全 文 ：　　　　 天然产物研究与开发　 　　　　　
　　　　　　　　　　 NATU RAL PRODUCT RESEARCH AND DEVELOPMENT　 2003　Vo1.15　No.4
　
　
　
　
　　收稿日期:2002-09-11　　　修回日期:2002-10-29
　　＊通信联系人(Corresponding author)。中国科学院武汉植物研
究所 ,长期从事植物次生代谢产物研究。
新疆紫草细胞生产阶段培养中细胞生长
及产物合成的研究 Ⅰ :悬浮培养
康强胜　李洪林　吴玉兰　卢大炎＊
(中国科学院武汉植物研究所　武汉　430074)
摘　要　新疆紫草细胞生产阶段培养时生物产量随接种量的增加而增大 , 但生物量的倍增数并不增大。
色素产量只在一定范围内与接种量成正相关关系 ,超过一定范围反而下降。当选定适当接种量时 , 加大
培养基的浓度可提高色素产率。扩大培养规模 ,色素产量下降 。
关键词　新疆紫草;悬浮培养;紫草色素
　　新疆紫草(Arnebia euchroma)是我国传统药用
紫草类植物中临床药效最好的一种 ,分布于新疆及
西藏等地。其主要有效成分为紫草宁及其衍生物 ,
这些化合物具有显著的抗菌 、消炎 、抗生育 、抗癌及
促进伤口愈合等生理活性 ,同时作为色素广泛用于
化妆品及食品中[ 1 ,2] 。新疆紫草野生资源较少 ,难
于人工驯化培养 ,大量采挖势必造成资源枯竭及生
态环境的破坏。借助植物细胞大量培养技术可按实
际需求定时定量进行生产 ,这样既可摆脱季节及资
源数量上的限制 ,也可避免由于过量采伐造成的生
态环境的破坏。
采用新疆紫草细胞培养生产紫草宁及其衍生物
的研究已做过许多工作。其中李国凤等首先诱导出
新疆紫草的愈伤组织 ,同时鉴定出愈伤组织中含有
同原植物一致的色素成分[ 3] 。叶和春等研究了不
同理化因子对新疆紫草细胞生长及色素合成的影
响 ,建立了高效的二步培养系统[ 4] 。陈士云等采用
气升或反应器进行培养 ,研究了逐级放大对细胞生
长及色素合成的影响[ 5] 。
采用二步培养法 ,在生产阶段接种量相当大 ,约
为生长阶段接种量的 2 ～ 6倍 。接种量的多少势必
影响生物产量及色素产率。实际上 Tabata 等的研
究表明 ,在硬紫草(Lithospermum erythrorhizon)细
胞悬浮培养的第二阶段 ,接种量增大时 ,色素产量下
降 ,若同时加大培养基的浓度和供氧量 ,可显著提高
色素产量[ 8] 。接种量对新疆紫草细胞悬浮培养时
合成色素的影响 ,到目前为止 ,还未见报道 。本文就
接种量及培养基浓度对新疆紫草细胞生长及色素合
成的影响进行了研究 ,其结果为反应器培养时提供
参考。
1　材料和方法
1.1　细胞培养
用于实验的新疆紫草细胞为我室长期继代保存
的未经筛选的愈伤组织。用 AG-7 培养基进行新疆
紫草细胞的继代保种及生长阶段的培养[ 4] 。保种
时 20天继代一次。悬浮培养时挑选生长旺盛的愈
伤组织接种于装有 90 ml培养液的 250 ml锥瓶中
进行培养(接种量为5 g 鲜重),12天继代一次 ,每次
继代时用消毒过的蒸馏水进行冲洗。取悬浮培养第
3 ～ 4代的细胞进行生产阶段培养[ 5] ,培养时间 20 ～
30天 ,培养基为 M 9或 2＊M 9 及 3＊M9 。2＊M9 和
3＊M9 中成分与 M9 相同 ,只是除激素和蔗糖外 ,各
组份用量加倍 。2＊M9 为 M 9中各组份用量加一倍
而成 。3＊M9 中各组份用量则为 M 9 的三倍 。根据
方德秋等的研究结果[ 7] , 2＊M9 及 3＊M 9中激素浓
度同 M9 ,蔗糖用量在 2＊M 9 中为 4%, 3＊M9 中为
6%。接种子生产培养基前将所有细胞在 2升锥瓶
中混合并用消毒过的蒸馏水冲洗 ,然后接种于装有
100 ml培养基的 250 ml锥瓶中 ,或装有 200 ml培
养基的 500 m l锥瓶中进行培养。继代保种 ,生长及
生产阶段培养都在黑暗条件下进行 , 温度 22 ～
25℃,悬浮培养时摇床转速为 120 r/min。
1.2　细胞生长及培养液中 pH 的测定
悬浮培养时每隔 3天左右取样一次 ,40 目不锈
