2. College of Life Science，Henan Agricultural University Zhengzhou 450002，Henan，China）
Abstract：In this paper， optimization of liquid culture medium components （carbon and nitrogen sources，
mineral salt） and fermentation condition （pH and temperature）to produce exopolysaccharides （EPS） was
carried out. The optimum medium was sucrose 50 g/L， yeast extract 5 g/L， temperature 25℃， with initial pH at
6. Under the optimized culture conditions in a 5-L stirred-tank reactor， the EPS was obtained upto 1.84 g/L at 5 d.
After after removing protein， the antioxidant activity of EPS was measured by ABTS， DPPH， phenanthroline
method. The results showed that the EPS has good antioxidant capacity.
Key words：Boletus aereus； exopolysaccharides； liquid fermentation； optimization； antioxidant
基金项目：国家教育部国际合作与交流司“留学人员回国科研启动
基金”教外司留[2012]940
作者简介：许春平（1977—），男（汉），教授，博士，研究方向：生物化工
和烟草工程。
食品研究与开发
Food Research And Development
2015年 2月
第 36卷第 3期
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.033
铜色牛肝菌（Boletus aereus Fr. ex Bull）伞菌目、牛
肝菌科、牛肝菌属，夏秋季生于栎等林中地上，可以食
用，味道好，是一种食药用真菌，属于外生菌根菌。但
是不能人工栽培，可用菌丝体进行深层发酵培养[1]。
食药用真菌具有有抗氧化、抗肿瘤、降血压、降血
糖、抗病毒等功效，而这些功效的发挥与真菌多糖有
着密切的关系[2]。真菌多糖是由 10个以上的单糖通过
糖苷键连接而成的高分子多聚物，具有复杂的生物活
性和功能[3]，可提高免疫力调节身体的各项机能[4]。真
菌多糖分为胞内多糖和胞外多糖，胞外多糖主要从发
酵液中提取，因为液体发酵可以实现大规模生产多
糖，生产周期短，操作简单等优点，现在工业化生产多
糖大多采用液体发酵法[5-7]，尤其是铜色牛肝菌，只能
通过液体深层发酵获得大量多糖。
本文主要是对铜色牛肝菌深层发酵培养基和环
境条件进行优化，为工业化生产铜色牛肝菌多糖提供
理论依据，并且通过临二氮菲法、DPPH法、ABTS法测
定铜色牛肝菌胞外多糖的抗氧化性，探索其对各种自
由基的清除能力。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种
铜色牛肝菌菌种来自于河南省生物菌种保藏
中心。
1.1.2 培养基
PDA培养基（马铃薯 25%，葡萄糖 1%，琼脂 1.5%~
2.0 %），液体种子培养基（葡萄糖 3 %，蛋白胨 0.3 %）。
生物工程
129
1.1.3 试剂
乙醇、浓硫酸、DPPH、邻二氮菲、1.5 %过氧化氢、
FeSO4均为分析纯；ABTS试剂盒：碧云天生物技术研
究所。
1.1.4 仪器
JYT-5 QYC200恒温振荡摇床：上海福玛实验设备
有限公司；5L搅拌式真菌发酵罐：上海百伦科技有限
公司；METTLER 4E200电子分析天平：上海沛欧分析
仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发器：上海亚荣生化仪
器厂；CF16RXⅡ日立离心机：日本HITACHI；UV-17001C
紫外分光光度计：上海凤凰光学科仪有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 菌种活化
将保存于试管斜面培养基中的铜色牛肝菌菌丝
块接种于 PDA平板培养基上，26℃下培养 7 d[8]。
1.2.2 液体种子培养
用打孔器打取活化好的 PDA铜色牛肝菌丝块（约
1 cm2）两块接入含 50 mL种子培养基的 250 mL三角
瓶中，置于于 26℃ 160 r/min恒温振荡摇床中培养 4 d。
然后加入灭过菌的玻璃珠置于磁力搅拌器上将菌丝
