全 文 ：牛肝菌摇瓶发酵条件优化研究
王允祥　陆兆新　吕凤霞
(南京农业大学食品科技学院 ,南京 , 210095)
摘　要　在 Plackett-Burman实验结果基础上 ,采用响应曲面法(response surface methodology , RSM)
对影响牛肝菌(Boletus sp.)ACCC 50328 发酵产糖与生长的关键工艺参数 ,发酵温度 、发酵时间和
装液量的最佳水平范围进行了研究和探讨。 通过对胞外多糖曲面方程以及菌丝干重二次多项回
归方程求解得知 , 在自变量发酵温度 ,发酵时间和装液量分别为 24.23℃、10.7 d 和 50.0 mL 时 ,牛
肝菌 ACCC 50328菌株发酵胞外多糖的最大预测值为 1 053.99 μg/ mL发酵醪;在 26.77℃、10.9 d
和 64.90 mL时 , 该菌干菌丝浓度可达 4.22 mg/mL 发酵醪。欲同时获得最大量的胞外多糖和菌丝
浓度 ,则发酵温度 , 发酵时间和装液量须为 26.23℃、10.5 d 和 58.70 m L , 在此条件下 ,每毫升发酵
醪中的胞外多糖含量和菌丝浓度分别为 992.26μg 与 4.16 mg。上述预测值不仅被统计学方法所
验证 , 而且也被后续实验所证实。
关键词　多糖 , 牛肝菌 ,优化 , 响应曲面法 , Box-Behnken 设计
第一作者:博士生 ,副教授(陆兆新教授为通讯作者)。
收稿时间:2003-09-26 ,改回时间:2004-05-25
　　绝大多数的真菌尤其是高等担子菌多糖都
具有一定的生物学活性 ,它们不仅存在于子实
体中 ,同样也存在于真菌培养菌丝和发酵液中 。
对牛肝菌(Boletus sp.)ACCC 50328 发酵提取
物的初步研究 ,笔者发现该菌胞外粗多糖对小
鼠肉瘤S180具有一定的抑制作用。为了进一步
研究关键工艺参数 ,发酵温度 、时间和装液量对
牛肝菌 ACCC 50328 菌株发酵胞外多糖的影
响 ,了解该菌生长与发酵产糖之间的相互关系 ,
提高胞外多糖含量 , 本研究在原有 Plackett-
Burman实验设计结果基础上 ,采用响应曲面法
(Response Surface Methodology , RSM)对上述 3
个关键因素的最佳水平及其交互作用进行了研
究和探讨 。
1　材料及方法
1.1　供试菌株
牛肝菌(Boletus sp.)ACCC 50328 ,购自中
国农业微生物菌种保藏中心。
1.2　培养基
种子培养基:综合马铃薯培养基[ 1] ;发酵
培养基(/ L):葡萄糖 5 g ,麦芽糖 22 g ,酵母膏
14 g , KH2PO4 0.5 g ,(NH4)2SO4 2.7 g , FeSO4
67 mg ,CuSO4 100 μg ,pH 值自然。
1.3　菌种培养及接种
见文献[ 2] 。
1.4　菌丝生长量及胞外多糖含量的测定
按照实验设计时间要求 ,对发酵醪减压过
滤 ,得菌丝体和滤液。将菌丝体 80℃干燥至恒
重 ,称量 ,以 mg/mL 发酵醪计。取滤液 10mL ,
采用 Sevag 法脱蛋白至两相界面无膜出现为
止 ,取 2mL 该脱蛋白液自来水流水透析 2 d ,蒸
馏水透析 2 d后 ,取出透析液定容至 50mL ,采
用文献[ 3]方法测定多糖含量 ,以μg/ mL 发酵
醪计。
1.5　实验设计
从 Plackett-Burman设计实验结果得知:影
响牛肝菌 ACCC 50328菌株发酵产糖的主要因
素是发酵时间 ,影响其生长的关键因素为发酵
时间 、温度和装液量。本次实验欲在研究胞外
多糖含量的同时 ,对该菌的生长繁殖也一并进
行探讨 , 以了解发酵过程中牛肝菌 ACCC
50328菌株菌丝生长与发酵产糖之间的相互关
系 。对于影响不显著的其他工艺参数皆选定在
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食品与发酵工业　Food and Fermentation Industries　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
2004年第 30卷第 7期(总第 199期) 　(　　)
DOI :10.13995/j.cnki.11-1802/t s.2004.07.016
原先的合适水平 ,即接种量为 1片/50mL 发酵
液 、摇床转速为 140 r/min。
RSM 虽被广泛地用于众多的发酵优化
中[ 4 ～ 7] ,但关于牛肝菌 ACCC 50328 菌株发酵
条件的优化 ,国内外尚未见报道。鉴于此 ,本研
究将采用 Box-Behnken模型对影响牛肝菌 AC-
CC 50328菌株生长及发酵产糖的关键工艺参
数进行最佳水平研究和探索。所用软件为 De-
sign Expert (version 6.0.5 , Stat-Ease Inc.,
