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岩白菜素对脂多糖诱导 RAW264. 7 细胞 IL-6、
TNF-α及 NF-κB表达的影响
沈映冰1，陈 杰2* ，许 静3，官碧琼3，罗子玲3
(1. 中山大学附属第六医院药剂科，广东 广州 5106551;2. 中山大学附属第一医院药学部，广东 广州
510008;3. 南方医科大学附属第三医院药剂科，广东 广州 510630)
摘要 目的:研究岩白菜素预处理对脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导 RAW264. 7 细胞 IL-6、TNF-α 及 NF-
κB表达的影响。方法:将 RAW264. 7 细胞随机分为空白对照组、DMSO组(DMSO浓度≤0. 1%)、模型组(加入终浓
度为 10 μg /mL的 LPS)及岩白菜素低、中、高剂量组(0. 5、5、50 μmol /L) ，各组处理完毕后，ELISA 检测不同处理组
对 LPS诱导 RAW264. 7 细胞分泌白细胞介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量，Western blot方法检测岩白
菜素对 LPS诱导细胞核因子-κB(NF-κB)p65 蛋白表达。结果:LPS能够明显诱导小鼠 RAW264. 7 细胞 IL-6、TNF-α
产生，岩白菜素 3 个浓度均能抑制 LPS 诱导的 IL-6、TNF-α 产生，呈现剂量依赖性;小鼠 RAW264. 7 细胞株产生的
NF-κB p65 表达可以被 LPS诱导显著增加，岩白菜素 3 个浓度均能抑制 LPS诱导产生的 NF-κB p65 表达。结论:岩
白菜素预处理通过抑制 NF-κB活化，进而减少炎性细胞因子 IL-6、TNF-α 的生成发挥抗炎作用。
关键词 岩白菜素;脂多糖;细胞培养;白细胞介素-6;肿瘤坏死因子-α;细胞核因子-κB
中图分类号:R285. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2012)10-1660-03
收稿日期:2012-07-11
基金项目:国家自然科学基金(30972917) ;广东省自然科学基金(8451008901000788) ;广东省医学科研基金(A2009163)
作者简介:沈映冰(1964-) ，女，主管药师，主要从事医院药学工作;Tel:13640622012，E-mail:syb1964@ yeah. net。
* 通讯作者:陈杰，Tel:020-87755766-8812，E-mail:chenjiezs@ 163. com。
岩白菜素(bergenin) ，又称矮茶素、岩白菜内脂
及佛手配质等，广泛存在于虎耳草科植物岩白菜
(厚叶岩白菜)和紫金牛科植物百两金根、茎、叶中。
岩白菜素具有镇咳祛痰〔1〕、抗氧化〔2〕、免疫增强〔3〕
等多方面的药理作用，近年来研究报道岩白菜素对
醋酸引起的小鼠扭体反应有明显的抑制作用，对甲
醛致痛反应也有良好的抑制作用，且对二甲苯引起
的小鼠耳肿胀有良好的抑制作用，对纽扣致小鼠肉
芽肿也有明显的抑制作用，提示其具有较强抑制炎
症作用〔4〕。为进一步研究其药理作用机制，本实验
拟用脂多糖(LPS)刺激 RAW264. 7 细胞，探讨岩白
菜素的对炎症因子 IL-6、TNF-α及 NF-κB的影响。
1 材料
1. 1 细胞株 小鼠 RAW264. 7 细胞株(小鼠单核 /
巨噬细胞系)购自中国科学院上海细胞研究所。
1. 2 药物与试剂 岩白菜素 (中国药品生物制品
检定所，纯度为 98%，批号 111532-201005) ;LPS
(美国 Sigma公司，批号 DH183-1) ;胎牛血清、RPMI-
1640 培养基(GIBCO BRL 公司，批号 20100126，批
号 C11995) ;噻唑蓝(MTT，Amresco 公司，批号
20110228) ;IL-6、TNF-α 的 ELISA(深圳晶美生物有
限公司，批号 101108，批号 101008) ;NF-κB p65 抗
小鼠单克隆抗体、GAPDH 辣根过氧化酶羊抗小鼠
IgG抗体(二抗) (Santa Cruz 公司，批号 sc-166748，
