全 文 ：植 物 学 报 1 , , 3 , 5 5 ( i ) : 5 7一 6 1
注 e t o B o t 口 , . i e o is ” i e 口
新疆紫草细胞悬浮培养和发酵
培养的研究 *
董教望 叶和春 吴 新
伍正蓉 顾利民
李国凤
陈建林
( 中国抖学院植物研究所 , 北京 10 0。今幻
摘 要
报道了新疆紫草 ( 汉 r o e b : a ` “ e h r o . 。 ( R o y l。 ) J o h n s t ) 细胞在悬浮培养和发酵培 养 中
的某些特性 。 细胞悬浮培养的接种量以 2 . 5 0 9 · 干 重 / L较为合适 , 其相应的月产率 为 2 、 0
g
· 千重 / L 。 细胞生长的时间进程 : 接种后 。一 3 天细胞生长停滞 , 3一 12 天迅速生长 , 12
天以后基本停止生长 。 p H 值随涪养的时间而变化 , 接种后第 12 夭出现一次高峰 。 在悬浮
培养的生产培养基中 , 紫草宁衍生物的合成在接种后 0一25 天内迅速增加 , 25 天左 右 达 到
高峰 。 发酵培养的月产率达到 9 . 4 79 · 干重 ZL 和 9 . 3 49 · 干重 / L , 其细胞的生长动态与 悬
浮培养的相似 。 I O L 发酵培养的总色素含量达到干重的 1 4 . 26 % , 紫草宁衍生物的 产 率 为
一 9 3 9 / L o
关键词 新疆紫草 ;悬浮培养 ;发酵培养 ;细胞生长 ;紫草宁衍生物
3 T U D I E S O N C E L L S U S P E N S I O N C U L T U R E A N D F E R M E N
·
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T h is P a P e r r e P o r t s s o m e c h a r a e t e r i s t i e 、 o f e e l l s u s P e n s i o n a n d f e r m e n t a t i o n e u l r u r e i n
丈r ne b i a e “ c h r o m a ( R o y l e ) J o h n s t . T h e y i e 主d o f s u s p e n s i o n c u l t u : e r e a e h e d 22 . 0 9 d r y w t / L r .e r
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收稿日期 : 19 9 1一 0 4一 5 妾受 日期 : 1 99 1一 0 5一 2 0
. 国家 “ 七五 ” 攻关课题 。
刘 值 物 学 报 3 5卷
k o n i n d e r i va ti e v si n e r e a
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v a t i v e s
新疆紫草 ( A ; 、 .cb : 。 “ ` 寿; 。 。 。 ( R o y l e ) J o h n , t . )属于紫草科假紫草属的多 年 生 草
本植物 , 根中含多种茶醒色素〔Z J , 具有抗肿瘤活性 、 消炎 、收敛和解热等多种药理作 用 L, , 1l] 。
多年来 , 由于对紫草资源无节制的采挖 , 已造成野生资源的不断减少 , 加之人工引种栽培
的困难 , 因此 , 采用细胞大规模培养技术提取紫草的有效成分具有重要的意义 。 日本于
1 9 8 3年实现了硬紫草 ( L i认 0 5户。 ; m o m e r y : h r o h i z o n ) 细胞大规模培养的商品化生产 〔` , 。
虽然 日本对硬紫草 的细胞培养进行了一系列深人的研究 〔卜 , ·川 , 但新疆紫草为同科紫草类
植物中蔡醒化合物含量最高 , 临床应用药效最好的一种 , 为我国商品紫草的主要来源 ’ 6 , 。
本文报道了新疆紫草细胞悬浮培养和发酵培养的一些结果 , 以期为今后更大规模的细胞
发酵培养提供依据 。
材 料 和 方 法
(一 ) 实验材料
采用本实验室诱导并筛选的新缅紫 草 乏A r , 。 b ; a e “ c h ; o 二 a ( R o y l e ) J o h n s t l 高产
优良的细胞株系 。
(二 ) 培养和测定方法
以筛选的 A G 一 7 培养基为生长培养基 以 , , 附加 l m g / L K T , o . Zm g / L IA A ; 以 A P 一 5
(改良 M 一 9 ) 为紫草宁衍生物的生产培养基 `1 , 附加 o . s m g / L K T 。 悬浮培养时在 A G 一 7
培养基中每隔 10汽 4 天继代一次 。 在黑暗中培养 , 温度为 2 6 土 l ℃ 。
