全 文 ：JILIN AGRICULTURAL 71
2011年第03期
（总第253期）
吉 林 农 业
JILIN AGRICULTURAL
NO.03，2011
（CumulativetyNO.253）
美味牛肝菌，夏秋季与林地上单生或散生，分布广泛，味鲜
美，可食用，可药用，属优良的野生食药用真菌，与多种树木形
成外生菌根。目前不能人工子实体栽培，其市场价格不菲，但目
前对其研究很有限。
原生质体育种技术是最近几年发展起来的细胞工程育种新技
术，这为珍惜是药用真菌的人工栽培开辟了新的育种途径，试验
通过对美味牛肝菌原生质体制备的条件进行优化，使美味牛肝菌
原生质体制备数目达到一个较高水平，为原生质体融合和转基因
研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 供试菌种
美味牛肝菌菌种有吉林农业科技学院食用菌研究所惠赠。
1.2 供试材料
1.2.1 实验试剂 蔗糖，甘露醇，MgSO4，KH2PO4，蜗牛酶，纤维素
酶，葡萄糖，蛋白胨，琼脂，维生素B1，马铃薯。
1.2.2 培养基 PDA培养基；再生培养基：马铃薯综合培养基（一
号），MYG培养基（二号），加富PDA培养基（三号）。
1.2.3 试剂的配制 用三重无菌水配制0.6mol/L MgSO4和0.6mol/L
甘露醇；酶液的配制：称取蜗牛酶，纤维素酶用0.6mol/L MgSO4
溶解制的混合酶液，经0.22um的滤膜过滤除菌。
1.3 试验方法
1.3.1 菌丝体培养 把保藏菌种复壮扩繁，28℃、180r/min液体
培培养1-6d，将培养好的菌丝体置于无菌擦镜纸上，过滤，无菌
水，渗透压稳定剂各冲洗2次，称重，按每100mg湿菌丝体加1ml混
合酶液，酶解一定时间，用血球计数板计算原生质体的数目，用
4层无菌擦镜纸过滤酶解液，将滤液3000r/min离心10min，沉淀
用渗透压稳定剂洗涤2次，得纯化原生质体悬浮于0.6mol/LMgSO4
中，用血球计数板计数。
1.3.2 原生质体的再生 把在不同实验条件下制备得到的原生质
体，接种到再生培养基中，28℃培养观察原生质体的再生情况，
原生质体的再生率采用平皿菌落计数法计算。
2 原生质体制备优化及再生条件的选择
采用L9(34)正交试验法，筛选制备美味牛肝菌原生质体的优
化条件组合；选择原生质体制备率最高的原生质体接种到不同的
再生培养基上，计算菌落的再生率，从而确定原生质体再生率最
高的培养基。
2.1 原生质体制备实验条件的选择
酶解时间：2.5h，3.0 h ，4.0 h三个酶解时间；酶解温度：
设置30℃、32℃、34℃三种的酶解温度进行试验；菌龄选择：分
别选用3-5d菌龄；混合酶浓度：设置0.5%L+0.5%S，1%L+1%S，
1.5%L+1.5%S 三个混合酶浓度进行试验（L:纤维素，S:蜗牛
酶）。
2.2 再生条件
实验设置三种不同的再生培养基，分别是马铃薯综合培养
基，MYG培养基，加富PDA培养基。
3 结果分析
3.1 原生质体制备优化条件正交试验结果
根据设置的实验条件，将酶解得渗透压稳定剂选为0.6mol/
L的MgSO4，选择4个因素的三个水平作为制备原生质体的实验条件
进行L9(34)正交试验。
表1 正交试验结果 L9(34)
3.2 正交结果分析
3.2.1 原生质体制备的实验结果 分析上表R值，RC>RD>RB>RA，
可知影响美味牛肝菌原生质体制备率的因素依次为：菌龄、酶解
时间、酶解温度、混合酶的浓度；制备率最高的试验条件组合为
A2B1C2D3。
3.2.2 原生质体再生能力的试验结果 用正交试验中原生质体制
备率最高的试验4号制得的原生质体接种到一号、二号、三号培
养基中，结果4-5d后平皿上开始出现菌落，成星芒状。原生质体
在各培养基冲再生率：一号再生培养基上4.1%，二号再生培养基
2.8%，三号再生培养基上最高为6.9%，分析3种再生培养基上原生
质体的再生率和配方，可知，营养较丰富的培养基上原生质体的
再生率较高。
综合以上试验结果可知，美味牛肝菌原生质体制备条件的优
化组合为A2B1C2D3，菌龄为4d，酶解温度温度为30℃，酶解时间
为4h，混合酶浓度为1%纤维素酶+1%蜗牛酶；美味牛肝菌原生质体
再生率较高的培养基为加富PDA培养基。
美味牛肝菌原生质体的制备条件及再生能力的研究
刘金坡，董长颖，刘苍龙，段盼盼
（吉林农业科技学院，吉林 吉林 132101）
摘要：采用正交试验法探究美味牛肝菌原生质体制备条件，进一步研究其原生质体的再生能力，筛选出制备原生质的条
件组合为：酶解时间：3h，混合酶浓度：1%纤维素酶+1%蜗牛酶，酶解温度：30℃，菌龄：4d；在原生质体制备率最高的条
件下得出较高再生率的培养基为加富PDA培养基。
关键词：美味牛肝菌；原生质体；再生能力
中图分类号：Q81 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2011）-03-0071-1
验号 A B C D 原生质体（×106个/ml）
1 0.5%L+0.5%S 30℃ 3 d 2.5 h 0.65
2 0.5%L+0.5%S 32℃ 4 d 3.0 h 3.12
3 0.5%L+0.5%S 34℃ 5 d 4.0 h 3.40
4 1%L+1%S 30℃ 4 d 4.0 h 3.94
5 1%L+1%S 32℃ 5 d 2.5 h 3.20
6 1%L+1%S 34℃ 3 d 3.0 h 1.20
7 1.5%L+1.5%S 34℃ 4 d 3.0 h 1.80
8 1.5%L+1.5%S 32℃ 3 d 4.0 h 2.80
9 1.5%L+1.5%S 34℃ 4 d 2.5 h 2.30
K1 2.39 2.13 1.55 1.72
K2 2.45 2.71 3.12 2.04
K3 2.30 2.47 2.47 3.05
R 0.15 0.58 1.57 1.33