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钢网过滤后直接称鲜重 ,然后于 60℃下烘干至恒
重 ,称干重。用 pH-2S 型数显酸度计测滤液中的
pH值 。
1.3　紫草宁及其衍生物含量的测定
将烘干的培养物磨碎后反复用低沸程石油醚冷
浸提取至无色 ,合并浸提液定容后用 7520型分光光
度计在λ=520 nm 处测吸光值 ,根据标准曲线计算
色素含量。滤液中色素用低沸程石油醚冷浸萃取 ,
然后同上测定色素含量。
2　结果与讨论
2.1　接种量的大小对生物产量及色素合成的影响
图1是 5 种不同接种量的细胞接种于 100 ml
M 9 培养液中培养 20天的结果 ,可以看出 ,生物产量
随着接种量的增加而增大 ,但生物量的倍增数却呈
下降趋势 。一般而言 ,加大接种量可提高生物产量 ,
但由于一定量的培养液只能提供有限的营养成分 ,
所以实验中随着接种量的增大 ,净增生物量却并不
增加。接种量对色素的合成同样有一定影响 ,在 10
～ 25克鲜重/瓶接种量范围内 ,色素产量随接种量
的加大而增加 ,大约可增加 57%,当接种量提高到
30克鲜重/瓶时 ,色素产量下降。说明在一定的范
围内增大接种量可有效地提高色素的产率。
图 1　不同接种量对新疆紫草细胞生物及色素合成的影响
Fig.1　Effects of amounts of inoculum on cell g rowth and
shikonin derivatives formation o f A.euchroma
2.2　培养基浓度加倍后新疆紫草细胞的生长及色
素的合成
根据上述的实验结果 ,选择 20克鲜重/瓶及 25
克鲜重/瓶两种接种量 ,接种于装有 100 ml 2＊M9
培养基的 250 ml瓶瓶中 。实验结果见图 2及图 3。
从培养基加倍后整个培养的动态过程看 ,与用 M9
培养相同 ,色素合成的高峰仍出现在细胞生长的高
峰之后[ 9] ;但在生物量的倍增数 、色素产量及整个
培养过程的动态变化等方面同在 M 9中培养相比则
有较大差异。首先 ,在生物量的倍增数及色素产量
上 ,20克接种量时 ,第 21天收获时的倍增数为 1.08
(第 19天最高 ,为 1.20),色产量为 90.42毫克/瓶
(其中培养基中含量为 2.1 毫克)。接种量为 25克
时 ,第 20天收获时的倍增数为 1.07(第 18天最高 ,
为 1.17),色素产量为 103.495 毫克/瓶(培养基中
含量为 4.48毫克)。同在 M9 中培养相比 ,生物量
的倍增数有所下降 ,色素产量则有一定的提高。其
次 ,整个培养过程的动态变化上 ,培养基浓度加倍
后 ,细胞的生长曲线不象在 M9 中培养那样呈 S
形[ 9] ,而是有一明显的下降点(以下简称 K 点),细
胞生长曲线也呈不规则的 M 形。也就是说 ,培养基
浓度提高后 ,培养的新疆紫草细胞有两次增殖期。
在 K点后细胞的色素含量及培养液的 pH 值有一明
显的下降 ,这在用 M9 培养时是不明显的[ 9] 。至于
出现 K点的原因 ,很大程度上是由于细胞生长受到
抑制 ,以及细胞受到损伤和细胞死亡造成的[ 6] 。具
体表现在生物量的下降 ,培养液酸度增加 。根据实
际的观察 ,培养的新疆紫草细胞基本上以致密的直
径在 1 毫米左右的细胞聚合体的形式存在。实际
上 ,我们在继代时 ,通过冲洗 ,已将绝大部分单细胞
及较小的细胞聚合体去掉 ,因为它们影响继代的代
数[ 5] 。培养基浓度增大后 ,在培养的中早期造成细
胞聚合体外表细胞的死亡 、脱落与分解[ 6] ,造成了
生物量的下降 。之后培养细胞又进入增殖期 ,生物
量随之增加。K 点后色素含量的下降 ,可能的原因
一是细胞聚合体外表细胞的死亡(色素含量上 ,细胞
聚合体外表的细胞要高于内部细胞),二是高浓度培
养基对色素合成的影响及低色素含量细胞的快速增
殖和生长。
两种接种量的培养过程相比较 ,在整个培养过
程中 ,pH 、细胞生长及色素合成的变化大致相同 ,但
25克接种量时 ,色素产量要高于 20 克接种量的培
养 ,生物量的倍增数则稍小一些 ,这与前面的 M9 中
培养的结果大致相同 。另外 , 25 克接种量培养时 ,
生物量及色素含量达到最高点的时间提前 ,表明在