1
. 悬浮培养中细胞生长和 p H 值测定 从培养的三角瓶中每次取 5m l 摇匀的培 养
物 , 以 20 0 x g 离心 10 分钟 ,上清液用作测 p H 值 ( C ol e 一 aP r m e r 仪器公司生产的 iD g i -
se n ce 州 计测定 ) , 将沉淀的细胞置 60 ℃下烘干 ,称干重 。 每隔 3 天测定一次 。
2
. 悬浮培养中培养物产率和生长速率的测定 以不同的接种 量 接 人 一 定 体 积 的
A G 一 7 培养基中 , 培养 巧 天后收获 , 60 ℃烘干后称干重 , 计算培养物产率和生长速巫 。 绝
对生长速率和相对生长速率的公式分别为 : R 。一 ( W Z 一 W 、 )/ , · v 和 R ; 一 厂 `厄 (万 2 /
甲 1 ) , 两者的单位分别是 9 d yr w t/ L · d 和 d ay 一 1。 附 、 为起始接种 量 ( g ) , 牙 , 为 最
终培养物干重 ( g ) , V 为培养体积 ( L ) , , 为培养时间 (天 ) 。
3
. 悬浮培养中色素含量的测定 将培养至 12 天左右的培养物经离心收集 细 抱 , 把
收集的全部细胞悬浮于 A P 一 5 培养基中 ,摇匀 , 分别取 50 m l 加于 2 50 m l 三角瓶 中培养 。
每隔 5 天取出数瓶 ,经过滤 、烘干后测定细胞的色素含 量 。
以上的悬浮培养均采用旋转式摇床 (中科院武汉科仪厂 , P Y B 型 )转速 1 1 0 r /m i on
4
. 发酵罐中细胞生长情况的观察 选生长良好的悬浮培养细胞转接于 S L 搅拌式 发
董教望等 :新疆紫草细胞悬浮培养和发酵培养的研究
酵罐 (Y o m ato 一 F C一 0 5 1一 0 1) 或 o l L搅拌式发酵罐 (Y am ato 一 M D 一 5 0 0一 lo L) 中 , 两者的
工作体积分别为 4 L 和 S L 。 每次观察细胞生长时将发酵罐停止通气和搅拌 30 分钟 , 记下
培养物在罐内的累积高度 ,换算成培养物体积占工作体积的百分数 , 以此表示细胞生长动
态 。 每隔 3 天观察一次 。 收获时过滤 , 培养物烘干后称重 ,计算产率和主长速率 。 发酵培
养的条件为 : 通气量 0 . 5一 o . s v v m , 搅拌速度为 7 5 「 /m l on
5
. 发酵罐中细饱色素产生的培养试验 选择生长状态良好的悬浮培养物 , 静置后将
其清液倒掉 ,剩下的培养物用 A P 一 5 液体培养基冲洗两遍后接人 I OL发酵罐内 (工作体积
S L )
。
28 天后收获 , 过滤的细胞于 60 ℃ 下烘干后用于色素的测定 , 滤液加石油醚直接进
行色素提取 。 发酵培养条件 : 通气量 1 . vo v m , 搅拌速度 8 0r / m ion
6
. 紫草宁衍生物含量的测定 将烘干的样品研碎后过 35 目尼龙网筛 ,过筛的粉末用
石油醚提取 ,并用分光光度计测定 , 测定波长为 5 2 l0 m 。 以天然新疆紫草根的提取物为
标准品 。
结 果 与 讨 论
(一 ) 悬浮培养
.l 不 同接种量对生长的影响 在悬浮培养中 , 接种量的多少对细抱生长往往有较大
的影 响「10J 。 本实验证明三种接种量 (表 l) 中以 2 . 5 09 干重 / L 为好 。
表 1 接种 盈对悬浮培养的新疆紫草细胞生长的影 响
T a b l e 1 E f f e e t s o f i n o c u l u m q u a n t i t i e s o n
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2
. 细胞生长的时间进程和 p H 值的变化 如图 l 所示 ,在细胞生长的同时 , 培养液中
的 p H 值总趋势是上升的 ,第 12 天达到最高峰 , 此时细胞的生长停止 。细胞生长和 p H 值随
之变化的相关性机理 尚有待进一步探讨 。 有意 思的是 , 在细胞生长的最快阶段 ( 6一 9天 ) ,
p H 值保持相对的稳定 。 p H 值达到高峰的第 12 天后开始下降 , 第 18 天 p H 值降至接近
最初的水平 。 在玉米细胞的悬浮培养中也存在着细胞的增殖率与培养液 p H 值升降之间
的相关性 3[] ,不过其 p H 值变化的趋势与我们的有所不同 。
3
. 紫草宁衍生物在生产培养基中形成的时间进程 如图 2 所示 , 细胞转人色素生产
培养基后的 0一 25 天内色素含量迅速增加 ,其中以 巧一 2 , 天内增加最快 , 25 天左右达到
高峰 , 2 5 天以后色素的形成基本停止 。 第 25 天的细胞色素含量达到千重的 14 . 3沁。 可
见 ,细胞的收获以培养 25 天左右为佳 。
(二 ) 发酵地养
1