M inneapolis , MN.USA),评价指标(响应值)
为表示菌丝生长量的菌丝干重(dry cell
w eight , DCW)以及胞外多糖含量(exopolysac-
charide content , EPC),考察因子(自变量)为发
酵温度 、时间和装液量 ,分别以 X 1 、X 2 和 X 3
代表之 ,每一自变量的低 、中 、高实验水平分别
以-1 、0 、1进行编码 (表 1),且编码值与真实
值之间的关系符合下列方程:
x i=(X i-X 0)/ ΔX i (1)
式中 xi 为自变量的编码值 , X i 为自变量的实
际水平值 , X 0 为实验中心点的实际水平值 ,
[X i 为自变量单位增量(step change value)] 。
设该模型通过最小二乘法拟合的二次多项方程
为:
Y = c0 +∑n
i=1
aix i +∑n
j≤i
b ijx ixj (2)
式中 Y 为预测响应值;xi 和 xj 为自变量编码
值;c0 为常数项;a i为线性系数;bij为二次项系
数;n 为因子数 ,在本实验取值 3。按照 Box-
Behnken实验设计的统计学要求 ,需要 17组试
验对方程(2)的各项回归系数进行回归拟合 ,见
表 2。
表 1　实验因素水平及编码
自变量 代号未编码 编码值
编码水平
-1 0 1
发酵温度/ ℃ X 1 x1 24 27 30
发酵时间/ d X 2 x2 9 10 11
装液量/mL X 3 x3 50 75 100
表 2　Box-Behnken实验设计以及 DCW和 EPC的实测值与预测值
组 别 温 度(x 1)
时间
(x2)
装液量
(x3)
EPC /μg·mL-1
实验值 预测值
DCW /mg·mL -1
实验值 预测值
1 -1 -1 0 241.41 266.79 2.75 2.80
2 1 -1 0 367.45 399.83 2.89 2.99
3 -1 1 0 787.57 755.19 3.53 3.44
4 1 1 0 395.46 370.07 3.32 3.27
5 -1 0 -1 920.61 928.49 3.30 3.35
6 1 0 -1 451.47 452.35 3.08 3.08
7 -1 0 1 220.41 219.53 2.75 2.75
8 1 0 1 451.47 443.60 3.10 3.05
9 0 -1 -1 423.47 390.21 3.78 3.69
10 0 1 -1 815.58 840.09 4.08 4.13
11 0 -1 1 276.42 251.92 3.41 3.36
12 0 1 1 227.41 260.67 3.74 3.84
13 0 0 0 892.60 877.20 3.99 4.08
14 0 0 0 857.59 877.20 4.07 4.08
15 0 0 0 899.60 877.20 4.15 4.08
16 0 0 0 850.59 877.20 4.09 4.08
17 0 0 0 885.60 877.20 4.12 4.08
2　结果与讨论
利用 Design Expert软件 ,通过表 2中胞外
多糖实验数据对方程(2)进行多元回归拟合 ,获
得牛肝菌 ACCC 50328菌株胞外多糖对编码自
变量发酵温度 、时间和装液量的二次多项回归
方程:
Y EPC= 877.20-63.02 x 1 +114.66 x 2 -
179.43 x 3 - 176.98 x 12 - 252.25 x 22 -
189.23 x 32 - 129.54 x 1 x2 + 175.05 x 1 x 3 -
110.28 x 2 x 3 (3)
模型方程(3)方差分析表明 ,本实验所选用
的二次多项模型具有高度的显著性(p <
0.0001),其校正决定系数(adjusted determina-
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研究报告
(　　)　 2004 Vol.30 No.7(Total 199)
tion coeff icient , R 2Adj)为 0.9839 , 表 明仅有
1.2%的 EPC总变异不能由此模型进行解释 。
此模型拟合优度好 ,其多元相关系数(multiple
correlation coefficient , r)为 0.9965 。上述方程
回归系数显著性检验表明 , 3 个试验因素对
EPC的线性效应 、曲面效应以及两两交互效应
皆显著(数据未显示)。
同理 ,利用表 2 中 DCW 实验数据对方程
(2)进行拟合 ,获得牛肝菌 ACCC 50328菌株菌
丝生长量的二次多项回归方程:
Y DCW = 4.083 +0.008 x 1 +0.230 x 2 -