同样养分条件下 ,在一定的范围内加大接种量可加
速分批悬浮培养的时间进程 。
3352003　Vo1.15　No.4　　康强胜等:新疆紫草细胞生产阶段培养中细胞生长及产物合成的研究Ⅰ :悬浮培养　　　　　　　　　
图 2　20 克/瓶接种量时新疆紫草细胞悬浮培养的时间
进程
Fig.2　Time course of A .euchroma cell suspension culture
a t 20 g/ flask inoculum size
图 3　25 克/瓶接种量时新疆紫草细胞悬浮培养的时间
进程
Fig.3　Time course of A .euchroma cell suspension culture
a t 25 g/ flask inoculum size
2.3　加大培养量后色素产量的变化
将培养基的量增大到 200 ml ,于 500 ml锥瓶中
培养 23天后收获 ,结果(表 1)表明 ,加大培养量后 ,
无论在 M 9中还是 2＊M9 中培养 ,色素的产量都有
所下降 。这可能与增大培养量后 ,溶氧及混合性能
欠佳有关[ 6] 。在增大培养量的前提下 ,进一步提高
培养基的浓度(使用 3＊M9),可在一定程度上提高
色素的产量 。
表 1　培养量增大后色素产量的变化
Table 1　The varia tion of shikonin derivatives yield after medi-
um amount incrcased
接种量(gFW/ flask)
Inoculum size
45 46 43
培养基 Medium M 9 2＊M 9 3＊M 9
生物产量＊(gDW/ flask)
Biomass yield
4.25 4.33 5.50
色素产量(mg/ flask)
Pigment yield
96.35 110.22 161.70
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疆紫草细胞.生长工程学报 , 1994 , 10(1):81 ～ 86
STUDYON GROWTH AND PRODUCT FORMATION OF ARNEBIA
EUCHROMA CELL IN SECOND STAGE
Ⅰ :SUSPENSION CULTURE
KANG Qiang-sheng , LI Hong-lin ,WU Yu-lan ,LU Da-yan
(Wuhan Institute of Botany , Chinese Academy of Sciences ,Wuhan　430074 , China)
Abstract　This paper reports the effect of inoculum size and medium concentration on the g row th and shikonin
derivative′s fo rmation in cell culture of Arnebia euchroma .When the amount of inoculum increased , a high
biomass yield obtained but cells′increased-times decreased.The output of shikonm was rose at a range of inocu-
lum size.Exceeded 30 g FW/ flask , shikonm formation reduced.Selected a suitable inoculum size , a high medium
concentration could result in a high shikonm yield , but the productivity of shikonm decreased w ith increasing
scale.
Key words　Arnebia euchroma ;suspension culture;shikonin derivatives
336　　　　　　　　　 天然产物研究与开发 2003　Vo1.15　No.4