块打碎后备用。
1.2.3 葡萄糖标准曲线的测定
精密称取 105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品 1 g，
溶解稀释后定容到 100 mL容量瓶中，配成 10 mg/mL
的葡萄糖贮备液，精密吸取贮备液 1mL定容至 100mL，
配成 0.1 mg/mL的葡萄糖标准液。精密移取葡萄糖标
准液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μL，于 25 mL具塞刻度
试管中，加蒸馏水至 1.0 mL，再各加 5 %苯酚溶液 1 mL
摇匀，迅速加入浓硫酸溶液 5 mL，放在振荡器上震荡
均匀，置沸水浴中加热 15 min，取出再置于冰水中
15 min，用紫外分光光度计于 490 nm，以蒸馏水代替
葡萄糖溶液作为对照测定吸光值。
1.2.4 单因素实验
探究不同碳源、氮源、无机盐、pH、温度对铜色牛
肝菌胞外多糖含量的影响，基础培养基为 3 %葡萄糖，
0.3 %蛋白胨，每组实验设 3个平行试验，培养时间为
8 d，摇床转速为 160 r/min，接种量为 4 %，pH=5。碳源
选用的是 3 %的葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、木糖、乳
糖；氮源选用的是 0.3 %的牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、大
豆粉、磷酸铵、硝酸钾；无机盐选用的是 FeSO4、MnCl2、
MgSO4、CaCl2、K2HPO4和空白对照（3 %葡萄糖，0.3 %蛋
白胨）；pH=3、4、5、6、7、8、9；温度=20、25、28、30℃。
1.2.5 碳源浓度和 C/N比实验
在单因素实验基础上，探究碳源浓度和碳氮比对
铜色牛肝菌胞外多糖含量的影响。碳源浓度分别为 1%、
2 %、3 %、4 %、5 %、6 %；碳氮比分别为 1 ∶ 1、10 ∶ 1、20 ∶
1、30 ∶ 1。每组实验设 3个平行试验，培养时间为 8 d，
摇床转速为 160 r/min。
1.2.6 菌丝干重的称量和胞外多糖含量的测定
用抽滤法[9]将菌丝和发酵液分离，将滤纸和菌丝
置于 70℃的烘箱至干燥后称量，再除去滤纸干重即为
菌丝干重。
菌体含量（g/L）=菌丝干重（g）/发酵液体积（mL）×
1 000
把发酵液浓缩后加入 4倍乙醇，置于 4℃冰箱过
夜处理，第 2天把处理液放在转速为 10 000 r/min离
心机中离心 10 min后弃去上清，用蒸馏水溶解沉淀定
容至 250 mL，然后用苯酚硫酸法[10]测发酵液中的多糖
含量。
1.2.7 铜色牛肝菌在发酵罐中的培养
根据单因素优化和交互作用实验确定的培养基
配方配制 3 L 于 5 L 发酵罐中，接种量 4 %，通气量
2 vvm，搅拌速度 160 r/min，培养 8 d，然后将发酵液浓
缩后醇沉[11]出胞外多糖冷冻干燥以备后用。
1.2.8 胞外多糖的抗氧化作用
ABTS 法测定铜色牛肝菌胞外多糖的总抗氧化
力。ABTS在一定的氧化剂作用下可以氧化成绿色的
ABTS，当有抗氧化物存在时 ABTS 的氧化就会被抑
制，在 734 nm或 405 nm测定 ABTS的吸光度即可测
定并计算出样品的总抗氧化能力[12]。Trolox是一种维
生素 E的类似物，具有和维生素 E相近的抗氧化能
力，可以作为其它抗氧化物总抗氧化能力的参照物。
DPPH法测定胞外多糖对 DPPH的清除率。DPPH
在有机溶剂中是一种稳定的自由基，有自由基清除剂
存在时，DPPH的单电子被捕捉而使其颜色变浅，在最
大光吸收波长处的吸光值下降，且下降程度呈线性关
系，吸光度水平的降低表明抗氧化性的增加，从而可
以计算出样品的抗氧化能力[13]。
临二氮菲法测定胞外多糖对·OH的清除率[14]，以
前是利用邻二氮菲可与 Fe2+生成橙红色有色物用来检
测样品中 Fe2+的方法。由于 H2O2在 Fe2+的催化作用下
生成具有高反应活性的羟基自由基（Fenton反应）能够
氧化反应体系中的 Fe2+，因此出现了用来检测 Fenton
反应产生羟自由基的邻二氮菲法。
2 结果分析
2.1 葡萄糖标准曲线的绘制
以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制
许春平，等：铜色牛肝菌活性胞外多糖的发酵优化研究 生物工程
130
标准曲线，如图 1所示。
2.2 碳源、氮源、无机盐对多糖含量的影响
碳源、氮源、无机盐对多糖含量的影响见表 1。
由表 1分析可知，蔗糖＞麦芽糖＞葡萄糖＞果糖=
乳糖＞木糖，麦芽糖和蔗糖作为碳源都能获得较高的
多糖含量，但是在工业化生产中，蔗糖的成本更低，而
且能产得更多的菌丝，所以选择蔗糖作为最优碳源，
葡萄糖、果糖、乳糖、木糖作为碳源，胞外多糖含量比
较接近。
在氮源的优化过程中，可以观察到，铜色牛肝菌