0.155 x 3-0.827 x 12 -0.132 x 22 -20.198 x 23 -
0.090 x 1 x 2+0.143 x1 x 3+0.008 x 2 x3 (4)
方差分析表明 ,模型方程(4)极显著(p <
0.0001), R2Adj为 0.9627 ,决定系数(determina-
tion coef ficient , R2)为 0.9837 ,而且回归系数有
意义(数据未显示)。
2.1　牛肝菌胞外多糖含量响应面分析与优化
通过方程(3)所作的响应曲面图及其等高
线图见图 1和图 2 ,通过图 1和图 2即可评价
实验因素对胞外多糖的两两交互作用以及确定
各个因素的最佳水平范围。
图 1　发酵温度和发酵时间对 EPC 交互影响效应的曲面图及其等高线图
　　由图 1可知 ,在本实验水平范围内 ,发酵温
度与时间对 EPC 的影响几乎为反比关系 ,随着
发酵温度的升高 ,牛肝菌 ACCC 50328 代谢产
生相对最大多糖量所需的时间缩短 ,当装液量
为 75 mL(中心点值),发酵温度与时间分别在
25.7 ～ 26.4℃和 10.2 ～ 10.4 d范围时 ,每毫升
发酵醪能获得 899.60μg 的胞外多糖。
由 2图可直观地了解到较长的发酵时间和
较多的装液量都不利于牛肝菌 ACCC 50328菌
株代谢产糖 ,其原因可能是胞外多糖复被利用
之故。在发酵温度为 27℃时 ,每毫升发酵醪欲
获得 920.61μg的多糖 ,需装液 51 ～ 70mL 、发
酵 10 ～ 10.7 d即可。由此可知 ,在实验水平范
围内 ,发酵温度 、时间和装液量的最佳水平分别
是24 ～ 27℃、10 ～ 10.7 d和 50 ～ 70mL ,在此条
件下 ,每毫升发酵醪所能获得的 EPC 不低于
920.61 μg 。通过对方程(3)解逆矩阵求极值得
知 ,在装液量为 50.0mL 时 , 24.23℃发酵 10.7
d ,每毫升发酵醪能获得 1 053.99 μg 的胞外多
糖 ,此最大预测值比优化之前的 752.08 μg 大
约增加了 300 μg/mL 发酵醪 。
2.2　牛肝菌菌丝生长量响应面分析与优化
实验因素发酵温度 、时间及装液量对牛肝
菌 ACCC 50328菌株菌丝生长量的交互影响见
图 3和图 4。
由图3可见 ,在装液量为 75mL 时 ,牛肝菌
ACCC 50328 菌丝生长的最适温度为 27℃左
右 ,且发酵的第 9 d至第 10 d菌丝生长较快 ,每
毫升发酵醪约增加 360μg ,而第 10 d 以后菌丝
增量趋缓 ,仅为 60μg 左右 。在 26.2 ～ 27.4℃
发酵 10.3 ～ 11 d的最佳条件下 ,每毫升发酵醪
能获得的最大菌丝量为 4.15μg 。
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图 2　发酵时间和装液量交互影响 EPC的曲面图及其等高线图
图 3　发酵温度和时间对 DCW交互影响的曲面图及其等高线图
图 4　发酵温度和装液量交互影响 DCW的曲面图及其等高线图
　　在发酵的第 10 d ,装液量和发酵温度对牛
肝菌 ACCC 50328 菌丝量的交互影响见图 4。
由图 4 可见 ,在 27℃左右进行发酵时 ,其最适
合的装液量约为 55 ～ 74 mL ,较多或较少的装
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(　　)　 2004 Vol.30 No.7(Total 199)
液量都不利于该菌的生长 。装液量相对增多可
能是由于发酵菌丝形态发生改变 ,造成溶氧不
足而导致菌丝量减少 ,而相对较少的装液量对
环境变化的缓冲能力较低 ,随着菌丝的快速生
长 ,造成发酵内部环境 ,即培养基的极度恶化 ,
如代谢废物浓度的过度升高 ,渗透压与氧化还
原电位的急剧改变等。利用 Design Expert 软
件对方程(4)求解 ,得到获得最多菌丝量(4.22
mg/mL发酵醪)的最佳外界条件是:发酵温度
26.77℃、时间 10.9 d和装液量 64.90mL。
2.3　模型验证实验
对该模型的实际验证结果见表 3 ,利用
SPSS(version 10.0 , SPSS Inc.USA)软件分别
对表中 EPC 和DCW的实测值与预测值进行相
关分析得知 , EPC 的相关系数为 0.9990 ,DCW
为 0.9824 ,证明此模型是合适有效的 ,并具有
一定的实践指导意义。
表 3　模型验证实验
组 别 温 度(X 1)
时间
(X 2)
装液量
(X 3)
EPC /μg·mL-1
实验值 预测值
DCW /mg·mL -1
实验值 预测值
1 25 9 50 395.46 383.43 3.32 3.35