. 发酵培养物的产率和生长速率 如表 2 所示 。在 S L 发酵罐中 , 当接种量为 1 . 84 9 d r y
` 0 植 物 学 报 3 5卷
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培养时间 C u l le u rpe rio d (d ay )培养时间 C u lt ue rpe ri o d (d ay)
图 l新疆紫草细胞悬浮培养中细胞生 长 和 p H值
的变化
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.细胞 生长的时间进程 ; B .培养基中的 p H值变化
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新疆紫草细胞悬浮培养中紫草宁形成 的 时
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表 2 新魂紫草细胞发醉培养的产率和生长沈率
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绝对生长速率
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相对生 长速率
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2、 1 0 L b , :` r e a e t o r .
w t/ L 时 ,绝对生长速率达到 。 . 25 9 d r y w t / L . d 讨 , 相当于每月产率 9 . 3 49 dr y w t / L 。
在 I OL 发酵罐中 , 当接种量为 3 . 4 7 9 d yr
w t / L 时 , 其绝对生长速率为 。 . 2 0 9 d yr
w t/ L
·
d , 相当于每 月 产 率 9 . 47 9 d yr
w t / L
。 与悬浮培养相比 ,发酵培养的产
率和生长速率均较低 , 其原因 可能是多
方面的 。 其中包括发酵罐的搅拌方式 、
通 气量和 p H 直。 本实验所采用的发酵
罐的螺旋桨搅拌器能对植物细胞产生较
大的切变力 , 容易损伤植物细胞而导致
细胞生长速率的降低 。 其次 , 通氧量和
p H 值变化也能影响细胞的生长 。
2
. 发酵培养的细胞生长动态 由图
3 可见 , 发酵培养的细胞生长动态与悬
ǎ岁à
.329.56
2 .0 0
毛— 一七一 一止 _
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培养时间 C u lt uxc p e ir o d (d a刃
图 3
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3
新疆紫草细胞在 , L 发酵罐中沟 生 长 动 态
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盯期 董教望等 :新疆紫草细袍悬浮培养和发酵培养的研厂
浮培养的相似 。 接种后 0一 3天细胞几乎不长 , 3一 9 天是细胞迅速生长的时期 , 9一 12 天
细胞生长减慢 , 12 天后细胞几乎停止生长 。
3
. 发酵培养物的色素含量和发酵培养的色素产率 细饱接 人 10 L 发酵罐 3天 后 生
产培养基溶液即开始变红 。 28 天后收获时测得干细胞色素含量为 10 . 05 汤 , 溶液中的色
素含量为 4 21 外 , 总色素含量为 14 . 26 肠 ,换算成色素产率为 1 . 9 39 / oL
从本实验的结果可以看出 ,与天然植株根由紫草宁衍生物含量 1一 5肠 〔刃相比 ,无论是
细胞悬浮培养还是发酵培养 , 细胞培养物中的色素含量均可提高 2一 8 倍 。
参 考 文 献
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{::)
叶和春 、 尹作鸿 、 李国 凤 、 昊新 、 董教望 、 伍正蓉 , 1 99 :1 不同理化因子对 新疆紫草愈伤组织生长及紫草宁生物
合成的影响 。 植物学报 , 3 : 9 27 一 9 3 1。
卢酸荪 、 向桂琼 、 祝风池 , 19 8:3 假紫草化学成分研究 。 谊物学报 , 25 : 朽 5一 4 5夕。
孙敬三 、 路铁刚 、 M . R . S o n d a il , 19 8 9 . 超甜玉米单倍体悬浮细胞 系的建立及其生 长特性 。 植物学报 , 31 :
7 4 2
一
74 9
0
李忠良 、 张敏 、 郭兰建 , 生9 3衍 紫草中紫 草素的含量测定 。 药物分析杂志 , ( 6 :) 似一 42 。
林志彬 、 柴宝玲 、 王佩 、 郭铃新 、 卢馥荪 、 向桂琼 , 19 8 :0 紫草化学成分抗 炎症作用的研究 。 北京医学院学报 ,