在有机氮源的培养基中生长很好，在无机氮源的培养
基中生长很慢并且菌丝很少，说明铜色牛肝菌不能很
好的利用无机氮源。而在有机氮源中富含各种氨基
酸，这些氨基酸可以直接被菌丝吸收加以利用，因此
利用这种氮源时，菌丝生长较快，胞外多糖产量相对
较高[15]。无论是选择发酵液中的胞外多糖含量还是菌丝
含量作为生物指标，都应该选酵母粉作为最适氮源。
无机盐的加入并没有提高铜色牛肝菌胞外多糖
的产量，所以在实验中不再添加无机盐。
2.3 环境条件对胞外多糖含量的影响
2.3.1 初始 pH对胞外多糖含量的影响
以液体种子培养基为基础培养基，其他条件保持
不变，培养基 pH分别为 3、4、5、6、7、8、9，确定最适
pH。结果如图 2（A）所示，铜色牛肝菌在 pH =3-9都能
生长，最适 pH为 6。
2.3.2 培养温度对胞外多糖含量的影响
以液体种子培养基为基础培养基，初始 pH=5，其
它条件不变，温度分别为 20、25、28、30 ℃，结果如图 2
（B）所示，温度为 25℃时菌丝含量和多糖含量都是最
高，而其它 3个温度差异不明显。
2.4 不同碳源浓度和碳氮比对胞外多糖含量的影响
改变碳源浓度，其它条件不变，每组实验设 3个
平行实验，结果见图 3和图 4。
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
-0.2
0 0.02 0.120.04 0.06 0.08 0.10
y = 8.59x-0.002 7
R2 = 0.996 7
图 1 葡萄糖标准曲线图
Fig.1 Glucose standard curve graph
表 1 不同碳源、氮源、无机盐对铜色牛肝菌菌丝含量和胞外多糖含
量的影响 *
Table 1 Effect of carbon，nitrogen and mineral source on mycelial
growth and EPS production by B.aereus in shake flask cultures*
项目 菌丝含量/（g/L） 多糖含量/（g/L） 最终 pH
碳源（3 %）
葡萄糖 2.115±0.025 1.047±0.036 3.97
果糖 2.000±0.053 1.034±0.054 4.05
麦芽糖 0.955±0.048 1.310±0.047 4.53
蔗糖 1.805±0.032 1.372±0.063 4.33
木糖 0.574±0.074 0.938±0.069 4.68
乳糖 0.745±0.024 1.034±0.042 4.73
氮源（0.3 %）
牛肉膏 3.840±0.048 1.076±0.016 4.74
酵母粉 8.625±0.063 1.432±0.027 4.37
蛋白胨 2.565±0.048 1.034±0.031 4.83
大豆粉 6.005±0.058 1.053±0.042 4.36
硝酸钾 0.525±0.054 0.724±0.036 4.27
硫酸铵 0.489±0.047 0.753±0.033 4.13
无机盐（5×10-3 mol/L）
对照 3.060±0.025 1.136±0.025 4.25
K2HPO4 4.380±0.046 1.013±0.016 4.21
MgSO4 3.090±0.073 0.680±0.037 4.13
CaCl2 3.273±0.053 0.845±0.042 4.26
MnCl2 2.913±0.042 0.475±0.063 4.32
FeSO4 2.140±0.037 0.647±0.025 4.05
注：*发酵条件：在 26℃条件下培养 8天，pH=5。
图 2 不同 pH和温度条件对铜色牛肝菌菌丝含量和胞外多糖含量
的影响
Fig.2 Effect of pH and temperature on mycelial growth and EPS
production by B.aereus in shake flask cultures
5
4
3
2
1
0
菌
丝
干
重
/（
g/
L）
3 4
pH
5 6 7 8 9
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
多
糖
含
量
/（
g/
L）
20 25
温度/℃
28 30
（A） （B）菌丝干重
胞外多糖含量
菌丝干重
胞外多糖含量
12
10
8
6
4
2
0
菌
丝
干
重
/（
g/
L）
1 2 6
碳源浓度/%
3 4 5
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
多
糖
含
量
/（
g/
L）
图 3 不同碳源浓度对铜色牛肝菌菌丝含量和胞外多糖含量的影响
Fig.3 Effect of Carbon concentration on the mycelial growth and
EPS production by B.aereus
许春平，等：铜色牛肝菌活性胞外多糖的发酵优化研究生物工程