2 25 10 60 927.61 949.58 3.77 3.79
3 27 10 60 920.61 916.23 4.02 4.10
4 27 11 50 843.59 839.60 4.20 4.13
5 25 11 60 948.62 964.50 3.87 3.94
3　结　论
借助 Design Expert软件 ,利用响应曲面法
分别建立了影响牛肝菌 ACCC 50328菌株生长
和发酵产糖的二阶数学模型 ,并利用统计学方
法对模型方程(3)与方程(4)分别进行了显著性
检验 ,通过 3-D图及其等高线图探讨了各因素
间的交互作用 ,优化了牛肝菌 ACCC 50328 菌
株发酵工艺参数水平 。由所建模型预测得知:
在发酵温度 、时间和装液量分别为 24.23℃、
10.7 d 和 50.0 mL 时 , 每毫升发酵醪可获得
1053.99μg 的胞外多糖;在 26.77℃、10.9 d 和
64.90mL 时 ,每毫升发酵醪可获得 4.22mg 的
干菌丝;欲获得最多的干菌丝量和胞外多糖量 ,
则需装液 58.70 mL , 26.23℃发酵 10.5 d ,在此
条件下 ,预测每毫升发酵醪可同时获得 992.26
μg 的胞外多糖和 4.16mg 的干菌丝。
对牛肝菌 ACCC 50328菌株生长和发酵产
糖的 3-D图及其等高线图进行比较即可发现 ,
发酵时间是同时影响该菌代谢分泌胞外多糖和
生长速度的关键因素 ,在发酵第 9 d 至第 10 d ,
菌丝量快速增加 , 10 d后 ,菌丝增量极微 ,而此
时胞外多糖却大幅上升 ,并于第 10.7 d达到高
峰 ,由此推测 ,该菌可能于第 10 d 开始逐步发
生自溶 ,致使胞内多糖释放到发酵醪中 ,造成多
糖含量快速升高 。第 10.7 d后 ,发酵醪中多糖
含量开始下降 ,随之菌丝量也逐步减少 ,推测为
醪中多糖重复被该菌利用之故。
参 考 文 献
1　周宇光.菌种目录第三版[ M].北京:中国农业科
技出版社 , 1997.231
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3　董　群 , 郑丽伊 , 方积年.改良的苯酚-硫酸法测
定多糖和寡糖含量的研究[ J] .中国药学杂志 ,
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5　胡　升 , 梅乐和 , 姚善泾.响应面法优化纳豆激酶
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7　王昌禄 , 于志萍 , 顾晓波.氮源及 C/ N 比对 D-核
糖发酵的影响[ J].食品与发酵工业 , 2004 , 30(2):
53 ～ 56
71
研究报告
2004年第 30卷第 7期(总第 199期) 　(　　)
Optimization of Fermentation Conditions for Exopolysaccharide
and Mycelium Biomass by Boletus sp.ACCC 50328
Wang Yunxiang 　Lu Zhaoxin 　Lu Fengxia
(College of Food Science and Techno logy , Nanjing Ag ricultural University , Nanjing , 210095)
ABSTRACT　Response surface methodology (RSM)based on a three-level three-factor Box-Behnken
design of experiments w as used to optimize the exopolysaccharide content(EPC)by using submerged
fermentation of Boletus sp.ACCC 50328 , and the mycelium biomass seeparately , in terms of dry cell
w eight(DCW).The critical factors selected were temperature , time of fermentation and bro th content
based on the results of our previous Placket t-Burman design.The objectives of the present wo rk w ere
to locate optimum level of these process parameters , and to find out interactions among that for en-