·0661· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 35 卷第 10 期 2012 年 10 月
DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2012.10.040
批号 sc-137179) ;细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试
剂盒(碧云天生物技术研究所，批号 20110520) ;其
他试剂均为分析纯。
2 方法
2. 1 细胞培养 RAW264. 7 细胞在含有 10%胎牛
血清的 RPMI-1640 培养基培养，培养条件为:37 ℃、
5%CO2 和 95%湿度。细胞生长至 70% ～ 80%融合
后进行传代，传代培养 3 代，取对数生长期细胞用于
实验。
2. 2 岩白菜素药物配制 岩白菜素 3. 28 mg 溶于
1 mL DMSO，得到浓度为 10 mmol /L 的母液。取对
数期生长的细胞以 1 × 105 /孔接种于 96 孔板，细胞
贴壁后，通过噻唑蓝(MTT)实验进行检测岩白菜素
对 RAW264. 7 细胞的细胞毒反应，选用没有细胞毒
的浓度范围 0. 5 ～ 80 μmol /L用于实验。
2. 3 实验分组 将对数生长期的 RAW264. 7 细胞
分别按 1 × 105 /mL及 5 × 105 /mL 接种于 96 孔培养
板或 6 孔培养板中，随机分 6 组:空白对照组;DMSO
组(DMSO浓度≤0. 1%) ;模型组(加入终浓度为 10
μg /mL的 LPS) ;岩白菜素低、中、高剂量组(0. 5、5、
50 μmol /L不同药物浓度加入孵育 2 h后，再加入终
浓度为 10 μg /mL的 LPS) ，继续培养 8 h，进行下一
步实验。
2. 4 岩白菜素对 LPS诱导小鼠 RAW264. 7 细胞株
的 IL-6 和 TNF-α 产物的作用 RAW264. 7 细胞分
别按 1 × 105 /mL 接种于 96 孔培养板，进行上述实
验，实验结束后，按 ELISA 试剂盒说明书测定 IL-6、
TNF-α含量，Thermo Multiskan MK3 型酶联免疫检测
仪于 450 nm处测定充密度值，根据标准曲线，求出
IL-6 和 TNF-α的分泌量。每组 8 个复孔，试验重复
3 次。
2. 5 岩白菜素对 LPS诱导小鼠 RAW264. 7 细胞株
的 NF-κB p65 表达的影响 将对数生长期的
RAW264. 7 细胞分别按 5 × 105 /mL接种于 6 孔培养
板中，进行上述实验，实验结束后，用预冷的 PBS 洗
涤各组细胞，按细胞核蛋白抽提试剂盒提取核蛋白，
按 Lowrry 法进行蛋白定量。以 50 μg 蛋白样品上
样，8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至硝酸纤维膜
上。电转后的硝酸纤维膜用含 1% 脱脂奶粉封闭液
封闭，4 ℃，过夜。再取 NF-κB p65 或 GAPDH 一抗
(效价 1∶ 2 000)与膜孵育 2 h，洗膜后再与辣根过氧
化酶羊抗小鼠二抗(效价 1∶ 2 000)孵育 1 h，用增强
化学发光试剂进行显色及摄片处理，GDS-8000 UVP
成像仪成像，用 LAB WOEK45 软件分析条带灰度，
重复实验 3 次。
2. 6 统计学处理 实验数据均以 珋x ± s 表示，并根
据资料性质分别进行方差分析及组间 t 检验，P ＜
0. 05 为有显著性差异。
3 结果
3. 1 岩白菜素对 LPS诱导小鼠 RAW264. 7 细胞的
IL-6 和 TNF-α的作用 DMSO 组与空白对照组比，
对 IL-6 和 TNF-α无统计学差异，而小鼠 RAW264. 7
细胞株分泌的 IL-6 和 TNF-α 均可被 LPS 诱导显著
增加，与空白组比有显著差异(P ＜ 0. 01)。与模型
组比较，岩白菜素 0. 5、5、50 μmol /L 均能抑制 LPS
诱导产生的 IL-6 和 TNF-α，呈现剂量依赖性(P ＜
0. 01)。见表 1。
表 1 岩白菜素对 LPS诱导 RAW264. 7 细胞
产生的 IL-6 和 TNF-α影响(珔x ± s，n =8)
组别 剂量
/
(μmol /L)
IL-6 /
(ng /mL)
TNF-α /