131
由图 3分析可知，质量分数 5 %的蔗糖试验组的
菌丝含量和胞外多糖含量最高，而质量分数 1 %、2 %、
3 %、4 %的蔗糖试验组碳源不足，菌丝体干重和胞内
外多糖含量较低；质量分数 6 %的碳源存在时，则抑
制菌丝的生长和胞外多糖的合成。所以，质量分数 5 %
为最适碳源浓度。
图 4为不同的碳氮比对铜色牛肝菌菌丝含量和
胞外多糖的影响，蔗糖与酵母粉比例达到 10：1时，菌
丝含量和胞外多糖含量都达到最高水平。正如 Yuan
et al的实验结果，赤芝的碳氮比也是 10 ∶ 1[16]。综上所
述，最适碳源及浓度为蔗糖：50 g/L，最适氮源及浓度为
5 g/L。
2.5 铜色牛肝菌发酵罐实验
发酵时间与 pH、菌丝干重、残糖和 EPS产量等指
标的相关变化情况见图 5。
由图 5分析可知，发酵液 EPS含量从接种首日开
始就逐渐升高，在第 5天达到最大值（1.84 g/L），此后
含量趋向平稳。而菌丝干重随时间的增加而快速升
高，在第 3天达到最大值，随后降低。残糖含量在发酵
过程中不断减少，但 pH变化不是很明显。
2.6 铜色牛肝菌胞外多糖抗氧化性研究
如图 6（A）所示，总抗氧化力随着多糖浓度的增加
而增大，呈现一定的相关性，最后当胞外多糖浓度到
10 g/L时，其总抗氧化力与 0.171 mM Trolox相等，同
样，铜色牛肝菌胞外多糖清除 DPPH和·OH自由基的
能力都随着多糖浓度的增大而增强，如图 6（B），多糖
浓度由 6 g/L到 8 g/L的斜率明显大于 2 g/L到 6 g/L的
斜率，当多糖浓度为 10 g/L时，，清除 DPPH自由基高
达 62.23 %。并且清除·OH自由基能力也随着多糖浓
度的增加而逐渐增强，如图 6（C）所示，最高清除率达
12
10
8
6
4
2
0
菌
丝
干
重
/（
g/
L）
1∶1 30∶1
碳氮比
10∶1 20∶1
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
多
糖
含
量
/（
g/
L）
图 4 不同的碳氮比对铜色牛肝菌菌丝含量和胞外多糖的影响
Fig.4 Effect of C/N ratio on the mycelial growth and EPS
production by B.aereus
8
7
6
5
4
3
2
1
菌
丝
干
重
/（
g/
L）
0 2 8
培养时间/d
4 6
60
50
40
30
20
10
0
残
糖
含
量
/（
g/
L）
7
6
5
4
3
2
1
pH
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
残
糖
含
量
/（
g/
L）
图 5 利用 5L发酵罐发酵过程中菌丝干重、胞外多糖、pH和残糖
随时间的变化图
Fig.5 Time course of the mycelial growth，EPS production，pH
and residual glucose in 5-L stirred-tank bioreactor.
0.20
0.15
0.10
0.05
0
总
抗
氧
化
力
/%
0 2 12
浓度/（g/L）
4 6 8 10
（A）
70
60
50
40
30
20
10
0
DP
PH
清
除
率
/%
0 2 12
浓度/（g/L）
4 6 8 10
（B）
自
由
基
清
除
率
/%
0 2 12
浓度/（g/L）
4 6 8 10
（C）
70
60
50
40
30
20
10
0
图 6 铜色牛肝菌胞外多糖抗氧化效果图
Fig.6 Antioxidant activity of B.aereus polysaccharides.
许春平，等：铜色牛肝菌活性胞外多糖的发酵优化研究 生物工程
132
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详见中国天津食品网
（www.tjfood.com.cn）
到 61.37 %。结果表明铜色牛肝菌胞外多糖具有很好
的抗氧化能力，这种能力是因为其分子中有大量的羧
基（-COOH）、羰基（C=O）、醚基（-O-）以及其它基团。
这些基团与自由基发生反应时可以提供电子使自由
基以一种更稳定的形式存在，或者使自由基引起的链
式反应停止[12]。
3 结语
本实验以胞外多糖含量为指标，对铜色牛肝菌的
发酵培养基进行优化，最适培养基为：蔗糖 50 g/L，酵
母粉 5 g/L，pH=6，温度 25℃。将优化结果应用于 5 L
式发酵罐，培养 8 d后处理发酵液得到胞外多糖，然后
通过 ABTS、DPPH、临二氮菲法测其抗氧化性，结果表
明铜色牛肝菌胞外多糖具有很好的抗氧化能力。
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收稿日期：2013-07-15
许春平，等：铜色牛肝菌活性胞外多糖的发酵优化研究生物工程
133