hancement of exopoly saccharide yield.By solving the regression equat ion and analy zing the response
surface contour plo ts , the optimal process conditions w ere determined:7 d fermentation time;temper-
ature of 24.23℃;and bro th content of 50.0mL , EPC obtained from Plackett-Burman design w as in-
creased from 610.78 to 1053.99 μg per milliliter of fermentation liquor.While fermentation time ,
temperature and broth content w ere 10.9 d , 26.77℃ and 64.90mL , DCW was increased from 3.42
to 4.22 mg/mL.In order to obtain the maximum y ield of EPC and DCW , conditions w ould be located
at 10.5 d , 26.23℃, and 58.70mL.Under this conditions , the maximum predicted yield of EPC and
DCW were found to be 992.26 μg/mL and 4.16 mg/mL , respectively.These predicted values w ere
also verified by validation experiment.
Key words　polysaccharide , Boletus sp., opt imization , response surface methodology (RSM), Box-
Behnken design
(上接第 66页)
Research on the Interaction of Flaxseed Gum and Meat Protein
Chen Haihua 　Xu Shiying 　Wang Zhang
(School of Food Science and Technology , Southern Yang tze University , Wuxi , 214036)
ABSTRACT　Denatured temperatures of meat pro tein(M), myofibrillar protein(MP)and salt-solu-
ble meat protein (SSMP)with or wi thout flaxseed gum were determined by differential scanning
calorimetry (DSC).Denatured temperatures of compounds of SSMP with or w ithout flaxseed gum
were determined by A R1000 rheometer.The results indicated that there w as interaction between
flax seed gum and meat protein , myof ibrillar pro tein , salt-soluble meat protein.The result of TPA in-
dicated the addi tion of f laxseed gum could increase the gel streng th of SSM P and decrease the water
loss of SSM P gel , which further conf irmed that there was interaction betw een flaxseed gum and salt-
soluble meat protein.
Key words　flaxseed gum , meat pro tein , dif ferential scanning calo rimetry (DSC), dynamic rheologi-
cal properties , denatured temperature , interaction
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研究报告
(　　)　 2004 Vol.30 No.7(Total 199)