12 : 1 0 1一 10弓。
高菊红 , 19 8 :6 紫草的 资源 、 化学 、 药理和临床研究概 况。 中草药 , 17 ( 6) : 28 一 37 。
F u ii
t a
,
Y
.
a n d Y
.
H
a r a , 19 8 5
: T 几。 e f f e e t i v e p r o d u : t i o n o 士 sh ik on i n b y e u l t u r e s w i t h a n 妞 c r e a s e d c o l l p o p u -
l
a t i o n
. 月宕r i c . B潇口宕. C h亡仍 , 4 9 : 2 0 7 1一2 0 7 5 .
F u ii t a
,
Y
. ,
Y
.
H a r a
,
C
.
S u g a a叻 T . M o r im o t o , 1 98 1 : P r o d u c t i on o f sh i k on i n d e r i v a t i v e s b ? e el l s u s P e n s io
e u l t u
r e s o f itL
五“ 户` r功 “ 仍 叮 ” h r 口 r 方` 2 0 月 11 . A 叱w m e d iu m f o r t h e p r o d以 t ion o f s址 k , n i n d e r 卜 a t i , e : .
P l a刀才 介 l l R` P . , 1 : 6 1一 63 .
H a r a
,
Y
. ,
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.
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im o t o a n d Y
.
F u ji , a
_
l , 87 : P r o d
u e t i o n o f s h i k o
n i n d o
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i v a t i
v e s b萝 c e l l , u s o e n :三o n e u l t u r e s 时
L i不人。 万内 r 那 “ 仍 ` r 尹人r o r h i z o 刀 v . D i f f e r e t一e e s i n rh e p r o d u c r i o n b e t w e e n c a l lu s a n d ` u s p e n s l o 几 e u l t u r e ` . p l。娜
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. ,
6
:
8一 1 1 .
P u h
a n
.
2
.
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.
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.
M a r t i n
, 19 7 1
.
T h e i n d u s t r i a l 卯 t e n t i a l o f p l a n t e e l l e u l t u r c , I n : D . J . D . H o e k e n h u l l
e r a l
.
e d s
. , P r o g r es s i n I n d此 t r i a l M i e r o b i o l o g 萝. L o n d o n : J . a n d A . Ch u r ` h i l l , V ol . 9 , 2 4一2 5 .
Sa n k
a w a
,
U
· , 1 9 7 7 : A n t i t tun
o r 飞c 亡iv i r、 o f sh i k o n 一n a n d i t s d e r i v a r一v e s c 人e 邢 . p 人a r 功 . B “ 11 , 2 5 : 23 9 2一23 9 , ·
T a b
a : a , T
.
a n d Y
.
F u ii r a
, 19 8 5 : P r o d u e t i o n o f s五ik on in b y Pl a n r e e l l c u l t ur e . I n : M . Z a i t l i n e t a l . 记 : .
B i o t
e e h n
o l o g y 一n P l a n t S e i e n c e
.
f l
o r
i d
a : A e a d c m i ` p r e “ , 2 0 7一2 18 .