(ng /L)
空白对照组 － 10. 23 ± 2. 29 29. 78 ± 5. 56
DMSO组 － 10. 41 ± 3. 32 31. 23 ± 5. 62
LPS模型组 － 213. 24 ± 40. 67* 398. 08 ± 18. 75*
岩白菜素低剂量组 0. 5 165. 05 ± 31. 45▲ 331. 73 ± 15. 99▲
岩白菜素中剂量组 5 120. 75 ± 30. 75▲ 269. 15 ± 14. 64▲
岩白菜素高剂量组 50 82. 52 ± 23. 45▲ 178. 32 ± 10. 43▲
注:与空白组比较，* P ＜ 0. 05;与模型组比较，▲P ＜ 0. 01
3. 2 岩白菜素对 LPS诱导小鼠 RAW264. 7 细胞株
的 NF-κB p65 蛋白表达水平的影响 NF-κB p65 蛋
白在空白对照组 RAW264. 7 细胞有少量基础表达，
LPS能够诱导小鼠 RAW264. 7 细胞株产生的 NF-κB
p65 蛋白表达，与空白对照组比较有显著性差异(P
＜ 0. 01) ，岩白菜素 0. 5、5、50 μmol /L均能抑制 LPS
诱导产生的 NF-κB p65 蛋白表达，与模型组比较有
显著性差异(P ＜ 0. 01)。见图 1。
图 1 岩白菜素对 LPS 诱导小鼠 RAW264. 7 细胞株
的 COX-2 蛋白表达水平的影响(珔x ± s，n =3)
注:与空白对照组比较，* P ＜ 0. 01;与模型组比较，#P ＜ 0. 01
·1661·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 35 卷第 10 期 2012 年 10 月
4 讨论
炎症反应是一个复杂的病理生理过程，其中巨
噬细胞是体内重要的免疫效应和炎性细胞，在诱导
炎症反应中起着重要的作用〔5〕，对 LPS 介导的炎症
过程研究发现，其炎症反应表现为脂多糖能够通过
诱导巨噬细胞膜 Toll样受体 4 (Toll-like receptors 4，
TLR4) ，进而通过 MAPK信号转导通路，来启动核转
录因子 NF-κB和 AP-1 的表达，激活炎症介质 IL-6、
TNF-α和 NO 的大量释放〔6，7〕，增强和放大炎症反
应，从而引起全身炎症反应综合征和多器官功能障
碍综合征等疾病。参与炎症反应小鼠 RAW264. 7
细胞系是来源于小鼠腹腔中经永生化的巨噬细胞
株，可以进行稳定的传代培养，是研究炎症反应良好
的模型。本研究结果发现，岩白菜素剂量依赖性抑
制 RAW264. 7 细胞炎性细胞因子 IL-6、TNF-α 的释
放，提示岩白菜素抗炎效应与抑制炎性细胞因子产
生有关。
LPS触发炎症反应内部存在一系列复杂的级联
反应，NF-κB在其中起中心作用。NF-κB 活化被认
为是巨噬细胞受 LPS 刺激后激活转录因子 NF-κB
与抑制蛋白 IκB 结合形成复合体，IκB 被磷酸化，释
放出有活性的 p50 /p65 二聚体，二聚体进入细胞核
从而调节特异基因的转录诱导 TNF-α和 NO表达的
重要机制〔8〕。通过抑制 NF-κB 信号传导通路来抑
制相应基因的表达已经成为炎症研究重点。本研究
用终浓度为 0. 5、5、50 μmol /L的岩白菜素能可显著
性抑制 NF-κB p65 蛋白的表达。提示岩白菜素可通
过抑制 LPS 诱导的 RAW264. 7 细胞 NF-κB p65 蛋
白的表达，抑制 NF-κB 的大量转位入核，进而减少
终末炎症介质的大量释放。
总之，岩白菜素预处理通过抑制 NF-κB 活化，
进而减少炎性细胞因子 IL-6、TNF-α 的生成发挥抗
炎作用。
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檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾
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111-118.
2010 年《中药材》杂志在“中国知网”发行情况:《中药材》期刊机构用户总计 3196
个，国际个人读者分布在 35 个国家和地区。
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